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문제 정의
- 본 연구에서는 산초나무 열매의 종자와 종피를 같이 사용한 분획물을 대상으로 항암 활성을 평가 하고 이를 토대로 항암제 개발 가능성을 확인 하고자 조사하였다.
제안 방법
- 일반적으로 항암 활성을 나타내는 물질은 세포주기를 억제 하는 것으로 알려져 있다.16) 따라서 flow cytometric 분석을 통해 대장암 세포에 EtOAc 분획물을 처리하였을 때의 세포주기 변화 양상을 분석하였다. 분석 결과 두 개의 EtOAc 분획물에서 모두 세포주기가 변화되는 것을 관찰하였다(Fig.
- DNA 양의 측정은 세포 농도를 1.0×104 cell/well로 준비하여 FACS flow cytometer analysis system(FACScan, BD Biosciences, San Jose, CA, USA)을 이용하여 측정하였다.
- EtOAc 분획물을 처리한 대장암세포에서 RNA를 분리하여 C-myc, p53, Caspase-3, Survivin, Bcl-2, Bax 유전자의 발현양을 조사하였다. C-myc의 경우 70% 에탄올 EtOAc 분획물을 처리하였을 때 발현량이 감소되는 것을 확인 할 수 있었다(Fig.
- MTT assay를 통해 항암활성이 있는 것으로 나타난 EtOAc 분획물을 첨가였을 때 세포주기 변화를 조사하였다. 일반적으로 항암 활성을 나타내는 물질은 세포주기를 억제 하는 것으로 알려져 있다.
- 2 mM dNTP, ×10 reaction buffer 그리고 5'와 3' primers 10 pmol을 포함한 전체 부피 20 µL의 시료를 thermal cycler (Bio-RAD, CA, USA)를 이용하여 PCR 분석을 하였다. PCR 반응은 95oC에서 2분간 initial denaturation 시킨 후 95oC 1분 denaturation, 55oC 1분 annealing 그리고 72oC 1분 extension을 25회 반복 한 뒤 final extension을 72oC 10분하여 증폭 하였다. PCR에 사용된 primer는 Yin 등21)의 논문을 참고하여 C-myc, Bcl-2, Bax, p53, Caspase-3, Surviving, b-actin의 nucleotides를 합성하여 사용하였다.
- Total RNA는 분획물을 처리한 암세포와 처리하지 않은 암세포에서 Trizol reagent (Invitogen, CA, USA)을 이용하여 kit의 protocol에 따라 total RNA를 추출하였다. 각각의 시료에서 murine leukemia virus reverse transcriptase reverse transcriptase 1 unit, 1 mM dNTP 그리고 oligo (dT12-18) 0.
- cDNA에 Taq DNA polymerase 1 unit, 0.2 mM dNTP, ×10 reaction buffer 그리고 5'와 3' primers 10 pmol을 포함한 전체 부피 20 µL의 시료를 thermal cycler (Bio-RAD, CA, USA)를 이용하여 PCR 분석을 하였다.
- 각각의 시료에서 murine leukemia virus reverse transcriptase reverse transcriptase 1 unit, 1 mM dNTP 그리고 oligo (dT12-18) 0.5 µg/µl를 이용하여 1 µg의 RNA를 역전사 하여 cDNA를 얻었다.
- 대장암세포에 항암 효능을 보인 두 개의 EtOAc 분획물을 대상으로 농도에 따른 항암활성을 평가하기 위해 분획물을 0.0125, 0.025, 0.05, 0.1, 0.2 mg/mL의 농도로 제조후 대장암세포에 대한 항암활성을 측정하였다. 두 개의 분획물 모두 농도 의존적으로 항암 활성이 증가되는 것을 확인 할 수 있었다(Fig.
