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문제 정의
- MMPs를 이루는 주요성분으로 collagenase, gelatinase 및 elastase 등이 있으며, 피부의 탄력감소 및 주름생성에 있어서 collagenase의 활성 감소는 매우 중요하다. 그러므로 왕겨초액의 collagenase 저해활성에 대해 확인해 보았다. 그 결과 100 µL/mL의 농도에서 100%의 높은 collagenase 저해 활성 효과를 나타내었으며, 50 µL/mL의 농도에서는 50%의 농도 의존성 collagenase 저해 활성 효과를 나타내었다.
- 이러한 이용에도 불구하고 목초액의 경우 원료인 목재를 공급받는데 있어 친환경적인 면에서 한계성이 있으며 목초액의 표준화에도 어려움을 갖고 있으며 또한 원료자체도 상대적으로 고가인 문제점을 가지고 있다. 따라서 본 연구는 최근 활용도가 확대되고 있는 목초액의 대체물질로서, 좀 더 원료 확보가 쉬우면서 상대적으로 원재료 가격이 저렴한 벼의 도정 시 부산물로 나오는 왕겨를 원재료로 사용하여, 이 왕겨를 훈탄으로 탄화하는 과정에서 발생하는 연기를 냉각 액화시켜 얻어지는 왕겨초액을 이용하여 항산화 효과 및 주름개선, 미백 효과를 연구하여 기능성식음료의 인증 및 화장품 소재개발로서의 사용 가능성을 알아보고자 하였다.
- 본 연구는 왕겨를 이용한 항산화, 항노화에 효과적인 초액을 대량생산하여 기능성을 검증하고 왕겨초액 내의 기능성물질을 분석하여 사업화의 가능성을 타진하고자 하였다. 정제된 왕겨초액을 분획하여 기능성이 확인된 부분을 HPLC 기기를 이용하여 확인한 결과 caffeic acid 외에 7종의 polyphenol 유래물질에서 기능성을 확인하였다.
제안 방법
- 왕겨초액은 100 µL/mL의 농도에서 tyrosine에 대한 tyrosinase 저해효과가 80% 이상으로 미백효과가 우수하게 나타났다. DPPH radical 소거율, xanthine oxidase 저해와 SOD-like 활성을 이용하여 항산화 효과를 측정하였다. 왕겨초액 100 µL/mL의 농도에서 DPPH radical 소거율이 80%, xanthine oxidase 저해효과가 80%, 그리고 SOD-like 활성이 100%를 나타내었다.
- 각 시료의 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl (DPPH)에 대한 전자공여 효과로써 시료의 환원력을 측정하였다[3]. 즉 각 추출물을 농도 별로 제조한 시료 1 mL에 0.
- 생산된 왕겨초액 원액을 감압증류장치(680 mmHg 압력, 온도 40℃) 및 초액 정제 시스템을 이용하여 고품질 정제초액을 생산하였다. 또한, 왕겨 정제초액 생산 시스템을 이용하여 2차 왕겨 정제초액, 3차 왕겨 정제초액으로 정제과정을 거쳐 생산하였다.
- 5×30 cm)을 장착한 후 이동상으로 에탄올(0%→100% gradient)을 사용하여 분당 1 mL의 속도로 10 mL씩 분취하여 측정하였다. 분취한 시료를 Sep-pak C18을 통과하여 0.45 mm membrane filter로 여과 한 후 HPLC(Waters 2695, Waters, USA)로 분석하였다. 이 때 column은 Atlantis TM dC18(4.
- Superoxide dismutase (SOD)는 항산화 효소로서 세포에 유해한 oxygen radical을 과산화수소로 전환시키고 다시 catalase에 의하여 무해한 물 분자와 산소 분자로 전환시켜 활성산소로부터 생체를 보호하는 기능을 한다고 알려져 있다[2]. 산화방지와 노화 억제에 밀접한 관계가 있는 SOD 유사활성 측정을 위해 산화 효소인 pyrogallo와 함께 왕겨초액을 반응시켜 측정하였다. 왕겨초액 모두 농도 의존적으로 SOD 유사활성 소거작용을 나타내었고, 100 µL/mL에서는 100%에 가까운 저해 활성을 나타내었다(Fig.
- 생산된 왕겨초액 원액을 감압증류장치(680 mmHg 압력, 온도 40℃) 및 초액 정제 시스템을 이용하여 고품질 정제초액을 생산하였다. 또한, 왕겨 정제초액 생산 시스템을 이용하여 2차 왕겨 정제초액, 3차 왕겨 정제초액으로 정제과정을 거쳐 생산하였다.
