항원의 투여방법 및 사육환경 변화에 따른 넙치의 특이항체 반응 The specific antibody response of olive flounder Paralichthys olivaceus to route of antigen administration and change in environmental conditions원문보기
본 구에서는 백신을 넙치 양식 현장에 적용하기 위한 기초연구로서 항원의 투여방법 및 항원 투여 후 사육환경 변화에 따른 넙치의 특이 항체 반응에 대한 영향을 조사하였다. 항원의 투여방법에 따른 항체 반응을 조사하기 위해 넙치에 BSA를 복강 및 근육 주사한 후 주기적으로 혈액을 취해 BSA에 대한 항체기를 측정한 결과, 근육 주사법이 복강 주사법보다 항체형성 초기시점에서 약간 높은 항제기를 나타났으나 그 이후의 항체 반응에는 유의적인 차이가 관찰되지 않아, 백신을 투여하는 방법으로 근육주사법 뿐만 아니라 복강 주사법도 유용하게 사용될 수 있을 것으로 사료되었다. 사육환경 변화에 따른 백신의 영향을 조사하기 위해 BSA를 면역시킨 넙치에 사육수온의 급하강, handling 및 중유에 노출시킨 후 항체기를 측정한 결과, 수온변화 및 handling 실험구가 양성 대조구보다 항체형성 초기시점에서 약간 높은 항체기를 나타났으나, 그 이후의 항체 반응에는 서로간의 유의적인 치아는 관찰되지 않아, 위의 환경 변화는 넙치의 특이 항체반응에 영향을 거의 끼치지 않는 것으로 확인되었다. 이상의 결과, 넙치 양식현장에서 백신은 일시적인 수온변화, 중유노출 및 handling에 의한 환경변화에서도 유용하게 사용 될 수 있을 것으로 사료되었다.
본 구에서는 백신을 넙치 양식 현장에 적용하기 위한 기초연구로서 항원의 투여방법 및 항원 투여 후 사육환경 변화에 따른 넙치의 특이 항체 반응에 대한 영향을 조사하였다. 항원의 투여방법에 따른 항체 반응을 조사하기 위해 넙치에 BSA를 복강 및 근육 주사한 후 주기적으로 혈액을 취해 BSA에 대한 항체기를 측정한 결과, 근육 주사법이 복강 주사법보다 항체형성 초기시점에서 약간 높은 항제기를 나타났으나 그 이후의 항체 반응에는 유의적인 차이가 관찰되지 않아, 백신을 투여하는 방법으로 근육주사법 뿐만 아니라 복강 주사법도 유용하게 사용될 수 있을 것으로 사료되었다. 사육환경 변화에 따른 백신의 영향을 조사하기 위해 BSA를 면역시킨 넙치에 사육수온의 급하강, handling 및 중유에 노출시킨 후 항체기를 측정한 결과, 수온변화 및 handling 실험구가 양성 대조구보다 항체형성 초기시점에서 약간 높은 항체기를 나타났으나, 그 이후의 항체 반응에는 서로간의 유의적인 치아는 관찰되지 않아, 위의 환경 변화는 넙치의 특이 항체반응에 영향을 거의 끼치지 않는 것으로 확인되었다. 이상의 결과, 넙치 양식현장에서 백신은 일시적인 수온변화, 중유노출 및 handling에 의한 환경변화에서도 유용하게 사용 될 수 있을 것으로 사료되었다.
The specific antibody response of olive flounder, Paralichthys olivaceus to change in rearing-environmental conditions post immunization with antigen (bovine serum albumin, BSA) and different routes of antigen administration were investigated by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). To test the...
The specific antibody response of olive flounder, Paralichthys olivaceus to change in rearing-environmental conditions post immunization with antigen (bovine serum albumin, BSA) and different routes of antigen administration were investigated by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). To test the effect of routes of antigen administration, flounder were injected intraperioneally or intramuscularlly with 1 mg of BSA. In addition, to test the effect of change in environmental condition post immunization, flounder were injected intraperioneally with 1 mg of antigen, and then were exposed to acute thermal change (the water temperature (WT) was decreased from $21^{\circ}C$ to $15^{\circ}C$ within 30 min and maintained at $15^{\circ}C$ for 3 h), handling (fish were caught and subsequently held out of water for 1 min) or heavy oil (76 g/200 L for 2 days). Consequently, there was no significant difference between intraperioneal (IP) and intramuscular (IM) injections except at 10 days post-immunization. With these results, it suggests that both 1M and IP injections may be used as route of vaccination. Furthermore, no significant difference was observed in the antibody response among the groups exposed to heavy oil, handling, sudden drop of WT and positive control except at 10 days post-immunization. From these results, it was confirmed that specific antibody response was not affected by the above mentioned rearing-environmental conditions, suggesting that vaccination can be employed at changing rearing-environmental conditions.