- 배양 후, 20 µL의 MTT solution을 첨가한 후 CO2 배양기(37oC, 5% CO2, MCO-15AC, SANYO, Osaka, Japan)에서 4시간 반응시킨 후, 550 nm에서 흡광도의 변화를 측정하여 대조군에 대한 세포 생존율을 백분율로 표시하였다.
- 산초나무 열매의 추출물을 대상으로 대장암 세포에 대한 항암 효과를 측정한 결과 70% 메탄올과 70% 에탄올에서 다른 추출물에 비해 비교적 높은 항암 활성을 보였다 (data not shown). 비교적 높은 항암 활성을 보인 두 개의 70% 메탄올과 70% 에탄올 추출물을 대상으로 EtOAc, BuOH, 물로 순차적으로 분획하여 분획물을 얻은 후 대장암세포에 분획물을 첨가하여 암세포에 대한 항암 활성을 MTT assay를 통해 평가하였다.
- 산초나무 열매 분획물을 대상으로 대장암 항암 활성을 측정하였다. 대장암세포를 배양 한 뒤 70% 에탄올, 70% 메탄올의 EtOAc, BuOH, 물 분획물에 대한 항암 활성을 측정한 결과 분획물을 0.
- 세포 내 ROS(reactive oxygen species)양을 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFDA) (Molecular Probes, Invitrogen) 형광 probe를 이용하여 flow cytometer (FACScan, BD Biosciences, San Jose, CA, USA)를 사용하여 측정하였다.
- PCR에 사용된 primer는 Yin 등21)의 논문을 참고하여 C-myc, Bcl-2, Bax, p53, Caspase-3, Surviving, b-actin의 nucleotides를 합성하여 사용하였다. 증폭 후에 PCR 반응 시킨 시료를 1.5% agarose gel 에서 전기영동하고 ethidium bromide 염색과 UV 조사를 통해 확인하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 산초(Zanthoxylum schnifolium)열매(종자와 종피)는 충북 단양군에서 2009년 가을에 채취하여 10시간동안 열풍건조 한 뒤 분쇄하여 시료 중량 대비 20배의 70% 에탄올, 70% 메탄올의 추출용매를 이용하여 24시간 2회 추출 후 여과 한 뒤 감압 농축하여 추출물을 제조 후 추출물 (50 g)을 물 2 L로 현탁 후 각각 동량의 ethyl acetate(EtOAc), n-Buthanol(BuOH)을 첨가하여 2회 분획한뒤 얻은 분획물을 감압 농축하여 시료로 사용하였다.
- 실험에 사용된 세포는 HT-29 세포이며, 분획물을 100 µg/mL의 농도로 24시간 처리 후 세포를 수확한 뒤 PBS로 두 번 씻어내고 70% 에탄올로 20oC에서 한 시간 동안 고정 한 뒤 propidium iodide (PI) solution (20 µg/mL PI, 0.1 mM EDTA, 10 µg/mL RNase, 1% Triton X-100)으로 30 분간 암실에서 염색하였다.
- 실험에 사용한 인간 대장암세포주인 HT-29 세포는 한국세포주은행(KCLB)에서 분양 받았으며, 세포배양을 위해 10% FBS (Gibco)와 100 U/mL의 penicillin, 100 µg/mL의 streptomycin을 포함하는 RPMI-1640 (Gibco, MD, USA)배지를 사용하였으며, 세포는 CO 2 배양기(37oC, 5% CO2, MCO-15AC, SANYO, Osaka, Japan)에서 배양하였다.
데이터처리
- PI의 형광은 585 nm에서 FL-2 channel로 확인하였다. 수집된 데이터는 WinMDI version 2.9 cell cycle analysis software (Scripps Research Institute) 프로그램을 이용하여 분석하였다.
이론/모형
- DCF로부터 나오는 형광의 측정은 FACScan flow cytometry (Becton–Dickinson, San Jose, CA)를 이용하여 측정하였다.
