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문제 정의
- 따라서 본 연구의 목적은 상기 생물종이 해양생태계의 유해물질에 대한 동·식물학적 특성을 모두 반영할 수 있는 해양생태독성 평가용 표준시험생물로서의 가능성을 규명하는데 있다.
제안 방법
- 개체군성장률(r)은 r=(lnNt-lnNo)/t (r=개체군성장률, Nt= 실험 종료 후의 세포밀도, No=초기세포밀도, t=배양시간)의 식으로 구하였다. 각 농도별로 r값을 계산한 후 이를 이용하여 72시간 반수영향농도(50% effective concentration, EC50)를 계산하였다.
- rubrum의 독성물질에 대한 민감도를 검증하기 위하여, 우선 ISO (1995)에서 제시한 식물플랑크톤의 표준독성물질인 Potassium dichromate (K2Cr2O7, Merck, Germany)를 사용하였으며, 동물플랑크톤의 표준독성물질인 copper chloride (CuCl2 , Aldrich, USA)를 이용하여 개체군성장저해율을 측정하였다. 농도별 표준용액은 최고 농도의 표준용액을 제조한 후 이를 순차적으로 희석하였으며, 대조구를 포함하여 6개 농도 구간에서 각각의 농도별로 살아있는 개체를 계수하여 72시간 개체군성장률(EC50)을 측정하였다(이 등, 2008a).
- 독성실험에 대한 end points는 대조구의 개체군성장률 대비 50%에 이르는 성장저해율인 EC50(50% population growth inhibition concentration)을 계산하였다. 계산 방법은 각 실험구에서의 개체군성장률을 계산한 후 Linear interpolation 방법으로 EC50을 산정하였다.
- 45 μm, Whatman, USA)로 여과하여 실험에 사용하였다. 독성실험을 위한 하수오니 추출액은 용출한 시료를 최고 농도(100%)로 설정한 후 이를 순차적으로 희석하여 대조구(0%)를 포함한 6개 농도(6.3, 12.5, 25.0, 50.0, 100.0%)를 제조하여 3 반복으로 실험하였다. 시험용기는 70 mL 폴리카보네이트 병을 이용하였으며, 시험용액을 각 농도별로 50 mL씩 시험용기에 분주하였다.
- 생태독성시험에 사용하는 표준시험종의 가장 중요한 조건은 독성물질에 대한 민감도가 높아야 하며, 생태계를 구성하는 생산자, 소비자 및 분해자에 대한 표준시험생물별 표준독성물질이 규정되어 있다 (이 등, 2008a; ISO, 1995). 따라서 해양 생태계의 생산자를 대표하는 식물플랑크톤과 1차 소비자인 동물플랑크톤의 표준독성시험물질인 potassium dichromate와 copper chloride를 이용하여 M. rubrum의 표준독성물질에 대한 민감도를 실험하였다.
- 생태독성시험에 사용하는 표준시험종의 중요한 조건은 위의 표준물질에 대한 독성 민감도 이외에 실제 해양오염물질에 적용이 가능하여야 한다. 따라서 현재 해양투기가 이루어지고 있는 산업폐수오니(피혁, 염색, 염료)를 이용하여 섬모충, 규조류, 해조류, 윤충류, 저서요각류, 어류를 대표하는 6종에 대한 독성실험을 실시하였다. 동일 물질에 대한 6종의 독성실험결과, 섬모충은 다른 5종에 비하여 독성 민감도가 가장 높거나 또는 가장 민감도가 높은 다른 시험종과 유사한 민감도를 보였다.
- 또한 해양으로 유입되는 유해물질에 대한 독성실험을 위하여 산업폐수오니를 채취하여 독성실험에 이용하였다. 채취된 오니는 냉장 상태로 운반하여 폐기물공정시험법에 따라 용출하였으나, 상기 오니가 해양으로 투기되어 해양생물에 미치는 영향을 구명하고자 하므로 모래 및 카본필터로 여과한 자연해수를 0.
