Objectives : This study was performed to investigate the influence of black ginseng radix extracts (BG) and ginsenoside Rg3, Rg5 on basic fibroblast growth factor (bFGF) induced proliferation, migration and capillary tubule-like formation of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Methods :...
Objectives : This study was performed to investigate the influence of black ginseng radix extracts (BG) and ginsenoside Rg3, Rg5 on basic fibroblast growth factor (bFGF) induced proliferation, migration and capillary tubule-like formation of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Methods : HUVECs were cultured with BG and ginsenoside Rg3, Rg5 at different concentrations (60, 125, 250, 500, $1,000{\mu}g/m\ell$) for 2 day In the presence of bFGF, respectively. XTT was used to detect the proliferation. Migration and tube formations were examined to detect the antiangiogenesis. Also, the chick embryo chorioallantoic membrane (CAM) assay was performed to detect the antiangiogenesis. Results : BG and ginsenoside Rg3, Rg5 significantly inhibited bFGF-induced endothelial cell proliferation and migration in a dose-dependent manner. Tube formation in bFGF-induced HUVECs were suppressed by BG and ginsenoside Rg3, Rg5. Moreover, BG and ginsenoside Rg3, Rg5 (30-$50{\mu}g$/egg) inhibited new blood vessel formation on the growing CAM. Conclusions:Based on the present results, it can be suggested that BG has a potential chemopreventive agent via antiangiogenesis.
Objectives : This study was performed to investigate the influence of black ginseng radix extracts (BG) and ginsenoside Rg3, Rg5 on basic fibroblast growth factor (bFGF) induced proliferation, migration and capillary tubule-like formation of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Methods : HUVECs were cultured with BG and ginsenoside Rg3, Rg5 at different concentrations (60, 125, 250, 500, $1,000{\mu}g/m\ell$) for 2 day In the presence of bFGF, respectively. XTT was used to detect the proliferation. Migration and tube formations were examined to detect the antiangiogenesis. Also, the chick embryo chorioallantoic membrane (CAM) assay was performed to detect the antiangiogenesis. Results : BG and ginsenoside Rg3, Rg5 significantly inhibited bFGF-induced endothelial cell proliferation and migration in a dose-dependent manner. Tube formation in bFGF-induced HUVECs were suppressed by BG and ginsenoside Rg3, Rg5. Moreover, BG and ginsenoside Rg3, Rg5 (30-$50{\mu}g$/egg) inhibited new blood vessel formation on the growing CAM. Conclusions:Based on the present results, it can be suggested that BG has a potential chemopreventive agent via antiangiogenesis.
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문제 정의
특히 수삼이나 홍삼에는 소량 존재하지만 흑삼에 특이적으로 많이 존재하는 인삼사포닌은 Rg3 및 Rg5로 알려져 있으며 항암활성을 포함하여 다양한 활성을 나타낸다고 알려져 있다.24-26) 따라서 흑삼추출물이 HUVEC 증식억제활성을 나타내어 흑삼의 주요 성분인 Rg3와 Rg5의 HUVEC 증식억제활성을 측정하고자 하였다. Rg3 및 Rg5는 실험에 사용한 60-1,000 μg/ml 농도에서 HUVEC에 대한 세포독성을 관찰한 결과 세포독성을 나타내지 않았으며, 실험결과를 Fig.
을 나타내어 많은 관심을 받고 있는 가공인삼이다. 그러나 흑삼의 항암활성에 대한 구체적인 작용 메카니즘에 대한 연구가 미비한 상태이므로 흑삼의 신생혈관 억제활성을 관찰하고자 하였다. 앞서 설명한 바와 같이 신생혈관형성은 악성 종양의 성장과 전이에 밀접한 연관성이 있으며, 이를 바탕으로 외국의 경우에 항암제 및 여러 질환의 치료제로 이용하기 위한 혈관 신생 억제제 연구가 활발히 진행되고 있다.
즉, 125 μg/ml 농도에서부터 HUVEC의 증식을 억제하였으며 250 μg/ml 농도에서는 20%, 500 μg/ml 농도에서는 35%, 1,000 μg/ml 농도에서는 66%의 유의성 있게 HUVEC 이동 억제활성을 나타내었다. 또한 앞서 설명한 바와 같이 흑삼추출물이 HUVEC 이동 억제활성을 나타내었기 때문에 흑삼의 주요 성분인 Rg3와 Rg5의 HUVEC 이동 억제활성을 측정하고자 하였다. 실험결과를 Fig.
