[논문]발효두부 제조용 Starter의 선발과 이를 이용한 두부의 발효특성

강경명; 이신호

doi:10.3746/jkfn.2012.41.11.1626

발효두부 제조용 Starter의 선발과 이를 이용한 두부의 발효특성
Physiological Characteristics of Starter Isolated from Kimchi and Fermentation of Tofu with Isolated Starter 원문보기

한국식품영양과학회지 = Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition, v.41 no.11, 2012년, pp.1626 - 1631

강경명 (대구가톨릭대학교 식품가공학과) , 이신호 (대구가톨릭대학교 식품가공학과)

초록
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김치 및 젓갈류에서 probiotics의 기능을 갖는 유산균을 분리하여 발효두부 제조용 starter로 선별하여 김치양념을 이용한 발효두부 제조 가능성을 검토하였다. 분리한 60균주의 병원성균에 대한 항균활성과 인공위액 및 담즙산에 대한 내성이 우수한 균주 KL-6를 선발하였다. 최종 선발된 KL-6의 배양액의 DPPH free radical 소거능을 측정한 결과 성장에 따라 항산화 활성이 증가하였고, 16S rRNA 염기서열 분석에 의해 동정한 결과 P. acidilactici KL-6(100%)로 확인되었다. 김치 양념과 혼합한 두부(Control)와 선발유산균을 starter로 접종(2%, v/v)하여 김치 양념과 혼합한 두부(TL) 그리고 starter를 접종하여 $37^{\circ}C$에서 24시간 동안 전 발효시킨 김치 양념과 혼합한 두부(TPL)의 발효 특성을 비교하였다. pH는 발효 1주 경과 후 모든 처리구에서 감소하였고, 발효 14주에 각 처리구별 pH는 3.96(control), 3.97(TL), 4.03(TPL)이었다. 유산발효두부의 총균수는 발효 2주까지 모든 처리구에서 증가하였으며, 이후 감소하는 경향을 나타내었다. 유산균수의 경우 TL 및 TPL구는 발효 1주째, 대조구는 발효 2주째 $10^6$ CFU/g에 도달하였으며, 발효가 진행됨에 따라 각 처리구 공히 감소하여 발효 14주째 $10^3$ CFU/g을 나타내었다. 대장균군수의 경우 대조구는 발효 1주일째까지 관찰되었으나, TL및 TPL구는 발효 1주째부터 관찰되지 않았다. 기호성은 TL구와 TPL구가 맛, 향, 조직감, 종합적 기호도에서 대조구보다 높았으며, TPL구가 가장 우수하였다.

Abstract ▼ AI-Helper

Sixty strains of lactic acid bacteria were isolated from kimchi and used as a starter for fermented tofu. Among the isolated strains, strain KL-6 showed antimicrobial activity against various pathogens, antioxidative activity, and viability in artificial gastric juice and artificial bile acid. The selected strain KL-6 was identified as Pediococcus acidilactici KL-6 by morphological and physiological tests, including Gram staining, catalase test, and 16S rRNA sequencing. The fermentation characteristics of tofu with a kimchi ingredient mixture (Control) consisting of red pepper, garlic, ginger, sugar, salt, jeotgal, and juice of chinese cabbage were compared with those of tofus inoculated with strain KL-6 and the kimchi ingredient mixture (TL) or a pre-fermented kimchi ingredient mixture (TPL) for 24 hr at $37^{\circ}C$. The pH levels of all tested tofu samples decreased after 1 week of fermentation, reaching 3.96 (control), 3.97 (TL), and 4.03 log cfu/g (TPL) after fermentation for 14 weeks at $20^{\circ}C$. Total aerobe content of fermented tofu increased until 2 weeks of fermentation, but decreased steadily thereafter. The number of lactic acid bacteria reached $10^6$ cfu/g after 1 week of fermentation in TL and TPL, whereas it took 2 weeks for the control. The number of lactic acid bacteria in all tested tofu samples reached $10^3$ cfu/g after 14 weeks of fermentation at $20^{\circ}C$. Coliform bacteria were not detected in TL or TPL after 1 week of fermentation. The sensory scores of TL and TPL were higher than that of control in terms of taste, flavor, texture, and overall acceptability. The sensory quality of TPL was the best among all tested fermented tofu samples.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구는 곰팡이에 의한 발효과정을 거치지 않고 우리나라 고유의 발효식품인 김치와 접목하여 두부발효의 가능성을 검토하고자 식물유래 probiotic 기능을 가지는 유산균을 선발하고, 선발된 유산균과 김치양념을 사용하여 두부를 담금·숙성한 유산발효두부 제조의 가능성을 검토하였다.

