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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 눈꽃 동충하초(P. japonica)와 번데기동충하초(C. militaris) 그리고 동충하초의 주요 생리활성 물질인 cordycepin 고함유 번데기 동충하초(C. militaris JLM 0636)를 이용하여 OA-유발 지방간 모델에서 혈청 중 지질 농도 및 간 조직의 병리조직학적 변화에 미치는 영향을 검토하였다.
제안 방법
- 동물실험은 10일간 각 군별로 조제사료를 급여하면서 사육한 후, 실험 최종일 12시간 이상 절식시킨 후 에테르로 가볍게 마취시켜 해부하였다. 개복 후 복부 대동맥으로부터 채혈하여 혈액을 채취하고, 약 30분간 실온에 방치시킨 후 3,000 rpm에서 20분간 원심분리 하여 혈청을 얻어 혈청 생화학적 분석에 제공하였다. 채혈 후 간 및 지방 조직을 적출하여 차가운 0.
- 동물실험은 10일간 각 군별로 조제사료를 급여하면서 사육한 후, 실험 최종일 12시간 이상 절식시킨 후 에테르로 가볍게 마취시켜 해부하였다. 개복 후 복부 대동맥으로부터 채혈하여 혈액을 채취하고, 약 30분간 실온에 방치시킨 후 3,000 rpm에서 20분간 원심분리 하여 혈청을 얻어 혈청 생화학적 분석에 제공하였다.
- 동물해부 직후 적출한 간 조직을 냉각 생리식염수로 관류하여 혈액을 제거시킨 상태에서 조직의 일정한 부위의 일부를 취하여 10% 중성포르말린 용액에 고정하여 통상적인 조직처리인 파라핀 포매 과정을 거쳐 3~4 μm 두께로 절편하여 hematoxylin and eosin (H&E) 염색 한 후 광학현미경(Olympus BX41, Olympus Co., Tokyo, Japan)으로 관찰하였다.
- militaris JLM0636 투여군(CMα)으로 나누어 실험을 진행 하였다. 동충하초 분말의 식이 첨가량 결정은 전보의 방법[20]에 준하였으며, 식이 중에 첨가한 동충하초 분말은 탄수화물원인 corn starch로 대체하였고, OA는 sucrose로 대체하여 첨가하였다.
- 본 실험은 체중이 동일하게 난괴법(randomized complete block design)으로 분류하여 사육실 온도(22±2℃)와 습도 (50±5%) 및 명암주기(명주기: 07:00～19:00)가 조절되는 동물사육실에서 사육하였다.
- 실험동물은 각 군마다 6마리씩 나누고, 식이와 물은 10일간 자유섭취 시켰다. 사육 기간 중 식이 섭취량은 매일 측정하였고, 체중은 3일에 한번씩 일정한 시간에 측정하였다.
- 실험 식이의 조성은 Table 1과 같으며, 정상군(N), 오르트산 투여 대조군(C), 오르트산+3% (w/w) P. japonica 투여군(PJ), 오르트산+3% C. militaris 투여군(CM), 오르트산+3% cordycepin 고함유 C. militaris JLM0636 투여군(CMα)으로 나누어 실험을 진행 하였다.
- 본 실험은 체중이 동일하게 난괴법(randomized complete block design)으로 분류하여 사육실 온도(22±2℃)와 습도 (50±5%) 및 명암주기(명주기: 07:00～19:00)가 조절되는 동물사육실에서 사육하였다. 실험동물은 각 군마다 6마리씩 나누고, 식이와 물은 10일간 자유섭취 시켰다. 사육 기간 중 식이 섭취량은 매일 측정하였고, 체중은 3일에 한번씩 일정한 시간에 측정하였다.
- 6 mm ID)를 사용하였으며, 검출기는 UV Detector (260 nm)를 사용하였다. 이때 Sigma 사(St. Louis, MO, USA)의 코디세핀 표준품을 이용하여 검량선을 작성하였으며, 시료의 코디세핀 피크 면적비로부터 추출물의 cordycepin 함량을 계산하였다.