또한 흑삼의 주요 성분인 Rg3와 Rg5의 HUVEC tube formation 억제활성을 측정하고자 하였다. 실험결과를 Fig.
흑삼은 이미 항암활성이 있다고 알려져 있지만 구체적인 항암활성을 나타내는 작용기전에 대한 연구는 미비한 실정이다. 본 연구는 이런 흑삼의 혈관신생 억제효과를 규명하기 위하여, 혈관 내피 세포인 human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)에 흑삼 및 흑삼의 주 성분인 인삼사포닌 Rg3와 Rg5을 처치하여 proliferation assay와 migration assay, tube formation assay를 실시하였고, in vivo 실험으로 Chicken Chorioallantoic Membrane (CAM)을 이용한 assay를 시행하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
흑삼추출물 및 흑삼의 주 성분인 Rg3와 Rg5가 HUVEC의 증식억제, 이동억제 및 tube formation 억제활성을 나타냄을 관찰하여 in vivo 실험을 통해서 흑삼의 신생혈관 억제활성을 관찰하고자 하였다. 본 실험에서는 수정란의 Chicken Chorioallantoic Membrane (CAM)의 신생혈관 형성 여부를 알아보기 위해 bFGF를 처리하여 혈관형성을 유도한 후 흑삼추출물, Rg3, Rg5를 투여하였다.
제안 방법
1% gelatin이 코팅된 96-well 플레이트에 5×103으로 분주하여 24시간 배양시킨 후 5% FBS만 첨가된 M199배지로 6시간 동안 starvation 시켰다. 5% FBS, 10 ng/ml bFGF와 5 units/ml heparin이 첨가된 M199배지로 시료를 농도별로 희석하여 100 ㎕씩 첨가하여 48시간 동안 배양시켰다. PMS (sigma P-9625, 1.
1 μg/egg) containing cover slip was respectively located on CAMs of 4-5 day chicken embryos as described in material and methods. After 2 days, the number of avsacular eggs were analyzed and photographed under stereomicroscope.
기존의 전통적인 방법인 구증구포의 방법이 아닌 새로운 고온고압을 이용한 흑삼을 제조하는 방법을 이용하여 흑삼을 제조하였으며 흑삼으로부터 흑삼에 특이적으로 많이 존재하는 인삼사포닌 Rg3, Rg5를 분리하여 혈관내피세포인 HUVEC에 bFGF를 처리하여 혈관형성을 유도한 후 proliferation, migration, tube formation에 미치는 영향을 살펴보았으며, in vivo 실험으로 CAM assay를 실시하여 다음과 같은 결론을 얻었다. 흑삼추출물은 125 μg/ml 농도에서부터 HUVEC 증식 및 이동을 억제하였으며, 50 μg/ml에서 tube formation을 억제하였다.
53 mg/ml) 10 μl와 XTT (sigma X-4251, 1 mg/ml) 1 ml을 혼합하여 well당 50 ㎕를 첨가한 후 2시간 후에 microplate reader 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군을 기준으로 세포의 생존비를 계산하였다.
혈관내피세포는 증식된 후 침윤성 성장을 통해 암 조직을 향해 자라나고, 혈관내피세포들이 분화하여 최종적으로 혈관을 형성하게 된다. 따라서 혈관내피세포의 분화도에 대하여 알아보는 tube formation assay를 실시하였다. Fig.
흑삼추출물 및 흑삼의 주 성분인 Rg3와 Rg5가 HUVEC의 증식억제, 이동억제 및 tube formation 억제활성을 나타냄을 관찰하여 in vivo 실험을 통해서 흑삼의 신생혈관 억제활성을 관찰하고자 하였다. 본 실험에서는 수정란의 Chicken Chorioallantoic Membrane (CAM)의 신생혈관 형성 여부를 알아보기 위해 bFGF를 처리하여 혈관형성을 유도한 후 흑삼추출물, Rg3, Rg5를 투여하였다.