제안 방법

α,α-Diphenyl-β-picrylhydrazyl(DPPH) radical 소거능은 Blois(16)의 방법을 변형하여 상등액 0.4 mL에 0.4 mM DPPH 0.8 mL를 혼합하고, 10분간 방치 후 525 nm에서 흡광도(Pharmacia Biotech Ultrospec 1000, Cambridege, UK)를 측정하였으며 계산식, DPPH radical scavenging ability(%)＝100－[(O.D of sample/ O.D of control)×100]에 의하여 산출하였다.
pH 측정은 마쇄한 시료를 여과지(Whatman No. 2, Maidstone, England)로 여과하여 pH meter(ORION 410A, Orion Research Inc, Boston, MA, USA)로 측정하였다. 미생물수는 시료 10 g에 멸균 증류수 90 mL를 첨가하여 stomacher(LB W400, TMC, Seoul, Korea)를 이용하여 마쇄한 시료 1 mL를 무균적으로 취하여 총균수는 plate count agar(Difco), 유산균수는 0.
경북지역에서 수집한 김치를 사용하여 0.02% sodium azide를 함유한 MRS agar(Difco, Detroit, MI, USA)에 도말하고, 37°C에서 24시간 배양 후 나타난 독립된 colony 중 특징적인 colony를 순수 분리하였다.
김치 및 젓갈류에서 probiotics의 기능을 갖는 유산균을 분리하여 발효두부 제조용 starter로 선별하여 김치양념을 이용한 발효두부 제조 가능성을 검토하였다. 분리한 60균주의 병원성균에 대한 항균활성과 인공위액 및 담즙산에 대한 내성이 우수한 균주 KL-6를 선발하였다.
김치 양념과 혼합한 두부(Control)와 선발유산균을 starter로 접종(2%, v/v)하여 김치 양념과 혼합한 두부(TL) 그리고 starter를 접종하여 37°C에서 24시간 동안 전 발효시킨 김치 양념과 혼합한 두부(TPL)의 발효 특성을 비교하였다.
미생물수는 시료 10 g에 멸균 증류수 90 mL를 첨가하여 stomacher(LB W400, TMC, Seoul, Korea)를 이용하여 마쇄한 시료 1 mL를 무균적으로 취하여 총균수는 plate count agar(Difco), 유산균수는 0.02% sodium azide를 함유한 MRS agar, 대장균군수는 violet red bile agar(Difco)에 접종하여 37°C에서 배양한 후 생균수를 측정하였다.
유산균을 접종하지 않은 김치 양념에 침지한 두부(Control), 유산균을 접종(2%, v/v)한 김치 양념에 침지한 두부(TL, tofu and kimchi ingredients with lactic acid bacteria)와 유산균을 접종하여 37°C에서 24시간 발효시킨 김치 양념에 침지한 두부(TPL, tofu in pre-fermented kimchi ingredients with lactic acid bacteria)로 나누어 발효 특성을 비교하였다.
인공담즙산에 대한 내성은 Lee와 No(15)의 방법으로 MRS broth에 pancreatin(Kanto Chemical, Tokyo, Japan) 1%와 10% Oxgall(Difco) 용액 1%를 첨가한 인공담즙액에 대한 인공위액에서 3시간 배양한 균체를 접종하여 37°C에서 24시간 배양한 후 생균수를 측정하였다.
최종 선발된 균주를 동정하기 위해 Gram 염색, gas 형성 유무, catalase activity test를 조사하였고, 분자생물학적 동정을 위해 27_F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')와 1492_R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3') 프라이머를 이용하여 16S rRNA 유전자를 증폭하고 그 서열 분석을 수행하여(Solgent Co., Daejeon, Korea) 확인하였다.
관능검사는 식품을 전공하는 대학생 및 대학원생 25명을 대상으로 관능검사를 실시하였다. 측정항목으로는 색상, 조직감, 맛, 풍미, 종합적 기호도를 5점 채점법으로 평가하였다. 아주 좋다가 5점, 보통이다가 3점, 아주 나쁘다가 1점으로 평가하였다.

