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문제 정의
- 담금 후 젖산균의 발효작용으로 젖산 함량이 증가되는 것으로 추측되며 모든 막걸리에서 lactic acid와 succinic acid는 유기산 중 가장 많은 함량을 차지하여 막걸리의 주 유기산으로 나타났다(Lee and Lee, 2000; Song, 1998)는 보고와 대체로 일치하였다(Table 6). 본 실험을 토대로 추후 발효제 중 막걸리 제조에 사용되는 누룩 및 조효소제와의 사용이 적합한 효모선발에 관한 연구를 진행하고자 한다.
- 본 연구에서는 막걸리의 품질을 안정화하고 고급화하기 위한 방법으로 막걸리 담금 시 첨가되는 발효제로 입국, 누룩, 조효소제 중 입국에 따른 적합한 효모 탐색과 효모의 대량 생산을 위해 최적 배양조건을 확립하고자 한다.
제안 방법
- , Palo Alto, CA, USA)를 이용하여 oven 70℃, injector 200℃ 그리고 detector 250℃에서 정량 분석하였다. pH와 고형분 함량은 각각 pH meter(HORIBA D-51, HORIBA Ltd., Kyoto, Japan)와 당도계(ATAGO Pocket PAL-1, ATAGO Co., Tokyo, Japan)를 사용하여 측정하였다. 총산은 시료 10 mL에 phenolphthalein 지시약 2-3 방울을 가하여 표준후탈산수소칼륨으로 표정한 0.
- 건조생산 된 효모와 입국을 사용하여 막걸리를 제조하였으며, 입국의 첨가비율은 30 sp/g이었다. 급수량은 200%이고 효모는 쌀 양의 0.
- 동정은 sequencing 전문 기관인 ‘마크로젠’에 의뢰하여 진행하였다.
- 막걸리 제조 시 입국과 함께 사용할 균주를 선발하기 위해 본 연구원내의 알코올 발효능력이 뛰어난 10균주를 대상으로 1.5 L용량의 막걸리를 제조하여 25℃에서 5일간 발효 시킨 후 알코올과 유기산 함량, 맛과 향의 관능특성을 중심으로 평가하였다(Table 1). 알코올 함량 11.
- 본 배양배지에 배양한 분리 균주를 shaking incubator에서 30℃, 120 rpm으로 24시간 동안 배양 후 배양액을 3,000 × g에서 10분간 원심분리 하였다. 분리된 균체를 증류수로 1회 세척하고 80℃에서 24시간동안 항량이 될 때까지 건조시킨 후 각각 균체의 무게를 달리하여 취하고 증류수에 현탁 시킨 후 UV/VIS spectrophotometer(Diod-Array) HP 8453(Hewlett Packard, Palo-alto, USA)를 사용하여 660 nm에서 흡광도를 측정한 표준곡선으로부터 배양액의 건조 균체량을 측정하였다(Parkand Ok, 2003).
- 선별된 최적 배지와 본 배양배지를 진탕배양하며 3시간 간격으로 흡광도를 통한 생육정도 및 건조 균체량을 측정하였다.
- 알코올 함량은 DB-ALC2 column(30 m × 0.53 mm I.D. ×2 µm film thickness: J & W Scientific, Folsom, CA, USA)이 장착된 GC(6890N, Hewlett Packard Co., Palo Alto, CA, USA)를 이용하여 oven 70℃, injector 200℃ 그리고 detector 250℃에서 정량 분석하였다.
- 전통누룩으로부터 분리한 효모 중 입국을 발효제로 사용하여 담금 막걸리의 양조적성을 확인하였다. 그 첫 단계로 본 연구원에서 보유하고 있는 알코올 발효 효모로 입국과 막걸리를 담근 결과 관능 및 이화학 분석에서 Y111-5 균주가 선별 되었다.
- 0%로접종하여 shaking incubator에서 30℃, 120 rpm으로 배양하였다. 최적 배양조건에 사용된 시약은 glucose, fructose, sucrose, high fructose syrup (DAESANG, Korea), molasses (EVER MIRACLE, Korea) 등의 탄소원 시약을 3,6,9%로 설정하였고 yeast extract(Difco, USA), Bactopeptone(Difco, USA), urea, casein, tryptone (Difco, USA), ammonium nitrate, ammonium sulfate등의 질소원 시약을 1,3,5%로 설정하였고, 별도의 표기가 되어 있지 않은 시약은 Sigma- ALDRICH, 시약을 사용하였다(Kim et al., 2006; Song and Kim, 2002).
대상 데이터
- 2. Dry yeast manufactured by Spray Dryer(Y111-5).
- 본 배양배지는 3.0%(w/v) glucose, 1.0%(w/v) yeast extract, 2.0% Bactopeptone, 0.1%(w/v) MgSO4·H2O와 0.5%(w/v) KH2PO4(pH 6.0) 사용하였다.
