Objectives : Gamisoyo-san complex prescription were made with Angelicae Gigantis Radix, Paeoniae Radix, Atractylodes rhizome white, Hoelen, Bupleuri Radix, Moutan Cortex Radicis, Gardeniae Fructus, Zingiberis Rhizoma Crudus, Menthae Herba. The purpose of this study was to research the whitening effe...
Objectives : Gamisoyo-san complex prescription were made with Angelicae Gigantis Radix, Paeoniae Radix, Atractylodes rhizome white, Hoelen, Bupleuri Radix, Moutan Cortex Radicis, Gardeniae Fructus, Zingiberis Rhizoma Crudus, Menthae Herba. The purpose of this study was to research the whitening effect of the extract from Gamisoyo-san, which is one of the used herbal complex prescription. Methods : This study investigated inhibitory effect of Gamisoyo-san in tyrosinase activity. Cell viability were performed using the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) assay. Then, Gamisoyo-san measured reversed-transcription-PCR for mRNA expression using B16F10 mouse melanoma cells. Results : For whitening effects, the tyrosinase inhibition effect of extract was shown to 52.4% at $5,000{\mu}g/m{\ell}$ concentration. The cell viability on B16F10 melanoma cells of Gamisoyo-san extract showed higher than 75% at $1,000{\mu}g/m{\ell}$ concentration. In this study, an experiment was performed by setting the non-toxic concentration range of 50, 150, $250{\mu}g/m{\ell}$. The Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) was used as a positive control. The microphthalmia-associated transcription factor (MITF), tyrosinase related protein-1 (TRP-1), tyrosinase related protein-2 (TRP-2), tyrosinase mRNA expression inhibitory by reverse transcription-PCR of Gamisoyo-san extract were decreased by 95.3%, 98.8%, 96.3% and 49.5% at $250{\mu}g/m{\ell}$ which the highest concentration. Conclusions : All these findings could verify that whitening effects of Gamisoyo-san extract by tyrosinase inhibitory activity and mRNA expression. The Gamisoyo-san could be used as material for functional cosmetics, such as skin whitening products.
Objectives : Gamisoyo-san complex prescription were made with Angelicae Gigantis Radix, Paeoniae Radix, Atractylodes rhizome white, Hoelen, Bupleuri Radix, Moutan Cortex Radicis, Gardeniae Fructus, Zingiberis Rhizoma Crudus, Menthae Herba. The purpose of this study was to research the whitening effect of the extract from Gamisoyo-san, which is one of the used herbal complex prescription. Methods : This study investigated inhibitory effect of Gamisoyo-san in tyrosinase activity. Cell viability were performed using the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) assay. Then, Gamisoyo-san measured reversed-transcription-PCR for mRNA expression using B16F10 mouse melanoma cells. Results : For whitening effects, the tyrosinase inhibition effect of extract was shown to 52.4% at $5,000{\mu}g/m{\ell}$ concentration. The cell viability on B16F10 melanoma cells of Gamisoyo-san extract showed higher than 75% at $1,000{\mu}g/m{\ell}$ concentration. In this study, an experiment was performed by setting the non-toxic concentration range of 50, 150, $250{\mu}g/m{\ell}$. The Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) was used as a positive control. The microphthalmia-associated transcription factor (MITF), tyrosinase related protein-1 (TRP-1), tyrosinase related protein-2 (TRP-2), tyrosinase mRNA expression inhibitory by reverse transcription-PCR of Gamisoyo-san extract were decreased by 95.3%, 98.8%, 96.3% and 49.5% at $250{\mu}g/m{\ell}$ which the highest concentration. Conclusions : All these findings could verify that whitening effects of Gamisoyo-san extract by tyrosinase inhibitory activity and mRNA expression. The Gamisoyo-san could be used as material for functional cosmetics, such as skin whitening products.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 각각의 특성을 가진 한방복합처방인 가미소요산의 tyrosinase 저해활성 및 melanoma cells (B16F10)을 이용한 미백인자 MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase의 mRNA 발현억제 효과를 확인하여 미백용 화장품 소재로서의 활용 가능성을 알아보았다.