사람의 제대로부터 분리한 혈관내피세포 (HUVECs)를 0.1% gelatin이 코팅된 96-well 플레이트에 5×103으로 분주하여 24시간 배양시킨 후 5% FBS만 첨가된 M199배지로 6시간 동안 starvation 시켰다.
여기서 Thermanox coverslip은 가위로 잘라 4등분하여 clean bench의 UV 아래에서 overnight 시킨 것이다. 수정란의 유리테잎을 칼로 뜯어내고 CAM을 찾아 확인한 후, 핀셋으로 시료가 처리된 Thermanox를 뒤집어 조심스럽게 올려놓고 다시 유리테잎으로 막았다. 이때 사용하는 가위, 칼, 핀셋 등은 70% 에탄올로 소독하여 사용하고, 핀셋은 시료를 하나하나 loading할 때마다 소독하여 사용하였으며, 기타 실험기구들도 수정란이 감염되지 않도록 주의하면서 사용하였다.
PBS로 세척 후 Diff-Quick fixative로 세포를 고정시키고 Diff-Quick Sol.으로 세포를 염색한 후 Axiovert S 100 light microscope (Carl Zeiss, Inc., USA)에서 50배율로 사진을 찍어 이동된 세포의 수를 산출하였다.
9시간동안 배양 후 Diff-Quick fixative로 세포를 고정시키고 Diff-Quick Sol.으로 세포를 염색한 후 Axiovert S 100 light microscope (Carl Zeiss, Inc., USA)에서 50배율로 사진을 찍어 형성된 혈관을 관찰하였다.
이때 흰색 바탕에 뚜렷한 혈관을 관찰할 수 있었다. 주사기로 Intralipose를 주입할 때는 혈관이 다치지 않도록 주의하였으며, 관찰이 끝난 수정란을 카메라로 근접 촬영하였다.
흑삼의 bFGF에 의해서 유도된 신생혈관형성의 증식억제활성을 관찰하기 위하여 먼저 60-1,000 μg/ml 농도에서 HUVEC에 대한 세포독성을 관찰한 결과 세포독성을 나타내지 않았으며, 흑삼추출물의 bFGF에 의해서 유도된 혈관내피 세포의 증식억제활성은 Fig. 1.에 나타내었다.
대상 데이터
또한 실험에 사용한 흑삼은 충남 금산지역에서 재배한 10월경에 수확한 인삼을 구입하여 세척기로 세척한 후 본 연구자가 보고한 방법5)을 이용하여 제조하였으며, 흑삼의 주 인삼사포닌인 Rg3와 Rg5는 이미 보고한 방법19)에 준하여 분리하여 사용하였다.
실험에 사용한 시약 및 기기는 Gelatin (JUNSEI, Japan), PBS (GIBCO, USA), 96 well plate (SPL, KOREA), BSA (ameresco, USA), bFGF (Sigma, USA), heparin (Cambrex, USA), FBS (GIBCO, USA), XTT (Sigma, USA), 수정란 (풀무원), Intralipid 10% (Freseninus Kabi AB, Sweden), PMS (Phenazine methosulfate, Sigma, USA), EGM media (Cambrex, USA), EGM-2 singlequots (Cambrex, USA), Elisa reader (Mediators PhL, Diagnostics systems, USA), Polycarbonate membranes (8-μm pore, Neuro Probe, USA), boyden chamber (Neuro Probe, USA), Diff Quik solution (Sysmex, Japan), matrigel (BD Biosciences, USA), 인큐베이터(SANYO, Japan), thermanox coverslip (Nunc, USA), Image Gange V. 2.54 (Fuji, Japan), OriginPro 6.1 (OriginLab Corporation, USA), microplate reader (Molecular Devices Co. USA) 등을 사용하였다.
All data were expressed as the mean±the standard deviation, and statistical significance was analyzed using a one-way ANOVA followed by a Newman-Keuls Multiple Comparison Test.
Effect of Rg3 on bFGF-induced Migration of HUVEC All data were expressed as the mean±the standard deviation, and statistical significance was analyzed using a one-way ANOVA followed by a Newman-Keuls Multiple Comparison Test.
Effect of Rg3 on bFGF-induced Proliferation of HUVEC All data were expressed as the mean±the standard deviation, and statistical significance was analyzed using a one-way ANOVA followed by a Newman-Keuls Multiple Comparison Test.
