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문제 정의
- 이와 같이 발효 한약에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으나, 유산균을 이용한 발효 한약 및 그에 따른 성분 변화에 대한 연구는 매우 부족한 실정이다. 본 연구에서는 소청용탕을 실험 재료로 10종의 유산균을 이용하여 발효를 시킨 후 발효를 하지 않은 소청룡탕 원탕 및 10종의 유산균 발효물에 대한 성분 변화를 관찰하였다. 발효 균주로서는 Lactobacillus casei 127, L.
- plantarum 144 발효물에서 增減이 분명한 3종의 성분 중 증가한 liquilitigenin 및 cinnamyl alcohol을 분리 정제하여 구조 규명을 하였으며, 감소한 liquiritin은 표준품과 비교 분석하여 규명하였다. 이들 3종 성분을 지표성분으로 하여 HPLC/DAD system을 이용하여 소청룡탕의 발효 전 후 성분 변화를 연구 보고하는 바이다.
제안 방법
- plantarum 144 발효물로부터 2개의 증가한 peak의 분리 정제를 수행한 후 NMR, MS 등의 분광학적 분석 방법에 의해 구조를 규명하였다. 1개의 감소한 성분은 표준 물질의 tR (retention time) 및 DAD spectrum과 비교 분석하여 성분을 규명하였다.
- L. casei 144를 포함한 총 10종의 유산균을 이용하여 소청룡탕을 발효 한 후 HPLC/ DAD system을 이용하여 발효 전후 성분 변화가 뚜렷한 liquiritigenin (1), cinnamyl alcohol (2), liquiritin (3)에 대한 함량을 분석한 결과 다음과 같은 결론에 도달하였다.
- L. plantarum 144로 발효하여 얻어진 발효 소청룡탕의 건조분말 5g을 C18 flash column chromatography (100% H2O, 20%, 40%, 60%, 80%, 100% MeOH)를 실시하여 7개의 분획(F1-F7)을 나눈 후, 이 중 F5 분획(400 mg)을 60% MeOH를 유출 용매로 하여 C18 open column chromatography를 실시하여 6개의 분획으로 나누었다 (F51-F56). 이 중 F53 (50 mg) 분획을 prep HPLC (chloroform/methanol, 20:1)을 이용하여 compound 1(0.
- Liquiritigenin은 100, 25, 6.25, 1.56, 0.39 μg/mL, cinnamyl alcohol은 200, 50, 12.5, 3.13, 0.78 μg/mL, liquiritin은 110, 55, 13.75, 3.44, 0.86 μg/mL의 농도로 단계적으로 희석한 시료를 분석하여 검량선을 작성하였으며, 소청룡탕 및 발효 소청룡탕의 검액은 40㎎/mL의 농도로 조제한 후 syringe filter (PVDF, 0.45 um, non-sterile, Advantec MFS Inc., Japan)로 여과하여 분석하였다[Table 2].
- 1a)로 구성되어있다. NMR spectrum은 Varian사의 INOVA 600, INOVA 400NB NMR (Varian Co., USA), MS spectrum은 ESI-IT-TOFMS (Shimadzu Co. Japan)와 JMS-600W EI-MS (JEOL Co., Japan)를 사용하여 측정하였다. Prep HPLC는 Gilson pep HPLC (Wisconsin, USA)를 이용하여 성분을 분리 정제하였으며, 333, 334 pump, UV/VIS151 detector로 구성되어 있다.
- delbruekil subsp. lactis 442, L. casei 693, Bifidobacterium breve 744, B. thermophilum 748를 사용하였고, 10종의 발효물에 대하여 HPLC/DAD 분석 결과 성분 변화가 가장 뚜렷한 L. plantarum 144 발효물에서 增減이 분명한 3종의 성분 중 증가한 liquilitigenin 및 cinnamyl alcohol을 분리 정제하여 구조 규명을 하였으며, 감소한 liquiritin은 표준품과 비교 분석하여 규명하였다. 이들 3종 성분을 지표성분으로 하여 HPLC/DAD system을 이용하여 소청룡탕의 발효 전 후 성분 변화를 연구 보고하는 바이다.