대상 데이터

경북지역에서 수집한 김치로부터 60균주의 유산균을 분리하였고, 병원성 미생물에 대한 항균활성이 우수한 10균주를 1차 선별하였다(Table 1). 분리균주인 KL-6와 KL-24는 L.
관능검사는 식품을 전공하는 대학생 및 대학원생 25명을 대상으로 관능검사를 실시하였다. 측정항목으로는 색상, 조직감, 맛, 풍미, 종합적 기호도를 5점 채점법으로 평가하였다.
김치양념 재료는 경산시 하양읍 재래시장에서 구입하였으며, 두부 100 g당 고춧가루 3 g, 마늘 1 g, 소금 2 g, 설탕2 g, 생강 0.5 g, 젓갈 2 g, 배추즙 31.5 g을 혼합하였고, 제조된 김치양념에 최종 선발된 균주를 600 nm에서 흡광도 1.00이 되도록 희석한 후, 2%(v/v) 접종하여 사용하였다. 두부는 일정한 크기(3×3×3 cm)로 자른 후, 김치양념 1:3(w/v) 비율로 침지하여 20°C에서 14주 동안 발효시켰다.
김치 및 젓갈류에서 probiotics의 기능을 갖는 유산균을 분리하여 발효두부 제조용 starter로 선별하여 김치양념을 이용한 발효두부 제조 가능성을 검토하였다. 분리한 60균주의 병원성균에 대한 항균활성과 인공위액 및 담즙산에 대한 내성이 우수한 균주 KL-6를 선발하였다. 최종 선발된 KL-6의 배양액의 DPPH free radical 소거능을 측정한 결과 성장에 따라 항산화 활성이 증가하였고, 16S rRNA 염기서열 분석에 의해 동정한 결과 P.

데이터처리

통계분석은 SPSS system(statistical Package for Social Sciences, SPSS Inc., Chicago, IL, USA) software package(version 12.0)를 이용, p<0.05 수준으로 Duncan's multiple range test에 의하여 검증하였다.

이론/모형

항균활성 측정용 균주는 Listeria monocytogenes KCTC 3569, Staphylococcus aureus subsp. aureus KCCM 12255, P seudomonas fluorescens ATCC 21541, Escherichia coli ATCC 11775, Salmonella Enteritidis KCTC 12400, Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802를 사용하였으며, 분리균주의 항균활성은 paper disc method에 의한 clear zone의 생성 유무로 측정하였다.
인공위액에 대한 내성은 Kobayashi 등(14)의 방법에 준하여 1 N HCl을 사용하여 pH 2.5로 조정한 MRS broth에 pepsin 1%를 첨가한 인공위액에 선발 유산균을 접종하여 37°C에서 3시간 배양한 후 생균수를 측정하였다.