- Xanthine/ xanthine oxidase의 효소에 의한 superoxide 음이온 저해작용은 superoxide 음이온 소거작용과 xanthine oxidase 효소 저해에 의해 나타난다[12]. 양성 대조군으로 BHA를 이용하여 왕겨초액의 superoxide radical 소거효과를 비교하였다. 그 결과 또한 caffeic acid, phoridzin, coumaric acid, ferulic acid, pHPPA 및 epicatechin 등의 항산화에 효과적인 물질들에 의해서 왕겨초액에 농도 의존적으로 superoxide radical 소거작용을 나타낸 것으로 사료되며, 양성 대조군과 비교하였을 때 비슷한 저해 활성을 나타내어 우수한 superoxide radical 소거효과[10]를 나타내었음을 확인할 수 있었다(Fig.
- 왕겨초액이 이러한 항산화 작용을 확인하기 위해 DPPH를 이용하여 항산화 작용을 측정하였다. 양성 대조군으로는 항산화 작용이 있는 것으로 알려진 BHA(Butylated hydroxyanisole)를 이용하여 왕겨초액의 항산화 효과를 비교하였다. 왕겨초액 모두 농도 의존적으로 DPPH radical 소거작용을 나타냈고 양성 대조군과 비교하였을 때 비슷한 저해 활성을 나타내었다.
- 4%가 생산되었다. 왕겨초액으로 부터 타르 분리는 비중 분리법에 의해 이루어졌으며, PT탱크에 생산된 조 왕겨초액을 6개월 이상 숙성 시켜 왕겨초액을 장시간 탱크에 저장해 넣어두면 상, 중, 하의 세층으로 분리되며 하층의 타르 부분을 제거하기 위하여 마이크로 필터를 처리 하였다. 처리된 왕겨초액을 감압증류 장치에 의한 감압 증류하였으며 이를 활성탄 여과 필터과정을 거쳐 정제된 왕겨초액을 얻었다.
- 왕겨초액의 세포 생존에 미치는 영향을 알아보기 위하여 왕겨초액을 0.01, 0.1, 0.5, 1 µL/mL의 농도로 배지에 첨가한 후 세포 생존율을 MTT assay로 측정하였다.
- 유해산소라 불리는 활성산소 (ROS; Reactive oxygen species)는 세포 생체막의 구성성분인 불포화 지방산을 공격하여 지질과 산화 반응을 일으켜 체내에 과산화 지질을 축적하여 인체 기능을 저하시키고 색소침착, 노화 및 성인병 등의 여러 가지 질환을 유발한다고 알려져 있다[8]. 왕겨초액이 이러한 항산화 작용을 확인하기 위해 DPPH를 이용하여 항산화 작용을 측정하였다. 양성 대조군으로는 항산화 작용이 있는 것으로 알려진 BHA(Butylated hydroxyanisole)를 이용하여 왕겨초액의 항산화 효과를 비교하였다.
- 이 때 column은 Atlantis TM dC18(4.6×250nm, 5mm, Waters, USA)를 사용하였으며, column oven 온도는 35℃, 이동상은 Mobile phase A: Formic acid(pH 2.8) 및 Mobile phase B: 50% acetonitrile (pH 2.8, with formic acid)로 gradient로 분석하였으며, 분석시 유속은 0.8 mL/min, 파장은 290 nm에서 측정하였다.
- 이렇게 생성된 불용성 결정을 dimethylsulfoxide(DMSO)로 완전히 녹인 다음, microplate reader를 이용하여 570 nm의 파장에서 측정하였다. 이렇게 측정된 값을 이용하여 세포독성을 확인하였다.
- 정제 왕겨초액을 생산하기 위해 왕겨 약 2,530 Kg을 투입한 후 왕겨초액 생산시스템(DCH-600)에서 초액 생산을 실시하였다. 왕겨로부터 왕겨초액 생산은 1차로 가스에 의한 열분해가 이루어진다.
- 정제된 왕겨초액 1L를 흡착수지(XAD-7HD)로 처리 후에 분획을 농축하고, 왕겨초액 농축물을 Sephadex LH-20 column(Φ2.5×30 cm)을 장착한 후 이동상으로 에탄올(0%→100% gradient)을 사용하여 분당 1 mL의 속도로 10 mL씩 분취하여 측정하였다.
- 피부 주름 개선효과를 확인하기 위한 porcine pancreas elastase 저해 활성 측정은 기질로서 N-succinyl-(L-Ala)3-pnitroanilide를 사용하여 37℃에서 30분간 p-nitroanilide의 생성량을 측정하였다[6]. 각 시험용액을 일정 농도가 되도록 조제하여 0.
대상 데이터
- B16F10는 마우스의 melanoma 세포주이고, NIH3T3는 마우스의 섬유아세포주로 한국 세포 주 은행에서 구입하였다. 구입한 세포는 Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) 에 5% heat-inactivated fetal bovine serum (FBS; GibcoBRL) 과 gentamicin (50 mg/mL)을 첨가한 배지를 사용하여 37℃, 5%의 CO2배양기에서 배양하였다.