- thermophilum 748은 Reinforced Clostridial Medium (Difco)에서 계대 배양한 뒤 초기 균수를 1×106 CFU/mL로 조절하여 inoculum으로 사용하였다. 여과한 소청룡탕의 pH를 7.0으로 조정한 후 121℃, 1.5 기압에서 15분간 가압멸균하고, 상온까지 냉각시킨 후, 유산균을 1% (v/v)로 접종하고 37℃의 항온배양기에서 48시간 동안 발효시킨 뒤 standard testing sieve로 여과하여 동결 건조하여 분석에 사용하였다. 동결건조 후 수율은 L.
- 정량 분석은 지표 성분의 면적을 검량선에 대입하여 소청룡탕 및 발효 소청룡탕에 함유되어 있는 지표 성분의 함량을 계산 하였다[Table 3].
대상 데이터
- HPLC 분석에 사용된 water 및 acetonitrile은 J.T Baker (Phillipsburg, NJ, USA)의 HPLC급 용매를 사용하였다. 지표 물질인 liquiritigenin, cinnamyl alcohol은 Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA), liquiritin은 Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
- Open column chromatography용 C18 powder는 YMC 사의 YMC*Gel ODS-A (particle size 75μm, YMC Co., Ltd., Japan)를 사용하였다.
- 발효에 사용된 10종의 유산균은 (L. casei 127, L. acidophilus 128, L. casei 129, L. plantarum 144, L. amylophilus 161, L. curvatus 166, L. delbruekil subsp. lactis 442, L. casei 693, B. breve 744, B. thermophilum 748) 한국식품연구원 (Korea Food Research Institute: KFRI, Seongnam, Korea) 식품 미생물 유전자은행에서 분양 받았다. Lactobacillus spp.
- (Osaka, Japan)에서 각각 구입하여 사용하였다. 분석에 사용한 HPLC system은 Elite Lachrom HPLC/DAD system (Hitachi High-Technologies Co., Tokyo, Japan)을 사용하였으며 L-2130 pump, L-2200 auto-sampler, L-2350 column oven, L-2455 diode array UV/VIS detector, EZchrom Elite software (version 3.3.1a)로 구성되어있다. NMR spectrum은 Varian사의 INOVA 600, INOVA 400NB NMR (Varian Co.
- plantarum 144로 발효하여 얻어진 발효 소청룡탕의 건조분말 5g을 C18 flash column chromatography (100% H2O, 20%, 40%, 60%, 80%, 100% MeOH)를 실시하여 7개의 분획(F1-F7)을 나눈 후, 이 중 F5 분획(400 mg)을 60% MeOH를 유출 용매로 하여 C18 open column chromatography를 실시하여 6개의 분획으로 나누었다 (F51-F56). 이 중 F53 (50 mg) 분획을 prep HPLC (chloroform/methanol, 20:1)을 이용하여 compound 1(0.7mg)을 얻었고, F6 분획(500 mg)에서는 sephadex LH-20 (methylene chloride/methanol, 1:1) 및 prep HPLC (n-hexane/EtOAc, 7:1)를 실시하여 compound 2 (5.0 mg)을 획득하였다.
- 소청룡탕(CY)의 한약재 구성은 麻黃 (Ephedra sinica), 桂枝 (Cinnamomum cassia), 乾薑 (Zingiber officinale), 白芍藥 (Paeonia lactiflora), 半夏 (Pinellia ternata), 細辛 (Asiasarum sieboldi), 五味子 (Schisandra chinensis), 甘草 (Glycyrrhiza glabra)이다. 이들 한약재는 영천 약업사 (Gyeongbuk Yeongcheon, Korea)에서 구입하였으며 대한약전에 기술된 각각의 약재 항목에 적합한 것을 엄선하여 사용하였고 전탕 추출법 (초고속 진공 저온 약탕기, model : cosmos-600, KyungSeo Machine Co., Incheon, Korea)에 의해 소청룡탕을 조제하였으며, 이들 한약재를 24945 ㎖의 증류수에 넣어 115℃에서 3시간 동안 열탕 추출한 후, standard testing sieve (150 ㎛, Retsch Co., Germany)를 이용하여 탕액을 여과하였다.