- PCR 반응은 95oC에서 2분간 initial denaturation 시킨 후 95oC 1분 denaturation, 55oC 1분 annealing 그리고 72oC 1분 extension을 25회 반복 한 뒤 final extension을 72oC 10분하여 증폭 하였다. PCR에 사용된 primer는 Yin 등21)의 논문을 참고하여 C-myc, Bcl-2, Bax, p53, Caspase-3, Surviving, b-actin의 nucleotides를 합성하여 사용하였다. 증폭 후에 PCR 반응 시킨 시료를 1.
- , MCO-15AC, SANYO, Osaka, Japan)에서 배양하였다. 각각 분획물의 세포 독성은 Desai 등20)의 방법에 의거하여 측정하였다. mitochondrial dehydrogenases에 의하여 3-(4,5-dimethylthiazol -2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)가 formazan으로 변환되는 양을 측정하는 것으로 96 well plate에 1.
성능/효과
- 2). 0.0125 mg/mL의 농도로 처리하였을 때 대장암 암세포의 생존율은 80% 내외로 나왔으나, 흥미롭게도 0.05 mg/mL의 농도로 사용 하였을 때 두 개의 분획물에서 약 60% 정도의 생존율을 보였으며, 대조군으로 사용된 fluorouracil는 같은 농도에서 40%의 생존율을 보였다. 특히 70% 메탄올 EtOAc 분획물의 경우 0.
- p>산초(Zanthoxylum schnifolium)는 우리나라에 주로 서식하는 자생 식물로서 아시아 서부에 분포하고 있으며, 낙엽관목으로 성숙한 개체의 키는 3 m 내외로 열매는 이른 가을에 수확하여 건조한 민간요법으로 눈의 피로회복에 주로 사용 하였다.1) 산초에는 30여 가지의 휘발성 향미 성분을 포함하는 유지, 산미, 정유성분이 함유되어 있어 예전부터 전통적인 약용, 제유용, 향신료로 널리 사용되어 왔으며 특히 비린내를 제거하는 효과가 우수한 것으로 나타났다.2) 산초에서 통증 경감 및 소화기관 장애, 급성 설사에 효과를 보이며, 위염이나 요통에서 효능을 보인다고 보고 되었다.
- Flow cytometric 분석을 통한 세포주기 변화를 측정한 결과 산초나무 열매 분획물의 세포주기 중 sub G0와 G0/G1기를 증가시켜 세포 분열을 억제하는 것으로 나타났다. Apoptosis와 관련된 유전자의 발현량을 확인한 결과 aopotosis를 억제하는 것으로 알려진 Bcl-2, Survivin유전자의 발현량을 감소시켜 aopotosis를 활성화 하는 것으로 확인 되었다. 또한 ROS 역시 분획물을 첨가한 군에서 증가되는 것으로 나타나 대장암세포에 대한 항암 활성을 나타내었다.
- 또한 각 분획물의 농도에 따른 항암 활성을 측정한 결과 농도의존적으로 증가하는 것으로 확인 되었다. Flow cytometric 분석을 통한 세포주기 변화를 측정한 결과 산초나무 열매 분획물의 세포주기 중 sub G0와 G0/G1기를 증가시켜 세포 분열을 억제하는 것으로 나타났다. Apoptosis와 관련된 유전자의 발현량을 확인한 결과 aopotosis를 억제하는 것으로 알려진 Bcl-2, Survivin유전자의 발현량을 감소시켜 aopotosis를 활성화 하는 것으로 확인 되었다.
- 대장암세포를 배양 한 뒤 70% 에탄올, 70% 메탄올의 EtOAc, BuOH, 물 분획물에 대한 항암 활성을 측정한 결과 분획물을 0.3 mg/mL의 농도로 처리한 EtOAc 분획물에서 대장암세포의 생존율은 각각 7.62±0.173%, 7.66± 0.037%로 나타났다.
