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문제 정의
- 본 연구에서 사용된 microarray 분석은 동시에 수 만개 이상의 유전자 발현양상을 관찰할 수 있는 기술로서 특정 질병의 유전학적 특성과 기전 연구를 더 광범위하게 연구 할 수 있는 기술이다. 목표로 하는 세포에서 mRNA를 분리하여 형광물질을 첨가하여 단일 가닥 형태의 cDNA로 합성시켜, 여기에 microarray chip에 내장되어있는 probe를 이용하여 발산하는 형광을 검출하여 발현 변화 양상을 파악할 수 있다[7].
- 현재까지 pipernonaline이 전립선 암세포에서 일어나는 유전자 발현 변화 연구는 아직 미비한 상태이다. 본 연구에서는 전립선 암세포에 pipernonaline을 처리하여 cDNA microarray를 실시한 후 DAVID database를 기반으로 하여 생물학적 과정 중에서 세포주기, 세포사멸, 세포 증식과 성장을 clustering하여 유전자의 발현 변화를 확인하여 이후, 전립선암의 치료와 예방에 기여하고자 한다.
제안 방법
- Agilent's GeneSpring Software를 이용하여 normalization 및 clustering 통해 유전자의 발현 분석을 하였다.
- 2배 이상 유의하게 증가 혹은 감소된 값을 가지는 유전자를 분석하여 significant genes로 적용한 5,948개의 유전자를 대상으로 하여 추가 분석을 실시하였다. DAVID database를 이용하여 GenBank accession number를 입력하였고, 그 중 사람의 유전자 3,941개와 알려지지 않은 유전자 1,536개로 분리하여 분석하였다. 먼저 사람의 유전자 3,941개를 functional annotation tool을 이용하여 gene ontology에서 Biological Process로 clustering을 한 결과, 3,785개의 유전자를 분리하였고, 482개의 cluster를 분석하였다(data not shown).
- Microarray hybridization을 위해 Agilent’s Gene Expression Hybridization kit (Agilent Technologies Inc.)를 사용하였고, Agilent’s Gene Expression Wash Buffer Kit (Agilent Technologies Inc.)를 이용하여 세척한 후, Agilent’s DNA microarray scanner 및 Feature Extraction Software를 이용하여 영상을 스캔하고 분석하였다.
- Normalization 및 clustering을 위해 Agilent's GeneSpring software을 이용하여 MA plot 및 Scatter plot을 측정하여 표준화하여 각종 변이 등에 의한 오차를 최소한으로 줄였다(Fig. 1A,B).
- 간략히, PC-3 세포를 1×105 되도록 6 well cell culture plate에 분주하고 24시간 동안 안정화시킨 후, 30 μg/ml pipernonaline을 24시간 처리하여 배양한 뒤, 1 ml RiboEx reagent를 사용하여 harvest하여 이후, 제조사의 protocol에 따라 RNA를 분리하였다.
- DAVID database를 이용하여 GenBank accession number를 입력하였고, 그 중 사람의 유전자 3,941개와 알려지지 않은 유전자 1,536개로 분리하여 분석하였다. 먼저 사람의 유전자 3,941개를 functional annotation tool을 이용하여 gene ontology에서 Biological Process로 clustering을 한 결과, 3,785개의 유전자를 분리하였고, 482개의 cluster를 분석하였다(data not shown). 분석한 결과, cellular 및 metabolic process에 관련된 유전자들을 많이 포함하고 있었으며, 특히 세포사멸과 세포주기 관련 및 세포성장 및 증식에 관련된 유전자들을 우선적으로 분석하였다(Table 1).
- 1A,B). 보정된 유전자 발현 결과는 각 시료 간에 비교 분석 후, 2배 이상 유의하게 증가 혹은 감소된 값을 가지는 유전자를 분석하여 significant genes로 적용하였다. 그 결과, 2배 이상 유의성 있게 발현이 증가한 유전자의 수는 3,106개이고, 2배 이하로 유의성 있게 발현이 감소한 유전자의 수는 2,842개였다.
- 본 연구는 cell culture dish에 세포가 70-80% confluent 되었을 때 30 μg/ml pipernonaline을 24시간 처리하여 실험을 진행하였다.