- T Baker (Phillipsburg, NJ, USA)의 HPLC급 용매를 사용하였다. 지표 물질인 liquiritigenin, cinnamyl alcohol은 Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA), liquiritin은 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (Osaka, Japan)에서 각각 구입하여 사용하였다. 분석에 사용한 HPLC system은 Elite Lachrom HPLC/DAD system (Hitachi High-Technologies Co.
- Injection volum은 10 μL를 주입 하였다. 파장은 지표 성분의 최대 흡수 파장에 따라 cinnamyl alcohol (1) 은 250, liquiritin (2) 및 liquiritigenin (3)은 276nm에서 분석하였다[Fig. 1].
성능/효과
- 일반적으로, 발효 과정 중에는 배당체의 가수 분해로 인해 상대적으로 생리 활성이 우수하다고 알려진 aglycone의 함량이 증가하는 것으로 알려져 있다14). 10종의 소청룡탕 유산균 발효물에서 liquiritin (3)의 함량 감소와 이들 배당체의 aglycone인 liquiritigenin (1)의 함량 증가는 발효 중 배당체 성분이 가수 분해되어 aglycone으로 전환된다는 사실을 뒷받침한다. 발효 후 cinnamyl alcohol (2)의 증가에 대한 mechanism은 아직 규명되지 않았으나, 구성 약재인 육계에 함유된 cinnamyl alcohol의 여러 미량 유사체들이 발효 중 화학 변화를 일으켜 cinnamyl alcohol로 전환됐을 것으로 추측된다.
- 발효 후 cinnamyl alcohol (2)의 증가에 대한 mechanism은 아직 규명되지 않았으나, 구성 약재인 육계에 함유된 cinnamyl alcohol의 여러 미량 유사체들이 발효 중 화학 변화를 일으켜 cinnamyl alcohol로 전환됐을 것으로 추측된다. 10종의 유산균주로 발효된 소청룡탕의 성분 변화를 발효 전과 비교 분석한 결과 L. plantarum 144 및 L. amylophilus 161 발효물이 다른 8종의 발효물에 비하여 가장 뚜렷한 성분 변화를 나타내어 전체 10종의 유산 균주 중 발효 효과가 가장 우수한 것으로 사료된다. 발효 후 증가한 liquiritigenin (1)은 뇌신경 보호작용15), 항균16) 효과 등의 생리 활성이 알려져 있으며, cinnamyl alcohol (2)은 항염증17) 효과가 알려져 있다.
- 2. L. plantarum 144, L. amylophilus 161의 균주로 발효 한 소청룡탕 발효물은 전체 10종 균주 중에서 liquiritigenin (1), cinnamyl alcohol (2)의 함량이 가장 높았으며, liquiritin (3) 분해능이 가장 우수하였다.
- 3. L. casei 127 및 L. casei 693를 이용하여 발효한 소청룡탕은 전체 발효물중 liquiritigenin (1) 및 cinnamyl alcohol (2)의 함량이 가장 낮았고, liquiritin (3) 또한 가장 낮은 분해능을 나타내었다.
- 4. 소청룡탕 구성 약재 중 이들 성분의 기원 약재로는 liquiritigenin (1) 및 liquiritin (3)은 甘草 (G. glabra), cinnamyl alcohol (2)는 肉桂 (C. cassia)로부터 유래됐을 것으로 추정 된다.
- CY를 발효하기 전 cinnamyl alcohol의 함량은 16.90±1.11 μg/mL 이었으며, 발효에 따라 전체 10종의 소청룡탕 발효물에서 cinnamyl alcohol의 함량이 증가하였으며 L. plantarum 144, L. amylophilus 161 발효물이 각각 92.93±3.83 μg/mL, 89.08±0.99 μg/mL로 발효물중 가장 높은 함량을 나타내었다.