- 대장암세포를 배양 후 EtOAc, BuOH, 물 분획물을 0.3 mg/ mL의 농도로 처리한 결과 70% 에탄올, 70% 메탄올의 EtOAc 분획물에서 대장암세포의 생존율은 각각 7.62±0.173%, 7.66±0.037%로 나타나 급속히 감소하는 것으로 나타났다 (Fig. 1).
- 두 개의 EtOAc 분획물을 첨가한 대장암세포에서 형광 probe를 이용하여 flow cytometer를 통해 측정한 결과 70% 에탄올의 EtOAc 분획물에서는 112.19±2.78%로 나타났으며, 70% 메탄올의 EtOAc 분획물에서는 107.63.±0.81%로 ROS 의 양이 증가 되는 것으로 나타났다(Fig. 5).
- 2 mg/mL의 농도로 제조후 대장암세포에 대한 항암활성을 측정하였다. 두 개의 분획물 모두 농도 의존적으로 항암 활성이 증가되는 것을 확인 할 수 있었다(Fig. 2). 0.
- 또한 apoptosis를 억제하는 것으로 알려진 Survivin 유전자의 경우 두 개의 분획물에서 발현이 감소되는 것으로 나타났다. 따라서 산초나무 열매 분획물은 apoptosis를 억제하는 유전자들의 발현을 감소 시킴으로써 apoptosis를 활성화 시키는 것으로 나타났다.
- 4). 또한 anti-apoptosis와 관련된 Bcl-2 유전자의 경우 두 개의 분획물에 발현이 감소되는 것을 확인 하였으나, Bax 유전자의 경우 발현량은 크게 차이가 없는 것으로 나타났다. 또한 apoptosis를 억제하는 것으로 알려진 Survivin 유전자의 경우 두 개의 분획물에서 발현이 감소되는 것으로 나타났다.
- 037%로 나타났다. 또한 각 분획물의 농도에 따른 항암 활성을 측정한 결과 농도의존적으로 증가하는 것으로 확인 되었다. Flow cytometric 분석을 통한 세포주기 변화를 측정한 결과 산초나무 열매 분획물의 세포주기 중 sub G0와 G0/G1기를 증가시켜 세포 분열을 억제하는 것으로 나타났다.
- 16) 따라서 flow cytometric 분석을 통해 대장암 세포에 EtOAc 분획물을 처리하였을 때의 세포주기 변화 양상을 분석하였다. 분석 결과 두 개의 EtOAc 분획물에서 모두 세포주기가 변화되는 것을 관찰하였다(Fig. 3). 특히 대조군과 대조하여 볼 때 sub G0, G0/G1기는 증가 되었으며, S, G2/M기는 감소하는 것으로 나타났다.
- 산초나무 열매의 추출물을 대상으로 대장암 세포에 대한 항암 효과를 측정한 결과 70% 메탄올과 70% 에탄올에서 다른 추출물에 비해 비교적 높은 항암 활성을 보였다 (data not shown). 비교적 높은 항암 활성을 보인 두 개의 70% 메탄올과 70% 에탄올 추출물을 대상으로 EtOAc, BuOH, 물로 순차적으로 분획하여 분획물을 얻은 후 대장암세포에 분획물을 첨가하여 암세포에 대한 항암 활성을 MTT assay를 통해 평가하였다.
- 3). 특히 대조군과 대조하여 볼 때 sub G0, G0/G1기는 증가 되었으며, S, G2/M기는 감소하는 것으로 나타났다. 이는 EtOAc 분획물이 대장암세포의 세포분열을 억제함으로써 대장암 세포의 증식이 감소한다는 것을 의미한다.
후속연구
- 위의 결과를 종합 하여 보면 산초나무 열매의 EtOAc 분획물은 대장암세포에 대한 항암 활성을 가지고 있는 것으로 판단되며, 앞으로 항암 활성을 나타내는 단일 물질을 분리한다면 항암제로서 개발 가능성은 높은 것으로 사료된다.
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