성능/효과

항균성이 우수한 6균주의 인공 위액과 담즙산에 대한 내성은 Table 2와 같다. 6종의 분리균주는 인공 위액에서 배양 초기 10⁶～10⁸ CFU/mL에서 3시간 배양 후 KL-6(10⁴ CFU/mL)와 MJ-82(10³ CFU/mL)를 제외한 균주는 모두 사멸하였다. 분리균주 KL-6와 MJ-82는 인공위액에서 3시간 경과 후 약 10⁴ CFU/mL의 생균수를 나타내어 섭취 후 위를 통과하는 기간 동안 생존할 수 있을 것으로 판단되었다.
coli, Sal. Enteritidis, V. parahaemolyticus 등 모든 균주에 대해 항균활성을 나타내었다. 유산균은 발효 중 유산 및 초산, 저급 지방산, hydrogen peroxide, diacetyl, bacteriocin, 항생물질 등을 생성하여 여러 가지 병원성 세균과 부패세균의 생육을 억제한다(17).
김치 양념과 혼합한 두부(Control)와 선발유산균을 starter로 접종(2%, v/v)하여 김치 양념과 혼합한 두부(TL) 그리고 starter를 접종하여 37°C에서 24시간 동안 전 발효시킨 김치 양념과 혼합한 두부(TPL)의 발효 특성을 비교하였다. pH는 발효 1주 경과 후 모든 처리구에서 감소하였고, 발효 14주에 각 처리구별 pH는 3.96(control), 3.97(TL), 4.03(TPL)이었다. 유산발효두부의 총균수는 발효 2주까지 모든 처리구에서 증가하였으며, 이후 감소하는 경향을 나타내었다.
대장균군수의 경우 대조구는 발효 1주일째까지 관찰되었으나, TL및 TPL구는 발효 1주째부터 관찰되지 않 았다. 기호성은 TL구와 TPL구가 맛, 향, 조직감, 종합적 기호도에서 대조구보다 높았으며, TPL구가 가장 우수하였다.
모든 처리구의 유산균수는 발효 2주 후 서서히 감소하는 경향을 나타내어 Lim과 Cho(23)의 비단두부를 장류에 담금하여 저장성하는 동안 유산균의 수는 점차 감소한다는 결과와 유사한 경향을 나타내었다. 대장균군은 발효 1일째까지 대조구에서 관찰되었으나, 유산균 처리구는 발효 1주째부터 관찰되지 않았다. 이는 발효 과정중 유산균의 성장에 의해 생성된 산에 기인된 것으로 판단되며, Jung(24)의 김치 숙성 초기부터 대장균이 감소하다가 숙성 15～20일 후에는 검출되지 않았다는 보고와 유사한 경향을 나타내었다.
최종선발된 분리균주 KL-6는 사연구균, Gram 양성, Catalase 음성 그리고 정상발효유산균으로 확인되었다. 또한 16S rRNA 유전자 염기서열 분석하여 GenBank에 등록되어 있는 유산균들과 상동성을 비교한 결과, Pediococcus (P.) acidilactici와 100%(accession no. AJ305320) 일치하여 최종적으로 P. acidilactici KL-6로 명명하였다(Fig. 2). 따라서 본 연구에서 분리한 P.
유산발효두부의 맛, 색, 향, 조직감, 종합적 기호도에 대한 기호성은 Table 5와 같다. 맛, 향, 조직감 그리고 종합적 기호도는 TL구와 TPL구가 대조구에 비해 유의적으로 높은 경향을 나타내었으며, 종합적 기호도는 TPL구가 가장 양호하였다. 이와 같이 P.
발효 전 두부의 유산균수는 10² CFU/g이었으며, 발효 1주 대조구는 10⁴ CFU/g, TL구와 TPL구는 10⁶ CFU/g을 나타내었다. 모든 처리구의 유산균수는 발효 2주 후 서서히 감소하는 경향을 나타내어 Lim과 Cho(23)의 비단두부를 장류에 담금하여 저장성하는 동안 유산균의 수는 점차 감소한다는 결과와 유사한 경향을 나타내었다. 대장균군은 발효 1일째까지 대조구에서 관찰되었으나, 유산균 처리구는 발효 1주째부터 관찰되지 않았다.
발효두부의 pH는 발효 10주까지 감소하였고, 그 이후부터 서서히 증가하는 경향을 나타내었다. 발효 전 각 처리구의 총균수는 10³～10⁴ CFU/g의 분포를 보였으며, 발효 2주까지 모든 처리구에서 증가하였고, 이후 감소하는 경향을 나타내었다. 발효 중 유산균의 변화는 총균수와 유사한 경향을 나타내었다.
