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문제 정의
- 이와 같은 중추신경계 퇴행성 뇌 질환의 주요한 요인 중의 하나가 산화적 스트레스이며, 특히 글루타메이트는 중추신경계에서 산화적 스트레스를 유발하는 물질로 알려져 있다.14,26) 본 연구에서는 고삼의 70% 에탄올 추출물(NNMBS007)과 70% 에탄올 추출물의 비수용성 분획물(NNMBS008), 수용성 분획물(NNMBS009)이 갖는 뇌세포 보호효과와 항산화 효과를 측정하고자 글루타메이트로 산화적 손상을 유발시킨 생쥐 해마 유래 HT22 세포를 이용하여 세포 생존율과 그 보호 기전을 연구하였다.
제안 방법
- 10,11) 글루타메이트가 유발하는 신경세포 손상은 크게 두 가지 요인으로 구분할 수 있는데, 글루타메이트 수용체의 과다흥분에 의한 독성과 글루타메이트 수용체의 매개 없이 산화적 스트레스를 유발하여 세포에 손상을 미치는 것이다. 12,13) 본 실험에서는 글루타메이트의 수용체가 결여되어있는 쥐의 해마유래인 HT22 세포주를 사용하여 글루타메이트 처리시 수용체 과다 흥분에 의한 독성이 아닌 산화적 스트레스로 인한 세포의 손상을 확인 할 수 있도록 하였다.14)
- 96-Well tissue culture plates와 기타 tissue culture dishes는 Nunc사 제품을 이용하였다. 흡광도는 BioRad사의 Microplate Reader를 이용하여 측정하였다. TLC (Thin layer chromatography) plate는 MERCK사의 Silica gel 60 F254 plate를 이용하였다.
- 85 g을 얻었다. 얻어진 고삼 70% 에탄올 추출물에 증류수 100 ml를 넣고 교반하여 현탁시킨 후 24시간 동안 실온에서 방치하고, 3000 rpm에서 30분 동안 원심분리하여 침전물을 취함으로써 고삼 70% 에탄올추출물의 비수용성 분획물 (NNMBS008) 1.48 g과 수용성 분획 (NNMBS009) 1.04 g 을 제조하였다. 각 시료는 실험에 사용한 배지에 녹여서 사용하였다.
- 또한, 모든 실험치는 대조군에 대한 세포보호율을 mean±S.D.로 표시하였으며, 각각 3회 반복 실험치를 이용하여 계산하였다.
- − HT22 세포를 60 mm dish에 3×105 cells/well 밀도로 24시간 배양한 후 각각의 시료를 농도 별 또는 시간 별로 처리 하였다.
- − 배양된 세포를 PBS로 세척한 후, 10 µM 2',7'-dichlofluorescein diacetate (DCFDA, 35845)를 포함하는 Hank’s balanced salt 용액에서 30분 동안 암실에서 반응시킨 후 세포의 형광광도 (SpectramaxGemini XS, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, U.S.A.)를 측정하였다 (excitation wavelength: 490 nm; emission wave length : 525 nm).
- HT22 세포에 RIPA buffer를 첨가한 다음, 4℃, 14,000×g 에서 25분간 원심분리하고 상등액을 튜브에 옮겼다. 단백질 정량은 BSA 단백질 실험 키트를 이용하였고 각각의 시료를 12% SDSpolyacrylamide gel에서 영동하고 nitrocellulose membrane (NC membrane)으로 전사하였다. 전사된 NC membrane을 5% 무지방유가 포함된 신선한 blocking buffer (0.
- 1% Tween 20 in Tris-buggered saline)에서 blocking한 후 HO-1 antibody를 1:1000으로 희석하여 넣고 1시간 동안 반응시켰다. 다시 2차 antiboby (Anti-mouse IgG)를 1:1000으로 희석하여 넣고 1시간 동안 반응한 다음, ECL 용액을 1:1로 잘 섞어서 NC membrane 위에 가하여 발광시키고 암실에서 X 선 필름에 감광한 후 현상하였다. 같은 방법으로 actin antibody를 이용하여 actin을 측정한다.
- 7, 8) NNMBS008에 의한 Nrf2의 전사 여부를 알아보기 위하여 80 µg/ml 농도의 NNMBS008 을 0, 0.5, 1, 1.5 시간 별로 처리하고 Western blot을 이용하여 분석하였다.
- HO-1의 발현과 HO activity 측정 실험에는 HO-1의 유도물질로 알려진 CoPP 20 µM을 양성 대조약물로 사용하였다. NNMBS008의 뇌세포 보호 효과와 ROS 소거 작용과 HO-1의 발현간의 직접적인 관계를 알아보기 위하여, HO-1 발현의 억제제인 SnPP를 이용한 세포생존율 실험을 하였다. HO-1 발현 억제제인 SnPP를 NNMBS008 (10~ 80 µg/ml)과 함께 12시간 동안 처리한 실험에서 뇌세포 보호 효과가 억제되며, ROS 소거능 또한 감소하는 것을 확인하였다 (Fig.