- 분리한 RNA는 Agilent’s 2100 Bioanalyzer System (Agilent Technologies Inc.)을 이용하여 total RNA의 quality를 측정하였고, RNA의 증폭과 labeling 과정을 위해 Agilent’s Low RNA Input Linear Amplification kit PLUS (Agilent Technologies Inc.)를 이용하였다.
- 먼저 사람의 유전자 3,941개를 functional annotation tool을 이용하여 gene ontology에서 Biological Process로 clustering을 한 결과, 3,785개의 유전자를 분리하였고, 482개의 cluster를 분석하였다(data not shown). 분석한 결과, cellular 및 metabolic process에 관련된 유전자들을 많이 포함하고 있었으며, 특히 세포사멸과 세포주기 관련 및 세포성장 및 증식에 관련된 유전자들을 우선적으로 분석하였다(Table 1). 세포주기에 관련되는 유전자는 256개, 세포사멸에 관련된 유전자는 197개, 세포성장 및 증식에 관련된 유전자들은 154개로 확인되었으며, 이들의 교집합을 이루는 유전자를 각각 분석하였다(Fig.
- 세포사멸과 관련된 cluster의 경우, 2배 이상 감소된 유전자보다 2배 이상 증가된 유전자가 더 많이 나타났으며 세포사멸과 관련된 대표적인 유전자 중, caspase family와 Bcl-2 family, tumor necrosis factor 등의 발현 변화를 확인하였다. 세포증식 및 성장에 관련된 cluster에서는 성장 인자인 insulin-like growth fac-tor와 vascular endothelial growth factor 등 관련 유전자 및 성장 저해 인자인 CDK inhibitor와 androgen-induced proliferation inhibitor 등 관련 유전자의 발현 변화를 확인하였다. 또한 세포주기, 세포사멸, 세포증식 및 성장에 공통적으로 발현되는 유전자를 확인한 결과, 대표적인 세포주기 억제 유전자 CDKN1A가 8배 이상 가장 많이 증가한 반면, CDK inhibitor 2C (p18)인 CDKN2C는 5배 이상 감소되었다(Table 5).
- Agilent's GeneSpring Software를 이용하여 normalization 및 clustering 통해 유전자의 발현 분석을 하였다. 이후 유전자의 생물학적, 분자학적 기능을 분류하기 위해서 DAVID database (http://david.abcc.ncifcrf.gov/)를 이용하여 clustering하였다.
대상 데이터
- 2배 이상 유의하게 증가 혹은 감소된 값을 가지는 유전자를 분석하여 significant genes로 적용한 5,948개의 유전자를 대상으로 하여 추가 분석을 실시하였다. DAVID database를 이용하여 GenBank accession number를 입력하였고, 그 중 사람의 유전자 3,941개와 알려지지 않은 유전자 1,536개로 분리하여 분석하였다.
- 본 실험에 사용된 pipernonaline은 우리의 이전 연구에서 분리한 시료를 사용하였다[5]. RNA 분리를 위한 RiboEx_columnTM kit는 GeneAll Biotechology Co. (Seoul, Korea)에서 구입하였다. 인간 전립선 암세포주인 PC-3 세포는 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)로부터 분양 받아 10% fetal bovine serum (WelGene Inc.
- 본 실험에 사용된 pipernonaline은 우리의 이전 연구에서 분리한 시료를 사용하였다[5]. RNA 분리를 위한 RiboEx_columnTM kit는 GeneAll Biotechology Co.
- 사람의 유전자 44,000개를 인지할 수 있는 probe들이 포함된 Agilent Human whole genome 4 X 44K Chip을 사용하였다. Normalization 및 clustering을 위해 Agilent's GeneSpring software을 이용하여 MA plot 및 Scatter plot을 측정하여 표준화하여 각종 변이 등에 의한 오차를 최소한으로 줄였다(Fig.
- 분석한 결과, cellular 및 metabolic process에 관련된 유전자들을 많이 포함하고 있었으며, 특히 세포사멸과 세포주기 관련 및 세포성장 및 증식에 관련된 유전자들을 우선적으로 분석하였다(Table 1). 세포주기에 관련되는 유전자는 256개, 세포사멸에 관련된 유전자는 197개, 세포성장 및 증식에 관련된 유전자들은 154개로 확인되었으며, 이들의 교집합을 이루는 유전자를 각각 분석하였다(Fig. 2, Table 2-4).