MITF는 micorophthalmia transcription fator로 tyrosinase 발현을 조절하는 역할을 한다34). 본 연구는 melanin 생성에 관여하는 유전자들의 영향을 평가하기 위해서 PCR을 이용하여 평가하였다. 멜라닌생성의 관련 유전자 중 MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase를 사용하여 50, 150, 250 ㎍/㎖ 농도로 진행하였을 때 최고농도에서는 각각 95.
본 연구에서는 가미소요산이 melanin 합성에 관계된 유전자들에게 미치는 영향을 확인하기 위해서 MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase가 mRNA 발현에 미치는 영향을 측정하였다. B16F10 melanoma cells에 50, 150, 250 ㎍/㎖의 샘플을 농도별로 처리한 후 24시간 뒤에 PCR으로 mRNA 발현량을 측정하였다.
최근 천연 한방소재를 이용한 한방화장품 개발이 증가하고 있는 실정이며, 본 연구에서는 가미소요산 대해 연구하여 미백화장품 기능성 소재로서의 가능성을 검토하였다.
제안 방법
2. MTT assay 를 통한 세포 독성을 확인해 보았을 때 1,000 ㎍/㎖에서 75%의 높은 세포생존율을 확인 하여 본 연구에서는 독성이 없는 농도 구간인 50, 150, 250㎍/㎖로 설정하여 실험을 진행하였다.
본 연구에서는 가미소요산이 melanin 합성에 관계된 유전자들에게 미치는 영향을 확인하기 위해서 MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase가 mRNA 발현에 미치는 영향을 측정하였다. B16F10 melanoma cells에 50, 150, 250 ㎍/㎖의 샘플을 농도별로 처리한 후 24시간 뒤에 PCR으로 mRNA 발현량을 측정하였다. 이때 세포의 여러 조건에서도 그 발현 정도의 차이가 거의 없는 house keeping gene인 GAPDH를 positive control로 사용하였다.
다시 13,200 rpm에서 20분간 원심분리 하였고, 그 상층액을 제거 한 후 75% EtOH-diethylpyrocarbonate water를 각 튜브에 1 ㎖씩 분주하여 13,200 rpm에서 5분간 원심분리 한 뒤 상층액을 제거한 뒤 실온에서 건조시켰다. DEPC를 50 ㎕씩 분주하여 녹인 후 96 well plate에 RNA 5 ㎕와 멸균수 195 ㎕ 를 첨가하여 260 nm, 280 nm에서 각각 흡광도를 측정하여 total RNA양을 측정하였다. Oligo (dT) 15 primer (500 ㎕/㎖) 1 ㎕, 추출한 RNA (2 ㎍)와 nuclease free water로 10㎕를 맞추고 75℃에서 5분간 반응시킨 후 5X reaction buffer, MgCl2, PCR necleotide mix, rnasin inhibitor, reverse transcriptase, nuclease free water를 첨가하여 25℃에서 5분, 42℃에서 60분, 70℃에서 15분간 반응시켜 cDNA를 합성시켰다.
PCR tube에 Go Flexi DNA polymerase, primer, 합성한 cDNA를 첨가하여 잘 섞은 후 PCR을 실행하였다. Glyceraldehyde -3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)는 94℃에서 30초, 55℃에서 45초, 72℃에서 45초(35 cycles), tyrosinase는 94℃에서 30초, 60℃에서 45초, 72℃ 45초(40 cycles), TRP-1, TRP-2, MITF는 94℃에서 30초, 58℃에서 45초, 72℃에서 45초(40 cycles)을 하였으며, PCR로 합성 시킨 후 0.002% ethidium bromide를 첨가한 1.5% agarose gel에 100 V에서 40분간 전기영동 후 LAS 4,000을 이용하여 밴드를 확인하여 분석 정량하였다.