acidilactici KL6를 접종하여 전 발효시킨 양념의 사용에 기인된 것으로 사료된다. 발효두부의 pH는 발효 10주까지 감소하였고, 그 이후부터 서서히 증가하는 경향을 나타내었다. 발효 전 각 처리구의 총균수는 10³～10⁴ CFU/g의 분포를 보였으며, 발효 2주까지 모든 처리구에서 증가하였고, 이후 감소하는 경향을 나타내었다.
6종의 분리균주는 인공 위액에서 배양 초기 10⁶～10⁸ CFU/mL에서 3시간 배양 후 KL-6(10⁴ CFU/mL)와 MJ-82(10³ CFU/mL)를 제외한 균주는 모두 사멸하였다. 분리균주 KL-6와 MJ-82는 인공위액에서 3시간 경과 후 약 10⁴ CFU/mL의 생균수를 나타내어 섭취 후 위를 통과하는 기간 동안 생존할 수 있을 것으로 판단되었다. 인공위액에서 3시간 처리한 후 KL-6와 MJ-82의 균체를 인공 담즙산에 접종하여 24시간 동안 생균수의 변화를 관찰한 결과 초기 균수는 각각 10⁴ CFU/mL (KL-6), 10³ CFU/mL(MJ-82)였고, 배양시간이 경과함에 따라 생균수가 증가하여, 배양 24시간째 10⁹ CFU/mL(KL-6), 10⁸ CFU/mL(MJ-82)를 나타내었다.
유산균은 발효 중 유산 및 초산, 저급 지방산, hydrogen peroxide, diacetyl, bacteriocin, 항생물질 등을 생성하여 여러 가지 병원성 세균과 부패세균의 생육을 억제한다(17). 분리균주는 병원성 미생물에 대한 성장억제능을 나타내어 발효식품 제조 시 starter로 사용이 가능할 것으로 판단되었다.
03(TPL)이었다. 유산발효두부의 총균수는 발효 2주까지 모든 처리구에서 증가하였으며, 이후 감소하는 경향을 나타내었다. 유산균수의 경우 TL및 TPL구는 발효 1주째, 대조구는 발효 2주째 10⁶ CFU/g에 도달하였으며, 발효가 진행됨에 따라 각 처리구 공히 감소하여 발효 14주째 10³ CFU/g을 나타내었다.
분리균주 KL-6와 MJ-82는 인공위액에서 3시간 경과 후 약 10⁴ CFU/mL의 생균수를 나타내어 섭취 후 위를 통과하는 기간 동안 생존할 수 있을 것으로 판단되었다. 인공위액에서 3시간 처리한 후 KL-6와 MJ-82의 균체를 인공 담즙산에 접종하여 24시간 동안 생균수의 변화를 관찰한 결과 초기 균수는 각각 10⁴ CFU/mL (KL-6), 10³ CFU/mL(MJ-82)였고, 배양시간이 경과함에 따라 생균수가 증가하여, 배양 24시간째 10⁹ CFU/mL(KL-6), 10⁸ CFU/mL(MJ-82)를 나타내었다. 이는 Lee와 No(15), Paik 등(19)의 결과와 유사하였으며, 분리균주는 위산과 담즙산에 대한 내성이 있으므로 정장의 효과를 기대할 수 있는 starter로 사용이 가능할 것으로 판단된다.
분리한 60균주의 병원성균에 대한 항균활성과 인공위액 및 담즙산에 대한 내성이 우수한 균주 KL-6를 선발하였다. 최종 선발된 KL-6의 배양액의 DPPH free radical 소거능을 측정한 결과 성장에 따라 항산화 활성이 증가하였고, 16S rRNA 염기서열 분석에 의해 동정한 결과 P. acidilactici KL-6(100%)로 확인되었다. 김치 양념과 혼합한 두부(Control)와 선발유산균을 starter로 접종(2%, v/v)하여 김치 양념과 혼합한 두부(TL) 그리고 starter를 접종하여 37°C에서 24시간 동안 전 발효시킨 김치 양념과 혼합한 두부(TPL)의 발효 특성을 비교하였다.
최종선발된 분리균주 KL-6는 사연구균, Gram 양성, Catalase 음성 그리고 정상발효유산균으로 확인되었다. 또한 16S rRNA 유전자 염기서열 분석하여 GenBank에 등록되어 있는 유산균들과 상동성을 비교한 결과, Pediococcus (P.