- 개복 후 복부 대동맥으로부터 채혈하여 혈액을 채취하고, 약 30분간 실온에 방치시킨 후 3,000 rpm에서 20분간 원심분리 하여 혈청을 얻어 혈청 생화학적 분석에 제공하였다. 채혈 후 간 및 지방 조직을 적출하여 차가운 0.9% 생리식염수로 세척하고 여과지로 물기를 제거한 후 무게를 측정하고 분석시료로 제공하였다.
- 동결 건조한 동충하초 분말에 중량 대비 10배량의 증류수를 가하고 70℃에서 1시간 추출한 후 실온에서 30분 동안 다시 초음파(40 KHz) 처리하였다. 추출물을 원심분리(8,000 rpm) 하여 얻어진 상등액을 0.45 mm membrain filter로 여과하여 HPLC (Prekin-Elmer 200 series system, USA)의 분석 시료로 사용하였다. Column은 X Bridge C18 (250 mm x 4.
- 혈청 중의 trigylceride, total-cholesterol, total lipid, free fatty acid, phospholipid 농도는 의료전문수탁검사기관인 네오딘의학연구소(서울, 한국)에 의뢰하여 분석하였다.
대상 데이터
- 45 mm membrain filter로 여과하여 HPLC (Prekin-Elmer 200 series system, USA)의 분석 시료로 사용하였다. Column은 X Bridge C18 (250 mm x 4.6 mm ID)를 사용하였으며, 검출기는 UV Detector (260 nm)를 사용하였다. 이때 Sigma 사(St.
- 본 실험에 사용한 동충하초 동결건조 분말은 청원농산(김해, 경남)으로부터 제공받아 사용하였다. 육종에 의해 cordycepin 함유량을 높인 C.
- militaris 분말을 실험재료로 사용하였다. 세 종류의 동충하초 분말은 모두 외관상 노란색을 띄었으며, 색깔의 농도는 P. japonica, C. militaris, cordycepin 고함유 C. militaris JLM0636순으로 진하였다.
- 실험동물은 효창사이언스(대구, 한국)로부터 6주령의 Sprague-Dawley계 수컷 흰쥐를 구입하여 일주일간 시판 고형사료를 급여하면서 환경에 적응시킨 후 본 실험에 사용하였다. 본 실험은 체중이 동일하게 난괴법(randomized complete block design)으로 분류하여 사육실 온도(22±2℃)와 습도 (50±5%) 및 명암주기(명주기: 07:00～19:00)가 조절되는 동물사육실에서 사육하였다.
- 본 실험에 사용한 동충하초 동결건조 분말은 청원농산(김해, 경남)으로부터 제공받아 사용하였다. 육종에 의해 cordycepin 함유량을 높인 C. militaris JLM0636, P. japonica 및 C. militaris 분말을 실험재료로 사용하였다. 세 종류의 동충하초 분말은 모두 외관상 노란색을 띄었으며, 색깔의 농도는 P.
데이터처리
- 실험으로부터 얻어진 결과치는 one-way ANOVA 검정에 의한 평균치와 표준오차(mean±S.E.)로 표시하였으며, 각 실험군 간의 유의성 검증은 Duncan's multiple range test로 하였다[11].
성능/효과
- CMα의 cordycepin 함량은 7.42 mg/g으로 CM 1.01 mg/g보다 7배 정도 높았으며, PJ에서는 cordycepin이 검출되지 않았다.
- PJ군은 C군에 비해 지방세포의 크기와 수가 줄어들어 약간 개선된 경향을 보였으며, CM군과 CMα군은 C군에 비해 지방세포의 크기와 수가 현저하게 감소하였고, 이러한 효과는 CM보다 cordycepin 고함유 CMα군에서 지방간 개선 효과가 더 큰 것으로 본 실험에서 확인되었다.
- 그러나 OA 투여 대조군(C)에서 감소된 혈청 중성지질, 총 지질 및 유리 지방산 농도는 PJ 및 CM군에서 유의적인 증가 또는 증가경향을 보인 반면 CMα 군에서는 큰 차이를 보이지 않았다.