실험에 사용한 primer sequences는 Table 2와 같다. PCR tube에 Go Flexi DNA polymerase, primer, 합성한 cDNA를 첨가하여 잘 섞은 후 PCR을 실행하였다. Glyceraldehyde -3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)는 94℃에서 30초, 55℃에서 45초, 72℃에서 45초(35 cycles), tyrosinase는 94℃에서 30초, 60℃에서 45초, 72℃ 45초(40 cycles), TRP-1, TRP-2, MITF는 94℃에서 30초, 58℃에서 45초, 72℃에서 45초(40 cycles)을 하였으며, PCR로 합성 시킨 후 0.
가미소요산(加味逍遙散)은 대전대학교 부속 한방병원에서 구입 정선하여 사용하였으며, 구성약재는 Table 1과 같다. 당귀 6 g, 백작약 6 g, 백출 6 g, 백복령 6 g, 시호 6 g, 목단피 4 g, 치자 4 g, 감초 3 g, 생강 2 g, 박하 2 g 을 혼합하여 준비하고 가미소요산 100 g에 증류수 2,000 ㎖를 가하여 열탕 추출기에서 2시간 추출하여 얻은 액을 흡입 여과하고 동결건조한 후 냉동 보관(-84℃)하면서 적당한 농도로 희석하여 사용하였다.
2). 따라서 미백관련 신호전달인자의 측정은 80% 이상의 세포 생존율을 보이는 농도인 250 ㎍/㎖ 이하로 설정하여 실험을 실시하였다.
B16F10 melanoma cells에 50, 150, 250 ㎍/㎖의 샘플을 농도별로 처리한 후 24시간 뒤에 PCR으로 mRNA 발현량을 측정하였다. 이때 세포의 여러 조건에서도 그 발현 정도의 차이가 거의 없는 house keeping gene인 GAPDH를 positive control로 사용하였다. 가미소요산은 50, 150, 250 ㎍/㎖을 농도별로 처리한 B16F10군에서는 각 인자의 mRNA발현이 가미소요산을 처리하지 않은 군보다 감소하는 것을 확인할 수 있었으며, mRNA 발현이 비교군인 kojic acid보다 각각의 인자들 모두 감소한 것을 확인할 수 있었다(Fig.
대상 데이터
Tyrosinase mushroom, dimethyl sulfoxide (DMSO), L-3,4-dihydroxy-phenyl-alanine (L-DOPA) 등은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO)에서 구입하였다. Tyrosinase, tyrosinase-related protein-1 (TRP-1), tyrosinase-related protein-2 (TRP-2), GAPDH, primary antibody와 mouse-anti-goat, rabbit-anti-mouse 등 secondary antibody는 Santacruz(CA, U.
가미소요산(加味逍遙散)은 대전대학교 부속 한방병원에서 구입 정선하여 사용하였으며, 구성약재는 Table 1과 같다. 당귀 6 g, 백작약 6 g, 백출 6 g, 백복령 6 g, 시호 6 g, 목단피 4 g, 치자 4 g, 감초 3 g, 생강 2 g, 박하 2 g 을 혼합하여 준비하고 가미소요산 100 g에 증류수 2,000 ㎖를 가하여 열탕 추출기에서 2시간 추출하여 얻은 액을 흡입 여과하고 동결건조한 후 냉동 보관(-84℃)하면서 적당한 농도로 희석하여 사용하였다.
세포 배양은 10% fetal bovine serum (FBS)과 1% penicillin /streptomycin (100 U/㎖)을 첨가한 Dulbeco's modified eagle's medium (DMEM) 배지를 사용하였으며, 37℃, 5% CO2 incubator 에 적응시켜 계대 배양하였다.