- 구입한 세포는 Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) 에 5% heat-inactivated fetal bovine serum (FBS; GibcoBRL) 과 gentamicin (50 mg/mL)을 첨가한 배지를 사용하여 37℃, 5%의 CO2배양기에서 배양하였다. Tyrosinase, collagenase, elastase 시약은 Sigma chemical Co.,에서 구입하여 실험에 사용하였다.
- 구입한 세포는 Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) 에 5% heat-inactivated fetal bovine serum (FBS; GibcoBRL) 과 gentamicin (50 mg/mL)을 첨가한 배지를 사용하여 37℃, 5%의 CO2배양기에서 배양하였다.
- 초액생산은 고령농원에서 효율적으로 설비된 DCH-600 생산설비를 이용하여 생산하였다. 농업부산물인 왕겨 20톤을 일급 열분해 가스를 이용해서 왕겨숯 및 왕겨초액을 생산하였다. 생산된 초액은 PT 보관 통(1톤)에서 숙성하였다.
- 원료투입 왕겨(미곡 부산물)는 경북 의성군에 위치한 다인 RPC에서 공급받아 사용하였다. 왕겨의 탄화 및 초액 생산은 고령공장에서 실시하였다. 초액생산은 고령농원에서 효율적으로 설비된 DCH-600 생산설비를 이용하여 생산하였다.
- 왕겨를 이용하여 팽연화 시킨 후 탄화 및 초액 생산 원료는 다음과 같이 생산하여 사용하였다. 원료투입 왕겨(미곡 부산물)는 경북 의성군에 위치한 다인 RPC에서 공급받아 사용하였다. 왕겨의 탄화 및 초액 생산은 고령공장에서 실시하였다.
- 왕겨의 탄화 및 초액 생산은 고령공장에서 실시하였다. 초액생산은 고령농원에서 효율적으로 설비된 DCH-600 생산설비를 이용하여 생산하였다. 농업부산물인 왕겨 20톤을 일급 열분해 가스를 이용해서 왕겨숯 및 왕겨초액을 생산하였다.
데이터처리
- 본 연구는 독립적으로 3회 이상 반복 실시하여 실험한 결과로 모든 실험결과는 평균 ± 표준편차로 표기하였고, 통계적 유의성은 Student’s t-test로 하였으며, p값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의하다고 판단하였다.
성능/효과
- B16F10과 NIH3T3 세포에 대한 왕겨초액의 세포 독성을 측정한 결과 세포 주 모두 1 µL/mL의 농도에서 100%에 가까운 세포 생존율을 나타내었다.
- 그 결과 100 µL/mL의 농도에서 100%의 높은 collagenase 저해 활성 효과를 나타내었으며, 50 µL/mL의 농도에서는 50%의 농도 의존성 collagenase 저해 활성 효과를 나타내었다.
- 양성 대조군으로 BHA를 이용하여 왕겨초액의 superoxide radical 소거효과를 비교하였다. 그 결과 또한 caffeic acid, phoridzin, coumaric acid, ferulic acid, pHPPA 및 epicatechin 등의 항산화에 효과적인 물질들에 의해서 왕겨초액에 농도 의존적으로 superoxide radical 소거작용을 나타낸 것으로 사료되며, 양성 대조군과 비교하였을 때 비슷한 저해 활성을 나타내어 우수한 superoxide radical 소거효과[10]를 나타내었음을 확인할 수 있었다(Fig. 4).
- 왕겨초액 100 µL/mL의 농도에서 DPPH radical 소거율이 80%, xanthine oxidase 저해효과가 80%, 그리고 SOD-like 활성이 100%를 나타내었다. 따라서 본 연구를 통하여 정제 왕겨초액을 이용한 산업화를 위한 가능성을 타진하여 효과가 좋음을 확인할 수 있었다. 이와 같은 결과로 왕겨초액을 이용한 기능성 화장품의 소재로 뿐만 아니라, 식품 및 의약외품의 품목허가를 통하여 고부가가치의 상품화소재로의 가능성이 있다고 사료됩니다.
- 왕겨초액 100 µL/mL의 농도에서 DPPH radical 소거율이 80%, xanthine oxidase 저해효과가 80%, 그리고 SOD-like 활성이 100%를 나타내었다.
- 왕겨초액은 100 µL/mL의 농도에서 tyrosine에 대한 tyrosinase 저해효과가 80% 이상으로 미백효과가 우수하게 나타났다.
- 왕겨초액은 이 미백에 관여하는 tyrosinase를 저해함으로서 미백에 효과적으로 작용하는지 확인하기 위해 활성을 측정한 결과 100 µL/mL의 농도에서 80% 이상의 tyrosinase 저해활성을 나타내었으며 농도 의존적으로 저해활성이 높게 나타났다.