- 실험에 사용된 입국(koji)은 (주)서울장수에서 구입하여 사용하였고, 효모는 한국식품연구원 우리술 연구센터에서 누룩으로부터 분리하여 보존하고 있는 균주 중 알코올 발효성이 우수한 균주 10종(Y30-4, Y64-5, Y111-5, Y113-5, Y113-7, Y113-9, Y140-5, Y192-4, H3-7, H4-3)을 선발하여 사용하였고, 쌀은 철원 오대쌀을 사용하였다.
- 탄산미가 조화를 이뤄 기호도가 제일 높은 막걸리를 생산한 Y111-5 균주를 최종 우수 효모로 선발 하였다. 한편 Y111-5 효모의 18s RNA 염기서열 분석을 통한 분자생물학적 동정 결과 Saccharomyces cerevisiae이었다.
이론/모형
- 균주의 동정에는 미생물 동정에 주로 사용되고 있는 18s RNA sequencing 방법을 이용하여 실시하였다. 동정은 sequencing 전문 기관인 ‘마크로젠’에 의뢰하여 진행하였다.
- 환원당은 Dinitrosalicylic acid(DNS) Method에 따라 UV/VIS spectrophotometer (Diod-Array) HP 8453(Hewlett Packard, Palo-alto, USA)를 이용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하고 표준물질 glucose(Sigma, St. Louis, MO, USA)를 농도별로 제조하여 표준곡선과 비교하여 정량하였다(Miller, 1959; JSBA, 1993).
성능/효과
- glucose와 high fructose syrup의 경우 첨가량이 3,6,9%로 증가함에 따라 건조 균체량 또한 2~3 g/L씩 증가하는 경향을 보였으며, fructose와 sucrose는 첨가량이 6%에서 9%로 증가하여도 건조 균체량은 2 g/L 미만으로 증가하는 것으로 나타났다. Molasses의 경우 균체량의 증가 경향은 glucose와 high fructose syrup과 유사한 경향을 보였으나 생육도 및 건조 균체량이 다른 탄소원을 첨가한 배지에 비하여 가장 적게 나타났다. Y111-5균주의 생육에 적합한 탄소원은 sucrose, fructose, glucose, high fructose syrup, molasses 순으로 나타났다.
- 유기산들은 막걸리에서 미량 존재할 경우 막걸리의 맛과 향을 높이는 역할을 한다. Succinic acid는 전체적으로 0.08~ 0.20 mg/mL 함량으로 나타났고 malic acid는 0.02~0.31 mg/mL 함량을 보였다.
- 50 g/L로 최대치를 나타내어 그 이상의 첨가는 균체의 생육에 저해가 되는 것을 알 수 있었다. Urea를 1% 첨가한 경우 건조 균체량은11.85 g/L를 나타내었으나 1%를 초과하는 3,5%를 첨가한 경우엔 급격히 감소하여 생육에 도움이 되지 못하는 것을 알 수 있었으며 casein의 첨가는 12.00~12.68 g/L 수준의 건조 균체량을 보였으나 control 배지에서의 양보다 적은 것으로 나타났다. 무기질소원의 경우 (NH4)2SO4가 NH4NO3에 비하여 생육에 도움이 되는 것을 알 수 있었으며 NH4NO3는 첨가량이 0.
- 선정균주의 생육에 미치는 탄소원의 영향을 검토한 결과는 Table 4와 같다. Y111-5는 yeast extract와 tryptone의 첨가량과 건조 균체량은 비례하는 것으로 나타나 5% 첨가 시 각각 13.82, 12.54 g/L을 보였으나, Bacto-peptone의 경우 3%에서 건조 균체량이 11.50 g/L로 최대치를 나타내어 그 이상의 첨가는 균체의 생육에 저해가 되는 것을 알 수 있었다. Urea를 1% 첨가한 경우 건조 균체량은11.
- 34 g/L로 최대치를 나타내었다. control 배지에서 배양한 균은 배양 12시간 이후부터 24시까지 8.14~8.52 g/L를 나타낸 반면 최적배지에서 배양한 균은 배양 12시간에 15시간 사이에 생육이 급격히 증가하였으며 그 후 조금씩 감소하기는 하였으나 24시간까지 건조 균체량은 11.55~12.34 g/L을 나타내었다. 이상의 결과 111-5 균주의 최적 배지에서의 배양시간은 15시간이 가장 적합한 것으로 나타났다(Fig.
- 선정균주의 생육에 미치는 탄소원의 영향을 검토한 결과는 Table 3과 같다. glucose와 high fructose syrup의 경우 첨가량이 3,6,9%로 증가함에 따라 건조 균체량 또한 2~3 g/L씩 증가하는 경향을 보였으며, fructose와 sucrose는 첨가량이 6%에서 9%로 증가하여도 건조 균체량은 2 g/L 미만으로 증가하는 것으로 나타났다. Molasses의 경우 균체량의 증가 경향은 glucose와 high fructose syrup과 유사한 경향을 보였으나 생육도 및 건조 균체량이 다른 탄소원을 첨가한 배지에 비하여 가장 적게 나타났다.