세포 생존율 측정을 위해 마우스 흑색종인 B16F10 melanoma cells를 ATCC에서 구입하였고, 세포 배양을 위해 Dulbecco's modified eagle medium (DMEM), fetalbovine serum (FBS), phosphate buffered saline (PBS), penicillin/streptomycin, trypsin는 Thermo Scientific Hyclone (U.S.A) 및 GibcoBRL Co. (GrandIsland, U.S.A)에서 구입하여 사용하였다.
세포독성을 알아보기 위한 시약 3-[4,5-dimethyl-thiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazoli umbromide (MTT)는 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, U.S.A)에서 구입하였다.
실험에 사용된 기기는 rotary vacuum evaporator (EYELA, Japan), centrifuge (Hanil Science IndustrialCo. Korea), freeze drier (ILShin BioBase Co. Korea), microscope (Olympus, Japan), CO2 incubator (Vision Scientific, Korea), vortex (Scientific Industries, INC, U.S.A), autoclave (JS Research Inc, Korea), ELISA reader (Tecan, Austria), PCR (C-100, Bio-Rad, U.S.A), ImageQuant LAS 4000 (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Sweden)을 사용하였다.
데이터처리
모든 실험은 3회 반복으로 행하여 평균치와 표준편차로 나타내었고, 결과 통계처리는 SPSS10.0 (Evanston, IL, USA) software를 사용하였으며, 유의차 검증은 분산분석 (analysis of variance ANOVA)을 한 후 α=0.05 수준에서 Turkey's HSD test에 의해 유의성을 분석하였다.
이론/모형
Tyrosinase 저해활성 측정은 Yagi 등의 방법22)에 따라 측정하였다. 반응군는 67 mM sodium phosphate buffer (pH 6.
미백인자인 microphthalmia-associated transcription factor (MITF), tyrosinase related protein-1 (TRP-1), tyrosinase related protein-2 (TRP-2), tyrosinase의 mRNA 발현을 알아보기 위하여 polymerase chain reaction (PCR)을 실시하였다. 실험에 사용한 primer sequences는 Table 2와 같다.
세포 생존율 측정은 Carmichael의 방법23)에 따라 측정하였다. 멜라노마 세포(B16F10)를 96 well plate에 1 × 105 cells/well이 되게 0.
성능/효과
1. Tyrosinase 저해활성 측정 결과 가미소요산이 최고농도에서 52.4%의 저해활성을 나타내었으며, 이는 가미소요산의 구성약재들 중 서론에서 거론된 감초, 치자, 목단피 추출물의 효능을 토대로 그에 따른 영향이 있었을 것으로 사료된다.
3. B16F10 세포를 이용해 MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase 각각의 효소들이 대조군인 kojic acid에 비해 mRNA 발현을 억제시키는 것을 확인할 수 있었다.
. B16F10 melanoma cells로 세포 생존율을 MTT assay로 측정한 결과 1,000 ㎍/㎖에서 75% 이상의 높은 세포 생존율을 나타내어 미백관련 신호전달인자의 측정 실험을 250 ㎍/㎖이하에서 실시하였다.
멜라닌은 피부, 눈동자, 머리카락의 색을 결정하는데 있어서 중요한 역할을 한다24). 가미소요산 복합처방의 tyrosinase 저해활성을 측정한 결과, 가미소요산 복합처방의 tyrosinase 저해활성은 5,000 ㎍/㎖에서 52.4%의 저해활성을 나타내었으며, 이는 Hwang25) 등 홍화자, 형개, 향부자 에탄올 추출물 1,000 ㎍/㎖에서 각각 27%, 23%, 6%의 저해활성을 나타낸다는 결과와 Son26) 등 도화의 물, 에탄올 추출물의 tyrosinase 저해 활성을 측정한 결과 10,000 ㎍/㎖의 농도에서 40%, 32%,의 저해율을 나타내었고, Kim27) 등 일반 더덕, 중숙 더덕, 초고압 복합 처리 중숙 더덕 추출물은 1,000 ㎍/㎖에서 각각 7.18%, 15.7%, 25.08%인 것으로 비교해 보았을 때 가미소요산의 tyrosinase 저해효과가 유의한 결과를 나타냄을 확인할 수 있었다(Fig. 1).