- CY의 발효 전 liquiritigenin의 함량은 2.91±0.18 μg/mL이었으나 발효 후에는 10종의 발효 균주물 전체에서 함량이 증가하였으며, L. plantarum 144, L. amylophilus 161 발효물이 각각 29.52±0.69 μg/mL, 30.55±0.19μg/mL로 발효물 중 가장 높은 함량을 나타내었으며, L. casei 693 발효물은 4.63±0.16 μg/mL로 가장 낮은 함량을 나타내었다[Fig. 3, Table 3].
- CY의 발효 전 liquiritin의 함량은 93.66±0.63 μg/mL 이었으나 발효에 따라 전체 10종의 소청룡탕 발효물에서 liquiritin의 함량이 감소하였으며, L. plantarum 144, L. amylophilus 161 발효물이 발효전과 비교하여 각각 3.09±0.26 μg/mL, 1.24±0.00 μg/mL로 발효 균주 중 가장 높은 분해능을 나타내었다.
- L. casei 127 발효물은 58.96±1.07 μg/mL로 10종의 소청룡탕 발효물 중 가장 낮은 함량을 나타내었다[Table 3].
- L. casei 693발효물은 79.03±3.86 μg/mL로 발효 균주 중 가장 낮은 분해능을 나타내었다[Table 3].
- delbruekil subsp. lactis 442, L. casei 693, B. breve 744, B. thermophilum 748 등 10종의 유산균을 이용한 발효 소청룡탕에서 전체적으로 liquiritigenin (1), cinnamyl alcohol (2)의 함량은 증가한 반면 liquiritin (3)의 함량은 감소하였다.
- 발효 후 성분 변화가 가장 뚜렷한 L. plantarum 144소청룡탕 발효물 5g으로부터 증가한 2종의 성분을 분리정제하였으며 1H-, 13C- NMR , MS 및 기존 문헌과12,13) 비교하여 compound 1, 2에 대하여 각각 liquiritigenin (1), cinnamyl alcohol (2)로 구조를 규명하였으며, 1종의 감소한 성분은 표준 물질의 HPLC tR (retention time) 및 DAD spectrum을 비교 분석 한 결과 liquiritin (3)으로 규명되었다[Fig. 2].
- 소청룡탕 원탕과 10종의 소청룡탕 유산균 발효물을 HPLC/DAD system을 이용하여 비교 분석한 결과 10종의 발효물에서 2개의 증가한 peak와 1개의 감소한 peak가 관찰되었으며, 10종 발효물 중 가장 뚜렷한 변화를 보인 L. plantarum 144 발효물로부터 2개의 증가한 peak의 분리 정제를 수행한 후 NMR, MS 등의 분광학적 분석 방법에 의해 구조를 규명하였다. 1개의 감소한 성분은 표준 물질의 tR (retention time) 및 DAD spectrum과 비교 분석하여 성분을 규명하였다.
- 이상의 결과로 미루어 발효시 발효 균주에 따라 소청룡탕의 성분을 변화 시키는 정도가 다르게 나타날 수 있음을 알 수 있었다. 일반적으로, 발효 과정 중에는 배당체의 가수 분해로 인해 상대적으로 생리 활성이 우수하다고 알려진 aglycone의 함량이 증가하는 것으로 알려져 있다14).
후속연구
- 발효 후 증가한 liquiritigenin (1)은 뇌신경 보호작용15), 항균16) 효과 등의 생리 활성이 알려져 있으며, cinnamyl alcohol (2)은 항염증17) 효과가 알려져 있다. 따라서 본 연구를 통해 소청룡탕의 발효후 성분 변화는 발효 소청룡탕의 효능 강화에 기여 할것으로 사료되며, 발효 소청룡탕 제조시 품질 관리에 있어서 유용한 자료가 될 것으로 사료된다.
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