- 간략히, cDNA microarray chip은 Agilent Technologies Inc.의 Human whole genome 44K (Santa Clara, CA, USA) 사용하였다. 분리한 RNA는 Agilent’s 2100 Bioanalyzer System (Agilent Technologies Inc.
- 인간 전립선 암세포주인 PC-3 세포는 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)로부터 분양 받아 10% fetal bovine serum (WelGene Inc., Daegu, Korea), 100 unit/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin (WelGene Inc.)이 첨가된 DMEM 배지 (WelGene Inc.)에서 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
성능/효과
- Gene clustering을 한 결과, 세포주기와 관련한 cluster에서는 2배 이상 감소된 유전자가 189개로 2배 이상 증가된 유전자 67개보다 더 많이 확인되었다. 특히, 세포주기를 촉진하는 cyclins과 cyclin-dependent kinases (CDKs) 유전자 같은 경우 전체적으로 발현이 감소 되었고, 대표적인 세포주기 억제 단백질 CDK inhibitor 1A (p21)인 CDKN1A는 8배 이상 증가를 확인함으로써, pipernonaline이 세포주기를 활성화시키는 유전자의 발현감소 또는 억제 유전자의 발현 증가를 유도함으로 써 세포주기에 영향을 미치는 것을 알 수 있었다.
- 그 결과, 2배 이상 유의성 있게 발현이 증가한 유전자의 수는 3,106개이고, 2배 이하로 유의성 있게 발현이 감소한 유전자의 수는 2,842개였다. significant genes, 총 5,948개에 대하여 hierarchical clustering을 진행한 결과, pipernonaline을 처리함에 따라 2배 이상 증가된 유전자(red color)와 2배 이상 감소된 유전자(green color) 발현양상을 확인할 수 있었다(Fig. 1C).
- 보정된 유전자 발현 결과는 각 시료 간에 비교 분석 후, 2배 이상 유의하게 증가 혹은 감소된 값을 가지는 유전자를 분석하여 significant genes로 적용하였다. 그 결과, 2배 이상 유의성 있게 발현이 증가한 유전자의 수는 3,106개이고, 2배 이하로 유의성 있게 발현이 감소한 유전자의 수는 2,842개였다. significant genes, 총 5,948개에 대하여 hierarchical clustering을 진행한 결과, pipernonaline을 처리함에 따라 2배 이상 증가된 유전자(red color)와 2배 이상 감소된 유전자(green color) 발현양상을 확인할 수 있었다(Fig.
- 세포증식 및 성장에 관련된 cluster에서는 성장 인자인 insulin-like growth fac-tor와 vascular endothelial growth factor 등 관련 유전자 및 성장 저해 인자인 CDK inhibitor와 androgen-induced proliferation inhibitor 등 관련 유전자의 발현 변화를 확인하였다. 또한 세포주기, 세포사멸, 세포증식 및 성장에 공통적으로 발현되는 유전자를 확인한 결과, 대표적인 세포주기 억제 유전자 CDKN1A가 8배 이상 가장 많이 증가한 반면, CDK inhibitor 2C (p18)인 CDKN2C는 5배 이상 감소되었다(Table 5). 이러한 결과는 pipernonaline의 처리는 전립선 암세포에 존재 하는 다양한 신호전달 체계에 관여하는 것을 알 수 있으며, 본 연구에서는 CDKN2C 유전자 발현 감소보다 CDKN1A 유전자의 발현 증가가 pipernonaline이 처리된 전립선 암세포에 대해 더 우선적으로 작용함으로써 세포의 성장억제를 유도함을 알 수 있었다.