이때 세포의 여러 조건에서도 그 발현 정도의 차이가 거의 없는 house keeping gene인 GAPDH를 positive control로 사용하였다. 가미소요산은 50, 150, 250 ㎍/㎖을 농도별로 처리한 B16F10군에서는 각 인자의 mRNA발현이 가미소요산을 처리하지 않은 군보다 감소하는 것을 확인할 수 있었으며, mRNA 발현이 비교군인 kojic acid보다 각각의 인자들 모두 감소한 것을 확인할 수 있었다(Fig. 3). Oh4) 등 백강잠의 연구를 보면 TRP-1, MITF에서 대조군에 비해 유의성있게 억제하였으나 부분 농도에서만 활성을 나타낸 결과와 비교했을 때, 가미소요산은 피부 미백 소재로서 가능성이 있을 것으로 판단된다.
이에 따라 과잉 생성 된 melanin은 인체에 피부노화, 피부암 유발에도 관여하게 되며 기미, 주근깨를 형성하는 것으로 알려져 있다29,30). 가미소요산의 tyrosinase 활성도를 측정한 결과 최고 농도에서 52.4%의 활성도를 나타내었고 구성 약재 중 목단피, 감초, 치자의 tyrosinase 저해활성이 높은 것으로 보아 그 약재들의 영향이 큰 것으로 보인다.
가미소요산의 처방은 당귀(Angelicae Gigantis Radix, 當歸), 백작약(Paeoniae Radix, 白芍藥), 백출(Atractylodes rhizome white, 白朮), 백복령(Hoelen, 白茯苓), 시호(Bupleuri Radix, 柴胡), 목단피(Moutan Cortex Radicis, 牧丹皮), 치자(Gardeniae Fructus, 梔子), 감초(Glycyrrhizae Radix, 甘草), 생강(Zingiberis Rhizoma Crudus, 生薑), 박하(Menthae Herba, 薄荷)의 한약재로 구성되어있다. 구성된 약재들의 효능을 보면 당귀는 혈액을 보충시켜주는 보혈효과가 있으며, 혈류 개선 효과가 있어 혈액순환을 도와 노화방지, 주름개선 및 조직재생에 효과가 있는 것으로 나타났다10). 백작약은 선행 연구로부터 항균효과11) 등이 알려져 있으며 대표적 성분으로는 paeoniflorin, paeonel, paeonin 등이 있으며 그 중 paeoniflorin은 인간의 피부 조직에서 자외선에 의한 DNA 파괴 및 얼굴 부위의 주름 방지에 효과가 있다는 보고가 있다12).
본 연구는 melanin 생성에 관여하는 유전자들의 영향을 평가하기 위해서 PCR을 이용하여 평가하였다. 멜라닌생성의 관련 유전자 중 MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase를 사용하여 50, 150, 250 ㎍/㎖ 농도로 진행하였을 때 최고농도에서는 각각 95.3%, 98.8%, 96.3%, 49.5%의 발현량을 나타내었고 각 인자들은 대조군인 kojic acid에 비하여 mRNA 단백질 발현이 더 감소한 것을 확인할 수 있었다. 따라서 가미소요산은 미백개선 화장품 소재로 응용이 가능할 것으로 보이며, 차후 화장품 소재로 이용 시제형에 따른 안정성 연구가 진행된다면 우수한 기능성 천연소재로서의 개발이 가능할 것으로 보인다.