The specific antibody response of olive flounder, Paralichthys olivaceus to change in rearing-environmental conditions post immunization with antigen (bovine serum albumin, BSA) and different routes of antigen administration were investigated by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). To test the effect of routes of antigen administration, flounder were injected intraperioneally or intramuscularlly with 1 mg of BSA. In addition, to test the effect of change in environmental condition post immunization, flounder were injected intraperioneally with 1 mg of antigen, and then were exposed to acute thermal change (the water temperature (WT) was decreased from $21^{\circ}C$ to $15^{\circ}C$ within 30 min and maintained at $15^{\circ}C$ for 3 h), handling (fish were caught and subsequently held out of water for 1 min) or heavy oil (76 g/200 L for 2 days). Consequently, there was no significant difference between intraperioneal (IP) and intramuscular (IM) injections except at 10 days post-immunization. With these results, it suggests that both 1M and IP injections may be used as route of vaccination. Furthermore, no significant difference was observed in the antibody response among the groups exposed to heavy oil, handling, sudden drop of WT and positive control except at 10 days post-immunization. From these results, it was confirmed that specific antibody response was not affected by the above mentioned rearing-environmental conditions, suggesting that vaccination can be employed at changing rearing-environmental conditions.
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문제 정의
넙치 양식장에서 백신의 사용은 감염성 질병을 예방함에 있어 유용한 방법이지만 현재까지 백신의 투여 시기와 방법, 투여농도 및 처리기간 등에 대해서는 불명확한 상태이며 또한 사육환경 변화에 따른 백신의 영향을 조사한 연구는 부족한 실정이다 본 연구에서는 백신을 넙치 양식 현장에 적용하기 위한 기초연구로서 항원의 투여방법 및 사육 환경 변화에 따른 넙치의 특이 항체 반응에 대한 영향을 검토하였다.
본 연구에서는 백신을 넙치 양식 현장에 적용하기 위한 기초연구로서 항원의 투여방법 및 사육환경 변화에 따른 넙치의 항체 반응에 대한 영향을 확인하기 위하여, 항원으로서 bovine serum albumin (BSA) 을복강 및 근육 주사한 후 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)로 BSA에 대한 특이 항체가의 변화를 조사하였으며, 또한BSA를 면역시킨 넙치에 사육 수온 변화, handling 및 중유에 노출시킨 후 항체 가의 변화를 조사하였다.
제안 방법
05% 포함된 PBS (T-PBS)로 3번 세척하였고 5% skim milk를 380 μ1씩 넣어 20℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 1차 항체로는 넙치 혈청을 5% skim milk로 희석 (100배)하여 1시간 반응시킨 후 시료 당 2개의 well에 50 μ1씩 분주하였고 2차 항체로서는 5% skim milk로 10배 희석된 항 넙치 immunoglobulin M (IgM) monoclonal anitbody (M7C3-4, Shin et al., 2007)를 50 U1 씩 분주하였으며, 3 차 항체로서 5% skim milk로 1000배 희석된 peroxidase conjugated 항 마우스 IgG 돼지 혈청 (DakoCytomation, Denmark)을 50 μ1씩 분주하였다. 각각의 항체 반응은 20℃에서 1시간 동안 반응하였다.
수온변화 실험구는 유수되는 물을 정지시킨 후 21 ℃의 사육수온을 30분 만에 15℃로 급하강 시켜 3시간 유지시킨 후 사육수를 다시 유수 시키는 방법으로 2일간2회 실시하였다. Handling 실험 구는 넙치를 뜰채로 포획하여 공기 중에 1분간 노출시킨후 실험수조에 다시 수용하는 방법으로 2일간 2회 실시하였다 중유노출 실험구는 유수되는 물을 정지시킨 후 200 L의 사육수에 중유 76 g 넣어 넙치를 2일간 사육한 후 무처리 사육수로 유수시켰다. 양성대조 구는 넙치에 1 mg BSA/ 200 pl 농도로 조정하여 복강에 주사하였으며, 음성 대조구는 넙치의 복강에 PBS를 200 ill 주사하였다.