- 특히, 세포주기를 촉진하는 cyclins과 cyclin-dependent kinases (CDKs) 유전자 같은 경우 전체적으로 발현이 감소 되었고, 대표적인 세포주기 억제 단백질 CDK inhibitor 1A (p21)인 CDKN1A는 8배 이상 증가를 확인함으로써, pipernonaline이 세포주기를 활성화시키는 유전자의 발현감소 또는 억제 유전자의 발현 증가를 유도함으로 써 세포주기에 영향을 미치는 것을 알 수 있었다. 세포사멸과 관련된 cluster의 경우, 2배 이상 감소된 유전자보다 2배 이상 증가된 유전자가 더 많이 나타났으며 세포사멸과 관련된 대표적인 유전자 중, caspase family와 Bcl-2 family, tumor necrosis factor 등의 발현 변화를 확인하였다. 세포증식 및 성장에 관련된 cluster에서는 성장 인자인 insulin-like growth fac-tor와 vascular endothelial growth factor 등 관련 유전자 및 성장 저해 인자인 CDK inhibitor와 androgen-induced proliferation inhibitor 등 관련 유전자의 발현 변화를 확인하였다.
- 또한 세포주기, 세포사멸, 세포증식 및 성장에 공통적으로 발현되는 유전자를 확인한 결과, 대표적인 세포주기 억제 유전자 CDKN1A가 8배 이상 가장 많이 증가한 반면, CDK inhibitor 2C (p18)인 CDKN2C는 5배 이상 감소되었다(Table 5). 이러한 결과는 pipernonaline의 처리는 전립선 암세포에 존재 하는 다양한 신호전달 체계에 관여하는 것을 알 수 있으며, 본 연구에서는 CDKN2C 유전자 발현 감소보다 CDKN1A 유전자의 발현 증가가 pipernonaline이 처리된 전립선 암세포에 대해 더 우선적으로 작용함으로써 세포의 성장억제를 유도함을 알 수 있었다. 이상의 이러한 결과들로부터 전립선 암세포에서 pipernonaline는 세포주기, 세포사멸 그리고 세포증식 및 성장에 관련된 다양한 유전자를 조절함으로써 세포사멸의 유 도, 세포증식과 성장을 저해하는 것을 알 수 있고, 이러한 microarray의 결과를 바탕으로 in vivo상에서 실제로 암세포의 사멸과 관련된 새로운 유전자 탐색 및 메커니즘을 규명하는데 유용하게 사용할 수 있을 것으로 사료된다.
- Gene clustering을 한 결과, 세포주기와 관련한 cluster에서는 2배 이상 감소된 유전자가 189개로 2배 이상 증가된 유전자 67개보다 더 많이 확인되었다. 특히, 세포주기를 촉진하는 cyclins과 cyclin-dependent kinases (CDKs) 유전자 같은 경우 전체적으로 발현이 감소 되었고, 대표적인 세포주기 억제 단백질 CDK inhibitor 1A (p21)인 CDKN1A는 8배 이상 증가를 확인함으로써, pipernonaline이 세포주기를 활성화시키는 유전자의 발현감소 또는 억제 유전자의 발현 증가를 유도함으로 써 세포주기에 영향을 미치는 것을 알 수 있었다. 세포사멸과 관련된 cluster의 경우, 2배 이상 감소된 유전자보다 2배 이상 증가된 유전자가 더 많이 나타났으며 세포사멸과 관련된 대표적인 유전자 중, caspase family와 Bcl-2 family, tumor necrosis factor 등의 발현 변화를 확인하였다.
후속연구
- 이러한 결과는 pipernonaline의 처리는 전립선 암세포에 존재 하는 다양한 신호전달 체계에 관여하는 것을 알 수 있으며, 본 연구에서는 CDKN2C 유전자 발현 감소보다 CDKN1A 유전자의 발현 증가가 pipernonaline이 처리된 전립선 암세포에 대해 더 우선적으로 작용함으로써 세포의 성장억제를 유도함을 알 수 있었다. 이상의 이러한 결과들로부터 전립선 암세포에서 pipernonaline는 세포주기, 세포사멸 그리고 세포증식 및 성장에 관련된 다양한 유전자를 조절함으로써 세포사멸의 유 도, 세포증식과 성장을 저해하는 것을 알 수 있고, 이러한 microarray의 결과를 바탕으로 in vivo상에서 실제로 암세포의 사멸과 관련된 새로운 유전자 탐색 및 메커니즘을 규명하는데 유용하게 사용할 수 있을 것으로 사료된다.
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