- 전통누룩으로부터 분리한 효모 중 입국을 발효제로 사용하여 담금 막걸리의 양조적성을 확인하였다. 그 첫 단계로 본 연구원에서 보유하고 있는 알코올 발효 효모로 입국과 막걸리를 담근 결과 관능 및 이화학 분석에서 Y111-5 균주가 선별 되었다. 선별된 균주의 최적 배양 조건으로 기본 YPD배지 중 탄소원으로 sucrose 9%와 질소원으로 yeast extract 5% 대체하여 사용 시, 기본 YPD배지에서 6.
- 62 수준으로 나타났다. 당도는 8.9~13.8의 수준을 보였고 대부분이 완전 발효가 일어나지 않아 당분이 높게 나타나고 알코올 발효가 더디게 일어났음을 확인하였다. 알코올 발효의 기질로 이용되고 감미도에 영향을 주는 중요한 성분이며(Park and Lee, 2002) 산미, 감칠맛 등과 조화되어 막걸리의 독특한 맛에 기여하는(Lee and Lee, 2000) 환원당 함량은 7.
- 68 g/L 수준의 건조 균체량을 보였으나 control 배지에서의 양보다 적은 것으로 나타났다. 무기질소원의 경우 (NH4)2SO4가 NH4NO3에 비하여 생육에 도움이 되는 것을 알 수 있었으며 NH4NO3는 첨가량이 0.3%가 초과되는 경우 생육이 저해되는 것으로 나타났다.
- 2와 같고, 이를 이용한 막걸리의 특성은 Table 5에 나타내었다. 발효 최종 알코올 함량은 15.2%로 control에 비하여 높았으며 환원당은 13.18 mg/mL로 낮아 발효가 활발하게 일어났음을 알 수 있었다. 총산은 Y111-5 사용 막걸리가 control 사용 막걸리보다 0.
- 그 첫 단계로 본 연구원에서 보유하고 있는 알코올 발효 효모로 입국과 막걸리를 담근 결과 관능 및 이화학 분석에서 Y111-5 균주가 선별 되었다. 선별된 균주의 최적 배양 조건으로 기본 YPD배지 중 탄소원으로 sucrose 9%와 질소원으로 yeast extract 5% 대체하여 사용 시, 기본 YPD배지에서 6.33 g/L로 생산되었던 균체가 최적배지에서 13.82 g/L로 증가한 것을 확인하였다. 최적배지 선정에 이어 최적배양 시간 탐색을 위해 control배지와 최적배지를 함께 배양하여 생육곡선을 확인한 결과 최대 균체생산량은 15시간임을 확인하였다.
- 5 L용량의 막걸리를 제조하여 25℃에서 5일간 발효 시킨 후 알코올과 유기산 함량, 맛과 향의 관능특성을 중심으로 평가하였다(Table 1). 알코올 함량 11.1~14.8%를 나타내었고 Y64-5를 사용한 막걸리가 14.8%로 가장 높게 나타났다. 각각의 막걸리 pH는 발효진행 상황과 알코올 생성정도를 짐작할 수 있는 중요한 지표가 되는데(Song et al.
- 86%로 약 2배 많은 값을 나타냈다. 유기산 함량의 경우 총 6종의 유기산을 분석하였고 그 결과 lactic acid와 succinic acid가 control에 비해 Y111-5 사용 막걸리가 월등히 높게 나타났다. 담금 후 젖산균의 발효작용으로 젖산 함량이 증가되는 것으로 추측되며 모든 막걸리에서 lactic acid와 succinic acid는 유기산 중 가장 많은 함량을 차지하여 막걸리의 주 유기산으로 나타났다(Lee and Lee, 2000; Song, 1998)는 보고와 대체로 일치하였다(Table 6).
- 34 g/L을 나타내었다. 이상의 결과 111-5 균주의 최적 배지에서의 배양시간은 15시간이 가장 적합한 것으로 나타났다(Fig. 1).
- 이상의 결과 S. cerevisiae Y111-5의 생육최적 배양조건으로 배지조성은 sucrose 9%, yeast extract 5%, MgSO47H2O 0.1%, KH2PO4 0.5%와 배양시간은 15시간이었다.
- 82 g/L로 증가한 것을 확인하였다. 최적배지 선정에 이어 최적배양 시간 탐색을 위해 control배지와 최적배지를 함께 배양하여 생육곡선을 확인한 결과 최대 균체생산량은 15시간임을 확인하였다.
- 탄산미가 조화를 이뤄 기호도가 제일 높은 막걸리를 생산한 Y111-5 균주를 최종 우수 효모로 선발 하였다. 한편 Y111-5 효모의 18s RNA 염기서열 분석을 통한 분자생물학적 동정 결과 Saccharomyces cerevisiae이었다.
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