후속연구

2). 따라서 본 연구에서 분리한 P. acidilactici KL-6는 병원균에 대하여 효과적으로 저해하여 김치 및 발효식품의 안전성을 확보하고 발효과정 중 경쟁 균주를 억제하여 품질을 유지할 수 있는 산업적으로 유용한 starter로 개발될 수 있을 것으로 판단된다.
acidilactici KL6의 성장으로 인한 다양한 성장억제물질의 생산에 기인된 것으로 판단된다. 이상의 결과로 미루어 보아 두부와 김치 양념을 혼합한 유산발효는 가능할 것으로 판단되며, 특히 정장의 작용이 가능한 유산균을 starter로 첨가할 경우 발효에 의한 이점과 더불어 첨가 유산균에 의한 기능성이 부가되어 기능성식품으로서의 발효두부 제조가 가능할 것으로 판단된다.
맛, 향, 조직감 그리고 종합적 기호도는 TL구와 TPL구가 대조구에 비해 유의적으로 높은 경향을 나타내었으며, 종합적 기호도는 TPL구가 가장 양호하였다. 이와 같이 P. acidilactici KL-6를 starter로 사용한 유산발효두부는 새로운 형태의 두부발효제품이며, 정장의 작용이 있는 유산균이 함유된 기능성식품으로서의 가치가 있을 것으로 판단된다. 이러한 발효두부는 단독 또는 보조식품으로서 활용이 가능할 것으로 판단된다.
이러한 발효두부는 단독 또는 보조식품으로서 활용이 가능할 것으로 판단된다. 향후 산업적 제조에 앞서, 발효특성 구명, 유산발효두부가 갖는 다양한 기능성에 관한 연구 그리고 원료의 전처리에 따른 발효기법에 관한 폭넓은 연구가 선행되어야 할 것으로 판단된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	발효두부의 종류는 무엇이 있는가?	발효두부는 중국이나 대만의 두부유, 인도네시아의 taokoan, 필리핀의 tahuri, 태국의 tau hu yee, 일본의 tofuyo 등이 있다(7,8). 이 중 중국과 대만의 두부유(sufu)는 Actinomucor elegans, Mucor heimalis, Mucor silvaticus, Mucor praimi 및 Rhizopus chmenisis 등의 유용 곰팡이를 두부 표면에 생육시켜 술덧과 소금용액을 섞은 침지액에 숙성시킨 것이며, 일본의 tofuyo는 두부를 건조시킨 후 Monascus sp.
	생균제의 기능으로 인정된 것은 무엇인가?	식품의 발효는 미생물의 작용으로 식품의 각종 영양분이 소화되기 쉬운 상태로 변화한다. 오늘날 생균제(probiotics)로서의 기능성을 갖는 발효관련 미생물에 관한 연구가 활발히 진행되고 있으며, 생균제는 장내군총의 정상화, 유해세균의 정착억제에 따른 부패산물의 생성감소 및 질병예방, 면역 기능의 강화, 콜레스테롤 저하 등의 기능이 인정되고 있다(1-4). 생균제로 갖추어야 할 조건은 장 정착성, 병원성세균의 억제와 발효식품에 부여되는 관능적 특성, 안정성, 박테리오파지 저항성이 있어야 하며, 특히 장내 생존력이 우수해야 상업적으로 이용가치를 가진다(5,6)
	김치 및 발효식품의 유산균이 여러 가지 병원성 세균과 부패세균의 생육을 억제할 수 있는 이유는 무엇인가?	parahaemolyticus 등 모든 균주에 대해 항균활성을 나타내었다. 유산균은 발효 중 유산 및 초산, 저급 지방산, hydrogen peroxide, diacetyl, bacteriocin, 항생물질 등을 생성하여 여러 가지 병원성 세균과 부패세균의 생육을 억제한다(17). 분리균주는 병원성 미생물에 대한 성장억제능을 나타내어 발효식품 제조 시 starter로 사용이 가능할 것으로 판단되었다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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