- 부고환 주변의 지방 조직을 적출하여 무게를 측정한 결과 정상군(N) 5.26 g에 비해 OA 대조군(C) 4.30 g으로 유의적으로 낮았으며, OA 실험군에서 PJ, CM 및 CMα 투여군에서 각각 3.13, 3.78 및 3.71 g으로 감소하여 체중 저하 작용에 영향을 미친 것으로 확인되었다.
- 정상군(N)에서 체중이 114 g 증가한 것에 비해 OA 대조군(C)에서는 80 g으로 유의적으로 감소하여 OA에 의해 성장에 영향을 미친 것으로 나타났다(Table 2). 그러나 OA 실험군에서 PJ, CM 및 CMα 투여군에서 체중 증가량은 각각 51, 67 및 78 g으로 OA 대조군(C) 보다 낮아 체중저하 효과가 있는 것으로 생각된다.
- 5 같다. 정상군(N)은 간소엽의 구조가 잘 유지되었으며, 간 세포들은 뚜렷한 둥근핵을 가지고 있으면서 그 간격이 일정하고, 세포 간극이 좁은 잘 짜여진 소엽구조를 하고 있었다. 이와 유사하게 CMα 군도 간소엽을 구성하고 있는 간 세포들이 전반적으로 균일하게 배열되어 있어 정상군(N)의 간 소견과 비슷한 양상을 보였다.
- 특히 cordycepin 함량이 높은 CMα 첨가군의 경우 OA 투여에 의한 간 조직 중의 중성지질 축적 억제 작용이 다른 CM 또는 PJ군 보다 현저하여 지방간개선 효과를 가진 기능성식품 원료로 사용될 수 있는 가능성이 높아 보였다.
- 혈청 중성지질 및 유리 지방산 농도는 정상군(N)에 비해 OA 투여 대조군(C)에서 유의적으로 감소하였고, 총 지질 농도는 대조군(C)에서 감소하는 경향을 보였다(Fig. 3). 그러나 총 콜레스테롤 및 인지질 농도는 정상군(N)과 대조군(C) 사이에 유의적인 차이는 없었다.
후속연구
- 그러나 본 실험에서 혈중 중성지질 농도 변화와 간 조직의 중성지질 농도 변화 사이에 정의 상관관계가 성립되지 않아 VLDL 분비 저해만으로는 설명하기 어렵기 때문에 중성지질 및 지방산 합성 또는 산화와 관련성이 높은 것으로 예상해 볼 수 있지만 이를 뒷받침 하기 위해서는 향후 좀더 구체적인 실험이 진행되어야 할 것이다. 특히 cordycepin 함량이 높은 CMα 첨가군의 경우 OA 투여에 의한 간 조직 중의 중성지질 축적 억제 작용이 다른 CM 또는 PJ군 보다 현저하여 지방간개선 효과를 가진 기능성식품 원료로 사용될 수 있는 가능성이 높아 보였다.
- 1)로 항당뇨 작용[24], 고지질혈증 개선작용[13] 및 혈소판 응집억제 작용[9]이 보고되었다. 또한 동충하초는 전통 한약제로서 면역력 증강, 항산화 효과, 호흡기질환 그리고 자양강장 등에 사용되었으며, 항암 및 항염증 효과, 항피로 등의 다양한 효능이 있는 것으로 알려지고 있어서 만성 성인병이나 난치병의 예방 및 치료제로서의 개발가치가 높은 것으로 기대된다[12,16,17]. 그러나 지방간을 비롯한 간 질환에 대한 동충하초의 개선효과에 관한 연구는 극히 미진한 것으로 생각되어진다[10,22,23].
- 이상의 실험에서 동충하초의 주요 생리활성 물질인 cordycepin 함량을 높인 번데기 동충하초(C. militaris JLM 0636)는 OA-유발 지방간 모델에서 간 조직의 지방 축적 억제로 인한 지방간 개선 효과가 있는 것으로 밝혀져 간 질환 개선용 기능성식품 원료로 사용될 가능성이 높은 것으로 사료 되어 진다.
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