이론/모형
Differentiation assay는 Grant등의 방법23 을 이용하여 tube가 형성되는 것을 관찰하였다. Growth factor reduced matrigel 200 μl를 24-well 플레이트에 분주하여 37℃에서 30분간 코팅하였다.
Proliferation assay는 XTT 방법21)을 이용하여 실시하였다. 사람의 제대로부터 분리한 혈관내피세포 (HUVECs)를 0.
성능/효과
또한 Rg3 (Fig. 10C, 0.1 μg/egg)를 처리하면 실험에 사용한 유정란 10개 중 7개가 억제 (70%) 되었으며, Rg5 (Fig. 10D, 0.1 μg/egg)를 처리하면 실험에 사용한 유정란 10개 중 5개가 억제 되었다 (50%).
또한 Rg5도 역시 Rg3와 마찬가지로 농도의존적으로 HUVEC 증식억제활성을 나타내었으며, 500 μg/ml 농도에서부터 유의성 있게 억제활성을 나타내어, 500 μg/ml에서는 21%, 1,000 μg/ml 농도에서는 56%의 이동 억제활성을 나타내었다.
또한 Rg5도 역시 Rg3와 마찬가지로 농도의존적으로 HUVEC 증식억제활성을 나타내었으며, 500 μg/ml 농도에서부터 유의성 있게 억제활성을 나타내어, 500 μg/ml에서는 21%, 1,000 μg/ml 농도에서는 61%의 증식억제 활성을 나타내었다 (Fig. 3.).
흑삼추출물은 125 μg/ml 농도에서부터 HUVEC 증식 및 이동을 억제하였으며, 50 μg/ml에서 tube formation을 억제하였다. 또한 흑삼에 특이적으로 많이 존재하는 인삼사포닌인 Rg3와 Rg5도 HUVEC 증식, 이동 및 tube formation을 억제하였다. 한편, in vivo 실험에서 흑삼추출물, Rg3 및 Rg5가 각각 60%, 70% 및 50%의 억제활성을 나타내었다.
본 연구에서는 흑삼의 신생혈관형성 억제활성을 규명하기 위하여 흑삼추출물을 HUVEC 에 처리하여 HUVEC 증식, 이동, tube formation 및 in vivo 실험에서 신생혈관형성에 미치는 영향을 살펴본 결과 Rg1 및 Re의 결과와는 반대로 농도의존적으로 억제활성을 나타냄을 확인하였다. 이러한 결과는 홍삼에 미량 존재하며 흑삼에 많이 존재하는 인삼사포닌 Rg3가 신생혈관 억제작용을 나타낸다는 기존의 연구결과35,36)와 일치하는 것으로서 인삼에 존재하는 사포닌의 구조에 따라서 신생혈관형성에 미치는 효과가 다르다는 것을 의미한다.
여기에 흑삼추출물(Fig. 10B, 0.1 μg/egg)을 처리하면 혈관형성이 실험에 사용한 유정란 10개 중 6개가 억제되었다 (60%).
이상의 결과로 보아 흑삼의 항암활성은 신생혈관 억제활성에 기인하는 것으로 판단된다.
즉, 125 μg/ml 농도에서부터 HUVEC의 증식을 억제하였으며 250 μg/ml 농도에서는 20%, 500 μg/ml 농도에서는 35%, 1,000 μg/ml 농도에서는 66%의 유의성 있게 HUVEC 이동 억제활성을 나타내었다.
즉, 125 μg/ml 농도에서부터 HUVEC의 증식을 억제하였으며 유의성 있게 500 μg/ml 농도에서는 58%, 1,000 μg/ml 농도에서는 67%의 증식을 억제하였다.
또한 흑삼에 특이적으로 많이 존재하는 인삼사포닌인 Rg3와 Rg5도 HUVEC 증식, 이동 및 tube formation을 억제하였다. 한편, in vivo 실험에서 흑삼추출물, Rg3 및 Rg5가 각각 60%, 70% 및 50%의 억제활성을 나타내었다.
흑삼추출물은 125 μg/ml 농도에서부터 HUVEC 증식 및 이동을 억제하였으며, 50 μg/ml에서 tube formation을 억제하였다.