각각의 항체 반응은 20℃에서 1시간 동안 반응하였다. T-PBS로 5번 수세하였고 ELISA 발색액 (100 mM NazHPQi, 50 mM citric acid, 1 mg/ mL o-phenylenediamine, 0.03% H2O2)을 각 well에 50 μ1씩분주한 후 20 C 에서 15분 동안 발색하였다 각 well에 2N를 50 ill씩 넣어 발색 반응을 중지시킨 후 ELISA plate reader (Spectra max 340, USA) 로 492 nm 에서 OD값을 측정하였다.
각각의 넙치는 개체별로 구별할 수 있게 tagging 하였으며, 해수 200 L 가 들어있는 FRP 사각수조 7개에 각 5마리씩 수용하였다. 사육수는 분당 5 L로 유수되도록 조정하였고 공기공급 장치를 통해 산소를 공급하였으며, 사료 투여는 시판 사료 (경원사료, 한국)를 사용하여 1일 2회 만복공급 하였다. 80일간의 실험기간 동안 사육수온은 2 1℃에서 8℃로 천천히 낮아졌다 (Fig.
사육환경 변화에 따른 넙치의 특이 항체 반응에 대한 영향을 조사하기 위하여, 넙치에 1 mg BSA/ 200 U1 농도로 조정하여 복강에 주사한 후 2일째부터 수온 변화 handling 및 중유 노출을 통해 사육환경을 변화시켰다. 수온변화 실험구는 유수되는 물을 정지시킨 후 21 ℃의 사육수온을 30분 만에 15℃로 급하강 시켜 3시간 유지시킨 후 사육수를 다시 유수 시키는 방법으로 2일간2회 실시하였다.
사육환경 변화에 따른 항체반응의 영향을 조사하기 위해 BSA를 면역시킨 넙치에 사육수온 변화, handling 및 중유에 노출시킨 후 주기 적으로 혈액을 취해 BSA에 대한 항체가를 측정하였다 (Fig. 3). 급격한 수온하강의 경우, 1 개체를 제외하고는 양성 대조구 (Fig.
수온변화 실험구는 유수되는 물을 정지시킨 후 21 ℃의 사육수온을 30분 만에 15℃로 급하강 시켜 3시간 유지시킨 후 사육수를 다시 유수 시키는 방법으로 2일간2회 실시하였다. Handling 실험 구는 넙치를 뜰채로 포획하여 공기 중에 1분간 노출시킨후 실험수조에 다시 수용하는 방법으로 2일간 2회 실시하였다 중유노출 실험구는 유수되는 물을 정지시킨 후 200 L의 사육수에 중유 76 g 넣어 넙치를 2일간 사육한 후 무처리 사육수로 유수시켰다.
실험구 및 대조구의 넙치로부터 0, 10, 20, 30, 40, 60, 80일째 미부정맥에서 채혈하여 원심분리 (6000 rpm, 4℃, 20 min)를 통해 혈청을 분리하였다. 분리된 혈청은 실험에 사용하기 전까지 -20℃에 보관하였다
USA)를 넙치에 투여하였다. 실험구는 BSA >1 mg/200 pl 농도로 넙치의 복강 및 근육에 주사하였으며, 대조구는 위와 동일한 방법으로 PBS를 200 μ1씩 주사하였다 면역에 사용된 항원의 농도는 상업적으로 시판되고 있는 넙치의 연쇄구균 백신 (대성미생물연구소 한국)의 사용 농도를 기준으로 설정하였으며 또한 김 등 (2011)의 연구에서 BSA에 대한 특이 항체가가 넙치에서 생성되는 농도로 설정하였다.
Handling 실험 구는 넙치를 뜰채로 포획하여 공기 중에 1분간 노출시킨후 실험수조에 다시 수용하는 방법으로 2일간 2회 실시하였다 중유노출 실험구는 유수되는 물을 정지시킨 후 200 L의 사육수에 중유 76 g 넣어 넙치를 2일간 사육한 후 무처리 사육수로 유수시켰다. 양성대조 구는 넙치에 1 mg BSA/ 200 pl 농도로 조정하여 복강에 주사하였으며, 음성 대조구는 넙치의 복강에 PBS를 200 ill 주사하였다.