- 왕겨초액 모두 농도 의존적으로 DPPH radical 소거작용을 나타냈고 양성 대조군과 비교하였을 때 비슷한 저해 활성을 나타내었다. 이러한 결과로 caffeic acid, phoridzin, coumaric acid, ferulic acid, pHPPA 및 epicatechin 등의 왕겨초액에 함유된 물질에서 항산화 작용이 높게 나타났으며 이러한 물질을 통하여 왕겨초액은 피부에서 흔히 일어나는 활성산소에 대한 노화를 방지하는데 큰 도움이 될 것으로 사료된다[3](Fig. 4).
- 특히 대조군으로 사용된 녹차 추출물 유래의 단일 물질인 epigallocatechin gallate(EGCG)에 가까운 높은 저해활성을 나타내어 왕겨초액의 collagenase의 저해율이 높게 나타났음을 확인 할 수 있었다. 이러한 결과로 볼 때 왕겨초액 내의 항산화에 효과적인 caffeic acid, phoridzin, ferulic acid 등이 높은 농도로 함유되어 있어 collagenase 저해에 관여하는 것으로 추정하며 특히 왕겨초액 내에 함유된 caffeic acid, phoridzin[7]은 collagen의 분해를 막아 피부의 주름을 개선하는데 관여 하는 것으로 사료된다(Fig. 2).
- B16F10과 NIH3T3 세포에 대한 왕겨초액의 세포 독성을 측정한 결과 세포 주 모두 1 µL/mL의 농도에서 100%에 가까운 세포 생존율을 나타내었다. 이와 같이 세포독성 실험결과를 바탕으로 왕겨초액의 독성에 대하여 어느 정도 안전성을 갖고 있음을 확인 할 수 있었으며 이러한 결과는 목초액에 대한 안전성과 비슷하게 나타났다(Fig. 1).
- 본 연구는 왕겨를 이용한 항산화, 항노화에 효과적인 초액을 대량생산하여 기능성을 검증하고 왕겨초액 내의 기능성물질을 분석하여 사업화의 가능성을 타진하고자 하였다. 정제된 왕겨초액을 분획하여 기능성이 확인된 부분을 HPLC 기기를 이용하여 확인한 결과 caffeic acid 외에 7종의 polyphenol 유래물질에서 기능성을 확인하였다. 기능성 화장품소재 시험으로는 세포 생존율 측정(MTT assay), 주름개선 (collagenase inhibition assay, elastase inhibition assay), 미백(tyrosinase inhibition assay), 항산화 시험(DPPH free radical scavenging assay, SOD-like activity, xanthine oxidase inhibition assay)이 실시하였다.
- 정제된 왕겨초액을 이용한 elastase 저해 활성 측정을 확인 한 결과 Fig. 2에서 나타난 바와 같이 100 µL/mL의 농도에서 50% 이상의 elastase 저해 활성을 나타내었다.
- 처리된 왕겨초액을 감압증류 장치에 의한 감압 증류하였으며 이를 활성탄 여과 필터과정을 거쳐 정제된 왕겨초액을 얻었다. 정제된 왕겨초액의 기능성물질을 분리하기위해 분취하여 항산화 실험을 추진하여 활성이 높은 부분을 취하여 HPLC에 의해 분석을 하여 본 결과 Polyphenol 성분이 포함된 부분에서 항산화 효능이 높게 나타났음을 확인 하였으며(Data를 나타내지 않았음) 이 효능이 높은 부분을 분취하여 HPLC 기기 분석한 결과 Table 1과 같이 정제된 왕겨초액 100 mL당 caffeic acid 445.16 mg, phoridzin 52.25 mg, coumaric acid 12.2 mg, ferulic acid 7.93 mg, pHPPA(p-hydrophenylpyruvic acid) 2.98 mg, epicatechin 2.77 mg 등이 함유되어 있는 것으로 확인하였다.
- 그 결과 100 µL/mL의 농도에서 100%의 높은 collagenase 저해 활성 효과를 나타내었으며, 50 µL/mL의 농도에서는 50%의 농도 의존성 collagenase 저해 활성 효과를 나타내었다. 특히 대조군으로 사용된 녹차 추출물 유래의 단일 물질인 epigallocatechin gallate(EGCG)에 가까운 높은 저해활성을 나타내어 왕겨초액의 collagenase의 저해율이 높게 나타났음을 확인 할 수 있었다. 이러한 결과로 볼 때 왕겨초액 내의 항산화에 효과적인 caffeic acid, phoridzin, ferulic acid 등이 높은 농도로 함유되어 있어 collagenase 저해에 관여하는 것으로 추정하며 특히 왕겨초액 내에 함유된 caffeic acid, phoridzin[7]은 collagen의 분해를 막아 피부의 주름을 개선하는데 관여 하는 것으로 사료된다(Fig.
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