- HT22 세포 (2×105 cells/well)를 10% heat-inactivated FBS, penicillin G (100 IU/ml)와 streptomycin (100ìg/ml)을 함유한 DMEM배지에 분주하고 5% CO2 배양기 내에서 37℃에서 24시간 배양한 다음, 각각의 시료 용액 (25, 50,100, 200 µg/ml)과 5 mM 글루타메이트를 처리한 후 12시간 동안 5% CO2 배양기 내에서 배양하였으며, 세포생존율은 MTT법을 활용하여 측정하였으며, 양성대조약물로는 Trolox 50 µM를 사용하였다.
대상 데이터
- − 본 실험에 사용한 고삼은 2009년 9월 익산시 신용동 소재 대학한약국에서 구입하였으며, 형태학적 평가를 통하여 동정하였고 표본시료는 천연물신약표준화소재은행에 보관하였다.
- − 생쥐 해마 유래 HT22 세포주는 묵인희 교수 (서울대학교)로부터 분양하여 사용하였으며, 글루타메이트로 독성을 유발한 세포주에 대한 보호활성 측정은 정 등의 방법 25)에 따라 실시하였다.
- L-glutamate, Trolox와 3'-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)는 Sigma사에서 구입하였다.
- − DMEM 배지와 trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)는 Gibco Laboratorie사에서 구입하였으며, fetal bovine serum (FBS)는 Hyclone Laboratories사에서 구입하였다.
- − 본 실험에 사용한 고삼은 2009년 9월 익산시 신용동 소재 대학한약국에서 구입하였으며, 형태학적 평가를 통하여 동정하였고 표본시료는 천연물신약표준화소재은행에 보관하였다. 고삼 70% 에탄올 추출물(NNMBS007)과 각 분획물(NNMBS008, NNMBS009)은 천연물신약표준화소재 은행에서 분양 받아 사용하였다.
- L-glutamate, Trolox와 3'-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)는 Sigma사에서 구입하였다. 96-Well tissue culture plates와 기타 tissue culture dishes는 Nunc사 제품을 이용하였다. 흡광도는 BioRad사의 Microplate Reader를 이용하여 측정하였다.
- 흡광도는 BioRad사의 Microplate Reader를 이용하여 측정하였다. TLC (Thin layer chromatography) plate는 MERCK사의 Silica gel 60 F254 plate를 이용하였다.
- 세포 생존율과 ROS 소거 활성 실험에는 항산화물질로 알려진 trolox 50 µM을 양성 대조약물로 사용하였다.
- HO-1의 발현과 HO activity 측정 실험에는 HO-1의 유도물질로 알려진 CoPP 20 µM을 양성 대조약물로 사용하였다.
데이터처리
- 각 시료는 실험에 사용한 배지에 녹여서 사용하였다. 제조된 각 시료 (NNMBS007 ~ 009)는 박층크로마토그래프(TLC)법으로 함유 성분 패턴 분석을 하였다. 각 시료를 2.
- , San Diego, CA)을 사용하였다. 각 실험군의 결과는 평균치와 표준오차로 나타내었으며, 각 실험군 간의 결과는 ANOVA test를 사용하여 분석하고 유의적인 차이가 있는 항목에 대해서만 검정하였다. 실험군 간의 차이는 95% 수준(p<0.
이론/모형
- 4), 50 mM glycerophosphate, 20 mM NaF, 20 mM ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA), 1 mM dithiothreitol (DTT), 1 mM Na3VO4, protease inhibitors]를 첨가하고 4℃에서 15분간 혼합한 후 4℃, 16,000×g에서 15분간 원심분리 하였다. 이후의 과정은 앞에서 설명한 western blotting 방법을 이용하였다.
성능/효과
- 21) 최근의 연구에 의하면 고삼에서 분리한 flavonoid 성분인 8-lavandulylkaempferol이 free radical과 ONOO-를 제거하는 능력이 있는 것으로 보고된 바 있으며,22) lavandulyl flavanones 성분인 (2S)-2'-methoxykurarinone, sophora-flavanone G, leachianone A 및 (-)-kurarinone 등이 항 말라리아 활성이나 항균 활성이 있는 것이 밝혀지고 있다.23,24) 따라서, 본 연구에서는 고삼의 70% 에탄올 추출물의 비수용성 분획물인 NNMBS008의 뇌세포 보호효과를 밝혔으며 그 보호 기전이 Nrf의 핵 내 전사를 통한 HO-1 발현에 의한 것임을 확인하였다..
- 각 각의 시료 NNMBS007 ~ 009를 농도별 처리한 후 12시간 동안 글루타메이트와 함께 처리한 결과, 고삼 70% 에탄올 추출물의 비수용성 분획물(NNMBS008)이 세포독성을 나타내지 않은 농도(10~80 µg/ml)에서 다른 두 시료 (NNMBS007, NNMBS009)에서는 보여지지 않은 유의한 세포보호 활성을 나타내었으며 (Fig. 1A), 동시에 강력한 활성산소종(reactive oxygen species : ROS) 소거 효과를 나타내었다 (Fig. 1B).