항원의 투여방법에 따른 넙치의 특이 항체 반응을 조사하기 위해 복강 및 근육 주사법을 통해 BSA (Sigma, USA)를 넙치에 투여하였다. 실험구는 BSA >1 mg/200 pl 농도로 넙치의 복강 및 근육에 주사하였으며, 대조구는 위와 동일한 방법으로 PBS를 200 μ1씩 주사하였다 면역에 사용된 항원의 농도는 상업적으로 시판되고 있는 넙치의 연쇄구균 백신 (대성미생물연구소 한국)의 사용 농도를 기준으로 설정하였으며 또한 김 등 (2011)의 연구에서 BSA에 대한 특이 항체가가 넙치에서 생성되는 농도로 설정하였다.
항원의 투여방법에 따른 항체 반응을 조사하기 위해 BSA를 넙치의 복강 및 근육에 주사 한 후 주기적으로 혈액을 취해 BSA에 대한 항체가를 측정하였다 (Fig. 2). 복강주사의 경우, 개체별로 차이를 보였으나 BSA 접종 후 10일째부터 특이 항체가를 나타내는 개체가 확인되었고 (OD값 0.
대상 데이터
실험에 사용하였다. 각각의 넙치는 개체별로 구별할 수 있게 tagging 하였으며, 해수 200 L 가 들어있는 FRP 사각수조 7개에 각 5마리씩 수용하였다. 사육수는 분당 5 L로 유수되도록 조정하였고 공기공급 장치를 통해 산소를 공급하였으며, 사료 투여는 시판 사료 (경원사료, 한국)를 사용하여 1일 2회 만복공급 하였다.
실험어는 전라남도 여수시에 위치한 전남대학교수산과학 연구소에서 사육 중인 넙치 (체증 140~200 g)를 실험에 사용하였다. 각각의 넙치는 개체별로 구별할 수 있게 tagging 하였으며, 해수 200 L 가 들어있는 FRP 사각수조 7개에 각 5마리씩 수용하였다.
데이터처리
항체 검출 ELISA로 얻은 결과는 SPSS (Statistical Package for the Social Sciences, Ver. 18) 프로그램을 이용하여 ANOVA# 시행하였고, 사후분석으로 수온구간별 시간경과에 따른 항체가의 유의적인 차이를 확인하기 위해 Tukey test를 실시하였다 ㎛0.05).
이론/모형
BSA에 대한 특이 항체가를 측정하기 위하여 Kim et al. (2007)과 김 등 (2009)의 방법에 준해 항체검출 ELISA를 실시하였다. ELISA plate (Nunc, Denmark) 에 5 "g BSA/ 50 μ1를 각 well에 분주한 후 37℃에서 overnight하여 항원을 coating 하였다.
성능/효과
2A). 그 후 항체가는 천천히 떨어지기 시작하여 면역 80일째는 OD값이 0.53~ 3.13로 감소되었다 근육주사의 경우 모든 개체에서 면역 10일째부터 특이 항체가가 관찰되었고 (OD값 0.55-0.7), 20일~30일에 가장 높은 항체가 (。。값 0.87 ~3.67)가 관찰되었다 (Fig. 2B). 항체가는 20일과 30일을 기점으로 천천히 떨어지기 시작하였으며 면역 80일째는 OD값이 0.
이와 같이 사육환경의 변화는 넙치의 면역능을 저하시킬 수 있다. 그러나 본연구의 결과에서는 항체형성 초기시점에서 수온변화 및 handling 실험구에서 약간 높은 항체가가 나타났으나 그 이후의 항체 반응에는 유의적인 차이가 관찰되지 않0k 본 연구에서 설정된 환경변화는 넙치의 특이항체 반응에 영향을 거의 끼치지 않는 것으로 확인되었다 이상의 결과 넙치 양식현장에서 백신은 일시적인 수온변화 중유노출 및 handlingofl 의한 환경변화에서도 유용하게 사용 될 수 있을 것으로 사료된다.
2A)와 유사한 패턴의 항체가가 관찰되었다 (Fig 3A). 면역 10일째부터 BSA에 대한 특이 항체가가 관찰되었고 (OD값 0.26-0.31), 30일~40일에 가장 높은 항체가 (OD값 1.84~3.62)가 나타났으며, 항체가는 약 40일을 기점으로 천천히 떨어지기 시작하여 면역 80일째는 0.94~3.16의 OD값이 관찰되었다. Handling의 경우 모든 개체에서 면역 10일째부터 특이 항체가가 관찰되었고 (OD값 0.