- 시험 시작시 각 시험구별로 염분, 수온, 용존산소 및 pH를 측정하여 독성시험지에 기록하였다. 섬모충의 개체군성장률을 측정하기 위하여 24시간 간격으로 시험용기에서 2 mL의 시료를 채취하여 Lugol 용액으로 고정한 후 현미경하에서 섬모충의 개체수를 계수하였다. 개체군성장률(r)은 r=(lnNt-lnNo)/t (r=개체군성장률, Nt= 실험 종료 후의 세포밀도, No=초기세포밀도, t=배양시간)의 식으로 구하였다.
- 지수성장기의 시험생물을 50 mL 시험용액에 초기 세포농도가 약 50~100 cells/mL이 되도록 접종한 후 f/2 영양배지를 넣어주었으며, 시험생물 접종시 각 시험구마다 최소 3회 이상 나누어 접종하였다. 시험 시작시 각 시험구별로 염분, 수온, 용존산소 및 pH를 측정하여 독성시험지에 기록하였다. 섬모충의 개체군성장률을 측정하기 위하여 24시간 간격으로 시험용기에서 2 mL의 시료를 채취하여 Lugol 용액으로 고정한 후 현미경하에서 섬모충의 개체수를 계수하였다.
- 지수성장기의 시험생물을 50 mL 시험용액에 초기 세포농도가 약 50~100 cells/mL이 되도록 접종한 후 f/2 영양배지를 넣어주었으며, 시험생물 접종시 각 시험구마다 최소 3회 이상 나누어 접종하였다. 시험 시작시 각 시험구별로 염분, 수온, 용존산소 및 pH를 측정하여 독성시험지에 기록하였다.
- 채취된 오니는 냉장 상태로 운반하여 폐기물공정시험법에 따라 용출하였으나, 상기 오니가 해양으로 투기되어 해양생물에 미치는 영향을 구명하고자 하므로 모래 및 카본필터로 여과한 자연해수를 0.45 μm membrane filter로 재여과하여 용출하였다.
- 하수오니 추출은 여과해수(26.2~28.0 psu)와 오니의 비율을 10:1(V:W)로 혼합하여, 진탕기(JEIO TECH, Korea)로 6시간 동안 잘 흔든 후 용출된 폐수는 GF/C 필터(0.45 μm, Whatman, USA)로 여과하여 실험에 사용하였다.
- 혼합영양 생물인 M. rubrum의 독성물질에 대한 민감도를 검증하기 위하여, 우선 ISO (1995)에서 제시한 식물플랑크톤의 표준독성물질인 Potassium dichromate (K2Cr2O7, Merck, Germany)를 사용하였으며, 동물플랑크톤의 표준독성물질인 copper chloride (CuCl2 , Aldrich, USA)를 이용하여 개체군성장저해율을 측정하였다. 농도별 표준용액은 최고 농도의 표준용액을 제조한 후 이를 순차적으로 희석하였으며, 대조구를 포함하여 6개 농도 구간에서 각각의 농도별로 살아있는 개체를 계수하여 72시간 개체군성장률(EC50)을 측정하였다(이 등, 2008a).
대상 데이터
- 따라서 해양으로 배출되는 미지의 독성물질에 대하여 해양생태계를 구성하는 생산자와 소비자의 영향을 동시에 평가하기 위하여 동·식물적 특성을 모두 갖고 있는 해양섬모충류인 M. rubrum 종을 표준시험생물 후보 종으로 선정하였다.
- rubrum은 항온온도 15℃에서 배양하였으며, 조도는 형광등을 이용하여 60 μEm-2s-1로 연속명기를 유지하였고 영양배지는 f/2 배지를 이용하였다(Table 1). 본 실험과 비교 대상으로 이용된 식물플랑크톤 6종, 저서성요각류인 Tigriopus japonicus, 그리고 윤충류인 Brachionus plicatilis는 국내 표준시험종으로 선정되어 광범위하게 이용되는 종으로 판단되어 본 결과의 비교 대상으로 선정하였다 (박 등, 2008b; 이 등, 2008a; 이 등, 2008b).
- 0%)를 제조하여 3 반복으로 실험하였다. 시험용기는 70 mL 폴리카보네이트 병을 이용하였으며, 시험용액을 각 농도별로 50 mL씩 시험용기에 분주하였다.