- 1B). NNMBS008의 처리 농도가 증가함에 따라 세포 생존율이 증가하였으며, ROS 소거 활성 역시 NNMBS008의 농도에 비례하여 감소하였다 (Fig. 1). 세포 생존율과 ROS 소거 활성 실험에는 항산화물질로 알려진 trolox 50 µM을 양성 대조약물로 사용하였다.
- 세포 생존율과 ROS 소거 활성 실험에는 항산화물질로 알려진 trolox 50 µM을 양성 대조약물로 사용하였다. 또한, 산화적 스트레스로부터의 뇌세포 보호 기전에 관여하는 중요한 단백질인 Heme oxygenase (HO)-1의 발현 정도를 알아보기 위하여 각 시료를 12시간 동안 HT22 세포에 처리한 결과, 고삼의 70% 에탄올 추출물(NNMBS007)과 수용성 분획물(NNMBS009)을 처리하였을 때는 HO-1의 발현이 거의 일어나지 않았으며 (Fig. 2A and 2C), 이에 상응하게 HO activity 역시 변화가 없었다 (Fig. 3A and 3C). 이에 반하여, 비수용성 분획물(NNMBS008)을 처리 하였을 때는 HO-1 의 발현이 농도 의존적으로 뚜렷하게 증가 하였고 (Fig.
- HO-1 발현 억제제인 SnPP를 NNMBS008 (10~ 80 µg/ml)과 함께 12시간 동안 처리한 실험에서 뇌세포 보호 효과가 억제되며, ROS 소거능 또한 감소하는 것을 확인하였다 (Fig. 5).
- 3B). 고삼 70% 에탄올 추출물의 비수용성 분획물(NNMBS008) 을 처리한 HT22 세포에서 6시간부터 HO-1 발현이 시작되어 18시간에서 최고 농도에 도달하여 점차 발현이 감소하는 양상을 보였다(Fig. 3). HO activity 역시 18시간까지 시간에 비례하여 점차 증가하였고 18시간 이후에서는 감소하였다 (Fig.
- 5). 이와 같은 결과를 통해 산화적 스트레스로부터 나타나는 NNMBS008의 세포생존율 증가와 ROS 생성 억제능이 HO-1 단백질 발현과 관련 있음을 확인 하였다.
- 5 시간 별로 처리하고 Western blot을 이용하여 분석하였다. 시간이 경과함에 따라 세포질의 Nrf2는 점점 감소하는 반면, 핵 내부의 Nrf2는 증가하는 양상을 보이는 것으로 보아 Nrf2의 핵 내로의 전사가 이루어졌음을 확인할 수 있었다 (Fig. 6). 따라서 본 연구를 통해 고삼 70% 에탄올 추출물의 비수용성 분획물(NNMBS008)은 마우스 해마 유래 HT22 세포에서 Nrf2를 핵 내로 전사하고 이를 통하여 HO-1 단백질 발현을 함으로써 글루타메이트에 의한 산화적 독성으로부터 보호활성을 나타낸다는 사실을 확인하였다.
- 6). 따라서 본 연구를 통해 고삼 70% 에탄올 추출물의 비수용성 분획물(NNMBS008)은 마우스 해마 유래 HT22 세포에서 Nrf2를 핵 내로 전사하고 이를 통하여 HO-1 단백질 발현을 함으로써 글루타메이트에 의한 산화적 독성으로부터 보호활성을 나타낸다는 사실을 확인하였다. 이와 같은 결과를 바탕으로 향후 NNMBS008의 추가적인 in vitro 기전 연구와 더불어 in vivo 실험을 통한 퇴행성 뇌 질환 치료제 선도 물질 개발 연구 진행이 이뤄질 수 있을 것으로 기대 된다.
- 본 연구에서는 고삼 추출물 및 분획물의 뇌세포 보호 효과와 그 보호 기전을 탐색하였으며, 그 결과 고삼 70% 에탄올 추출물의 비수용성 분획물인 NNMBS008가 글루타메이트로 유발한 생쥐 해마 유래 HT22 세포주의 독성에 대하여 유의한 세포보호 활성을 나타내었다. 이는 Nrf2의 핵내 전사 유도를 통하여 발현되는 HO-1 단백질에 의한 것으로 생각된다.
후속연구
- 따라서 본 연구를 통해 고삼 70% 에탄올 추출물의 비수용성 분획물(NNMBS008)은 마우스 해마 유래 HT22 세포에서 Nrf2를 핵 내로 전사하고 이를 통하여 HO-1 단백질 발현을 함으로써 글루타메이트에 의한 산화적 독성으로부터 보호활성을 나타낸다는 사실을 확인하였다. 이와 같은 결과를 바탕으로 향후 NNMBS008의 추가적인 in vitro 기전 연구와 더불어 in vivo 실험을 통한 퇴행성 뇌 질환 치료제 선도 물질 개발 연구 진행이 이뤄질 수 있을 것으로 기대 된다.
- 이는 Nrf2의 핵내 전사 유도를 통하여 발현되는 HO-1 단백질에 의한 것으로 생각된다. 이와 같은 결과는 향후 고삼을 이용한 뇌 보호 선도 물질 탐색 연구에 기초적인 역할을 할 것으로 판단된다.
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