후속연구
즉, 인삼의 증숙과정 중에 인삼 사포닌의 OH기에 결합되어 있는 여러 가지 당 성분들이 열에 의해서 가수분해되어 다른 구조를 지닌 인삼 사포닌으로 변화되기 때문에 수삼, 홍삼 및 흑삼의 신생혈관형성에 미치는 결과가 달라진다는 것을 의미한다. 따라서 향 후 흑삼을 이용한 항암제 개발 및 Rg3, Rg5 이외에 흑삼에 존재하는 다른 인삼사포닌들에 대한 신생혈관 억제활성 및 기전연구에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 판단된다.
즉 암조직의 전이와 성장은 혈관에 의존적으로 이뤄지기 때문에 혈관형성을 저해함으로써 이를 차단할 수 있으므로 혈관형성 저해제는 좋은 항암제가 될 수 있다. 또한 신생혈관형성 저해제는 기존의 항암제가 암세포를 표적으로 하는 반면 내피세포를 표적으로 하며 기존의 항암제보다 독성이 약하고 내성이 나타나지 않으므로 부작용이 적을 것으로 기대된다. 실제로 신생혈관형성 저해 작용을 통해 암세포 증식을 억제하는 angiostatin과 endostatin이 개발되어 각광을 받았으며12), 이외에도 폴리펩타이드 류, 항생제류, 스테로이드류, 폴리양이온 및 폴리음이온류, 암억제유전자류, 폴리사카라이드류 등 여러 가지 신생혈관 억제제가 개발되고 있다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
고려인삼이란?
A. Meyer)은 두릅나무과(Araliaceae)에 속하는 식물로써 어원을 보면 ‘Pan’ 은 모든 것, ‘Axos’ 는 의학이라는 뜻으로 만병통치라는 의미를 뜻한다. 이러한 고려인삼은 수천년 동안 고귀한 생약제로 사용되어 왔으며 역사적으로 문화적으로 그리고 산업적으로 매우 중요한 우리민족의 유산이자 자원이다1).
기존의 전통적인 방법인 구증구포의 방법이 아닌 새로운 고온고압을 이용한 흑삼을 제조하는 방법을 이용하여 흑삼을 제조하였으며 흑삼으로부터 흑삼에 특이적으로 많이 존재하는 인삼사포닌 Rg3, Rg5를 분리하여 혈관내피세포인 HUVEC에 bFGF를 처리하여 혈관형성을 유도한 후 proliferation, migration, tube formation에 미치는 영향을 살펴보았으며, in vivo 실험으로 CAM assay를 실시하여 얻은 결론은?
기존의 전통적인 방법인 구증구포의 방법이 아닌 새로운 고온고압을 이용한 흑삼을 제조하는 방법을 이용하여 흑삼을 제조하였으며 흑삼으로부터 흑삼에 특이적으로 많이 존재하는 인삼사포닌 Rg3, Rg5를 분리하여 혈관내피세포인 HUVEC에 bFGF를 처리하여 혈관형성을 유도한 후 proliferation, migration, tube formation에 미치는 영향을 살펴보았으며, in vivo 실험으로 CAM assay를 실시하여 다음과 같은 결론을 얻었다. 흑삼추출물은 125 ㎍/㎖ 농도에서부터 HUVEC 증식 및 이동을 억제하였으며, 50 ㎍/㎖에서 tube formation을 억제하였다. 또한 흑삼에 특이적으로 많이 존재하는 인삼사포닌인 Rg3와 Rg5도 HUVEC 증식, 이동 및 tube formation을 억제하였다. 한편, in vivo 실험에서 흑삼추출물, Rg3 및 Rg5가 각각 60%, 70% 및 50%의 억제활성을 나타내었다.
신생혈관형성이란?
신생혈관형성이란 기존의 혈관으로부터 새로운 혈관이 형성되는 일련의 과정으로 혈관형성의 억제제 (thrombospondin-1, angiostatin, endostatin etc.)와 활성화제 (VEGF, bFGF, EGF etc.)의 균형에 의해 조절되는 것으로, 배아발달, 생식, 상처치유 등의 과정에서 나타난다6,7). 암조직은 자신들의 생존을 위해 반드시 신생 혈관형성 (angiogenesis)이 필요하며, 이 혈관으로부터 산소와 영양분을 공급받지만, 혈관형성 없이 암조직은 1-2 mm이상 성장할 수 없다7-10).
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