이상의 in vitro 생리활성 검증 결과 가미소요산 복합처방이 그 구성약재 중 몇몇 약재에 대한 영향력이 있었을 것으로 판단되며, tyrosinase 저해활성 및 melanoma cells (B16F10)를 이용한 미백 활성 측정에서도 유의한 결과를 보여 가능성이 있을 것으로 판단된다.
흑색종의 일종인 B16F10 melanoma cells을 이용하여 세포 생존율을 MTT assay로 분석한 결과, 세포의 증식과 성장을 살아있는 세포 수에 비례하여 흡광도로 나타내게 되는데 가미소요산에 의한 멜라노마 세포의 생존율을 MTT assay에 의해 확인 한 결과 1,000 ㎍/㎖의 농도에서 75% 이상의 세포 생존율을 확인할 수 있었다(Fig. 2). 따라서 미백관련 신호전달인자의 측정은 80% 이상의 세포 생존율을 보이는 농도인 250 ㎍/㎖ 이하로 설정하여 실험을 실시하였다.
후속연구
5%의 발현량을 나타내었고 각 인자들은 대조군인 kojic acid에 비하여 mRNA 단백질 발현이 더 감소한 것을 확인할 수 있었다. 따라서 가미소요산은 미백개선 화장품 소재로 응용이 가능할 것으로 보이며, 차후 화장품 소재로 이용 시제형에 따른 안정성 연구가 진행된다면 우수한 기능성 천연소재로서의 개발이 가능할 것으로 보인다.
감초는 tyrosinase 억제제로 작용해 멜라닌 합성 억제하는 효과가 코직산과 아스코르빈산보다 우수한 것으로 보고되었다20). 이와 같이 각각의 한약재들의 효능을 살펴보면 당귀, 백작약, 치자 추출물, 감초 등과 같이 피부 노화 및 미백의 효능을 가지는 한약재와 항염, 항산화 효능을 가지는 한약재들을 한방복합처방으로 만들었을 때 미백의 효과를 더욱 증진 할 수 있을 것으로 예상된다. 하지만 한의학 분야에서는 가미소요산(加味逍遙散, SYS)의 항산화21)에 관한 연구가 이루어지고 있지만 가미소요산에 대한 미백 화장품 소재개발로는 아직 연구가 미흡한 실정이다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
가미소요산이 melanin 생성에 관여하는 유전자들의 영향을 평가한 결과는 어떠했는가?
본 연구는 melanin 생성에 관여하는 유전자들의 영향을 평가하기 위해서 PCR을 이용하여 평가하였다. 멜라닌생성의 관련 유전자 중 MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase를 사용하여 50, 150, 250 ㎍/㎖ 농도로 진행하였을 때 최고농도에서는 각각 95.3%, 98.8%, 96.3%, 49.5%의 발현량을 나타내었고 각 인자들은 대조군인 kojic acid에 비하여 mRNA 단백질 발현이 더 감소한 것을 확인할 수 있었다. 따라서 가미소요산은 미백개선 화장품 소재로 응용이 가능할 것으로 보이며, 차후 화장품 소재로 이용 시 제형에 따른 안정성 연구가 진행된다면 우수한 기능성 천연소재로서의 개발이 가능 할 것으로 보인다.
치자추출물은 피부미백효과18)가 있다는 것이 보고되어 있고 생강의 매운맛 성분 중 6-gingerol은 소염, 살균효과 및 항산화 활성을 나타낸다는 연구도 있다19). 감초는 tyrosinase 억제제로 작용해 멜라닌 합성 억제하는 효과가 코직산과 아스코르빈산보다 우수한 것으로 보고되었다20). 이와 같이 각각의 한약재들의 효능을 살펴보면 당귀, 백작약, 치자 추출물, 감초 등과 같이 피부 노화 및 미백의 효능을 가지는 한약재와 항염, 항산화 효능을 가지는 한약재들을 한방복합처방으로 만들었을 때 미백의 효과를 더욱 증진 할 수 있을 것으로 예상된다.
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