- 해양섬모충류인 M. rubrum은 전 세계 연안에 널리 분포하는 종으로, 본 시험에 사용된 종은 서해연안의 곰소만(35°40´N, 126°40´E)에서 채집되었으며, 군산대학교 해양과학대학 해양학과 이원호 교수 실험실에서 5년 이상 단일종 배양을 통하여 실험실에서 보유하고 있는 M. rubrum (strain MR-MAL01)으로 독성실험을 실시하였다(Yih 등, 2004).
데이터처리
- 05에서 검증하였다. 상기 자료분석은 독성자료 처리 프로그램인 TOXCALC (Tidepool Scientific Software, USA)을 이용하였다.
- 성장률 자료는 Shapiro-Wilk's test (1965)로 자료의 정규분포를 그리고 Bartlett's test (Snedecor와 Cochran, 1989)로 분산의 동일성을 검증하였으며, NOEC (No observed effective concentration)와 LOEC(Lowest observed effective concentration)의 산출은 Dunnett's test (1964)를 이용하여 유의수준 α=0.05에서 검증하였다.
이론/모형
- (50% population growth inhibition concentration)을 계산하였다. 계산 방법은 각 실험구에서의 개체군성장률을 계산한 후 Linear interpolation 방법으로 EC50을 산정하였다. 성장률 자료는 Shapiro-Wilk's test (1965)로 자료의 정규분포를 그리고 Bartlett's test (Snedecor와 Cochran, 1989)로 분산의 동일성을 검증하였으며, NOEC (No observed effective concentration)와 LOEC(Lowest observed effective concentration)의 산출은 Dunnett's test (1964)를 이용하여 유의수준 α=0.
성능/효과
- 가장 강한 독성을 나타낸 피혁공장폐수오니에서 해양섬모충인 M. rubrum의 72h-EC 50 =1.83%로 가장 민감한 반응을 보였으며, 그 다음으로 민감한 종은 규조류인 S. costatum으로 72h-EC50=3.84%로 나타났다 (Table 4). 가장 둔감한 종은 저서요각류인 T.
- 84%로 나타났다 (Table 4). 가장 둔감한 종은 저서요각류인 T. japonicus와 윤충류인 B. plicatilis로 48시간 LC50이 각각 36.20%, 36.99%로 나타났다. 따라서 해양섬모충은 다른 시험생물과 비교하여 해양투기 물질인 산업폐수오니의 추출액 독성시험에서 가장 민감한 종으로 나타났으며, 가장 둔감했던 윤충류보다 20배정도 민감한 결과를 보였다(Table 4).
- 따라서 현재 해양투기가 이루어지고 있는 산업폐수오니(피혁, 염색, 염료)를 이용하여 섬모충, 규조류, 해조류, 윤충류, 저서요각류, 어류를 대표하는 6종에 대한 독성실험을 실시하였다. 동일 물질에 대한 6종의 독성실험결과, 섬모충은 다른 5종에 비하여 독성 민감도가 가장 높거나 또는 가장 민감도가 높은 다른 시험종과 유사한 민감도를 보였다.
- 그러나 상기 생물은 생태계의 분해자, 생산자 및 소비자를 각각 대표하는 생물군으로서 어느 한 종의 실험결과가 다른 종의 실험 결과를 대변할 수 없는 상호 독립된 결과를 보인다. 따라서 생리, 생태적으로 동물 및 식물적 특성을 모두 지닌 M. rubrum은 독성시험시 동물 및 식물적 특성을 모두 반영할 수 있다는 장점이 있다. 따라서 본 연구의 목적은 상기 생물종이 해양생태계의 유해물질에 대한 동·식물학적 특성을 모두 반영할 수 있는 해양생태독성 평가용 표준시험생물로서의 가능성을 규명하는데 있다.
- 따라서 해양섬모충류인 M. rubrum은 해산 윤충류 및 식물플랑크톤과 비교하여 표준독성물질인 copper chloride와 potassium dichromate에 대한 민감도가 가장 높은 것으로 나타났다(Table 2, Table 3).