2A, 2B). 복강주사와 근육주사 실험구를 대상으로 시간경과에 따른 항체가를 ANOVA로 분석한 결과에서는 항체형성 초기시점인 10일째에 서로 간에 유의적인 차이가 관찰되었으나 S0.05), 20일 경과 후에는 유의적인 차이가 관찰되지 않았다 (P>0.05) (Fig. C). Ellis (1998)는 근육 주사법은 복강 주법보다 약간 높은 항체가를 유도한다고 보고하였다 본 연구에서도 근육 주사법이 복강 주사법보다 항체형성 초기시점에서 약간 높은 항체 가를 나타났으나 그 이후의 항체 반응에는 유의적인 차이가 관찰되지 않아 넙치 양식 현장에서 백산을 투여하는 방법으로 근육 주사법뿐만 아니라 복강 주사법도 유용하게 사용될 수 있을 것으로 사료된다.
2). 복강주사의 경우, 개체별로 차이를 보였으나 BSA 접종 후 10일째부터 특이 항체가를 나타내는 개체가 확인되었고 (OD값 0.18), 30일~40일에는 모든 개체 (5개체)에서 가장 높은 항체가 (OD값 1.29- 3.38)가 관찰되었다 (Fig. 2A). 그 후 항체가는 천천히 떨어지기 시작하여 면역 80일째는 OD값이 0.
본 연구에서는 백신을 넙치 양식 현장에 적용하기 위한 기초연구로서 항원의 투여방법 및 항원 투여 후 사육환경 변화에 따른 넙치의 특이 항체 반응에 대한 영향을 조사하였다 항원의 투여방법에 따른 항체 반응을 조사하기 위해 넙치에 BSA를 복강 및 근육 주사한 후 주기적으로 혈액을 취해 BSA에 대한 항체 가를 측정한 결과, 근육 주사법이 복강 주사법보다 항체형성 초기시점에서 약간 높은 항체가를 나타났으나 그 이후의 항체 반응에는 유의적인 차이가 관찰되지 않아 백신을 투여하는 방법으로 근육 주사법뿐만 아니라 복강 주사법도 유용하게 사용될 수 있을 것으로 사료되었다 사육환경 변화에 따른 백신의 영향을 조사하기 위해 BSA를 면역시킨 넙치에 사육수온의 급하강, handling 및 중유에 노출시킨 후 항체 가를 측정한 결과, 수온변화 및 handling 실험 구가 양성 대조구보다 항체형성 초기시점에서 약간 높은 항체가를 나타났으나, 그 이후의 항체 반응에는 서로 간의 유의적인 차이는 관찰되지 않아 위의 환경변화는 넙치의 특이 항체반응에 영향을 거의 끼치지 않는 것으로 확인되었다. 이상의 결과, 넙치 양식 현장에서 백신은 일시적인 수온변화, 중유노출 및 handling에 의한 환경변화에서도 유용하게 사용 될 수 있을 것으로 사료되었다.
위의 실험구와 양성대조구를 대상으로 시간경과에 따른 항체가를 ANOVA로 분석한 결과에서는 항체형성 초기시점인 10일째에 양성대조구와 수온하강 실험구 및 양성대조구와 handling 실험구의 항체가에 유의적인 차이가 관찰되었으나 00.05) (Fig. 3D).
것으로 확인되었다. 이상의 결과, 넙치 양식 현장에서 백신은 일시적인 수온변화, 중유노출 및 handling에 의한 환경변화에서도 유용하게 사용 될 수 있을 것으로 사료되었다.
2B). 항체가는 20일과 30일을 기점으로 천천히 떨어지기 시작하였으며 면역 80일째는 OD값이 0.59 ~2.89로 감소되었다. 대조 구의 넙치에서는 모든 개체에서 BSA에 대한 항체가가 검출되지 않았다 (Fig.
3B). 항체가는 약 30일을 기점으로 천천히 떨어지기 시작하였으며 면역 80일째는OD값이 1.97-3.42 로 감소되었다 중유에 노출된 경우는 면역 10일째 까지 0.09의 이하의 OD값이 관찰되었으나 30일~40일 에는 가장 높은 항체가 (OD값 0.95 ~2.98)가 관찰되었다 (Fig. 3Q.
참고문헌 (29)
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