- 99%로 나타났다. 따라서 해양섬모충은 다른 시험생물과 비교하여 해양투기 물질인 산업폐수오니의 추출액 독성시험에서 가장 민감한 종으로 나타났으며, 가장 둔감했던 윤충류보다 20배정도 민감한 결과를 보였다(Table 4).
- 또한 해양생태계의 주요 생산자인 식물플랑크톤과 섬모충의 독성 민감도 비교를 위하여 표준독성물질인 potassium dichromate에 대한 개체군성장률저해 실험을 실시한 결과, 섬모충이 다른 6종의 식물플랑크톤보다 더 민감한 것으로 나타났다. M.
- 31) mg/L로 가장 낮은 농도에서 반수개체군성장저해를 보였다. 식물플랑크톤중 가장 민감한 종인 규조류 Skeletonema costatum의 EC50은 3.05(2.27-3.32) mg/L로 M. rubrum 보다 2배 높은 농도에서 반수개체군성장저해를 보였고, 가장 둔감한 종인 Tetraselmis suecica의 EC50은 9.40(8.83-9.99) mg/L로 6배 이상 높은 농도에서 반수개체군성장저해를 보임으로서 M. rubrum의 민감도가 가장 높은 것으로 나타났다. 즉 식물플랑크톤 6종의 EC50보다 더 낮은 농도에서 반수개체군성장률저해를 보임으로써 섬모충이 표준독성물질에 대한 민감도가 시험 대상종중 가장 높은 것으로 나타났다(Table 3, Fig.
- rubrum의 민감도가 가장 높은 것으로 나타났다. 즉 식물플랑크톤 6종의 EC50보다 더 낮은 농도에서 반수개체군성장률저해를 보임으로써 섬모충이 표준독성물질에 대한 민감도가 시험 대상종중 가장 높은 것으로 나타났다(Table 3, Fig. 1).
- )를 산출한 결과, 대부분의 시험생물군에서 피혁공장폐수오니의 독성이 가장 강하게 나타났으며, 그 다음으로 염색공장폐수오니, 염료공장폐수오니 순으로 강한 독성을 보였다. 즉, 서로 다른 생물군을 이용한 생물검정실험에서 해양으로 유입되는 오염물질에 대한 독성결과가 뚜렷하게 구분되었다(Table 4).
- rubrum은 매우 유용한 독성시험용 표준생물로 생각된다. 특히 시험생물의 민감도가 다른 시험생물에 비하여 가장 높았으며, 실제 해양오염물질에 대한 독성 정도의 판별력 및 일관성이 뚜렷하여 시험 생물로서의 가능성이 높은 것으로 판단된다.
- 피혁공장폐수오니, 염색공장폐수오니, 염료공장폐 수오니에 대한 각 시험종의 반수개체군성장률저해농도(EC50) 또는 반수치사농도(LC50)를 산출한 결과, 대부분의 시험생물군에서 피혁공장폐수오니의 독성이 가장 강하게 나타났으며, 그 다음으로 염색공장폐수오니, 염료공장폐수오니 순으로 강한 독성을 보였다. 즉, 서로 다른 생물군을 이용한 생물검정실험에서 해양으로 유입되는 오염물질에 대한 독성결과가 뚜렷하게 구분되었다(Table 4).
- 해양생태계의 1차 소비자인 동물플랑크톤과 섬모충의 독성 민감도 비교를 위하여 표준독성물질인 copper chloride에 대한 개체군성장률저해 실험을 실시한 결과, M. rubrum의 72h-EC50은 0.38 (0.37-0.38) mg/L로, 해산 윤충류 Brachionus plicatilis의 48h-EC50인 0.48 (0.47-0.49) mg/L 보다 더 낮은 농도에서 반수개체군성장률저해를 보임으로써 표준물질에 대한 독성 민감도가 윤충류보다 더 높은 것으로 나타났다 (Table 2).
후속연구
- 많은 연구자들이 섬모충류를 독성시험시 battery test의 일환으로 이용할 것을 제시해 왔다 (Rojickova-Padrtova 등, 1998; Novotny 등, 2006). 따라서 섬모충류를 이용한 많은 국제적 연구 결과를 고려할 때 아래의 문제점만 보완된다면 매우 경제적인 표준시험종으로 이용될 수 있을 것으로 판단된다.
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