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문제 정의
- 본 연구에서는 해양 현화식물인 애기거머리말을 대상으로 인체 암세포의 종류에 따른 생리활성효과의 특이성을 파악하고, 생리활성에 의한 발암물질의 생성방지 및 생체 방어작용 그리고 더 나아가 항암물질 개발을 위한 기초 연구로서 활용할 수 있는지 탐색하고자 하였다. 따라서 애기거머리말의 추출물 및 용매 분획물을 제조하여 각 시료의 일정량을 인체 암세포들인 위암세포(AGS), 섬유육종 세포(HT-1080), 유방암세포(MCF-7)에 첨가함으로써 이들 암세포들에 대한 증식 억제효과를 검토하였다.
제안 방법
- Gallic acid를 증류수에 녹여 농도를 1250 µg/ml로 조제하고, 이를 2배씩 연속적으로 희석하여 얻어진 용액들을 이용하여 위와 동일한 방법으로 분석한 후 얻어진 표준 검량선으로부터 각 추출물과 용매분획물의 총 폴리페놀 함량을 산출하였다.
- 애기거머리말의 분획물의 MTT assay의 결과를 분석해 보면 85% aq. MeOH 분획이 세 종류 암세포 모두에 비교적 좋은 활성을 보였기 때문에 이를 고려하여 높은 암세포 성장 억제효과를 보인 AGS에 대해 apoptosis 관련 유전자들의 발현에 미치는 효과를 관찰하였다. apoptosis 관련 유전자로서는 세포사 억제 유전자인 Bcl-2 유전자와 이와 상호작용하는 Bax 유전자, 종양억제유전자로 많이 알려진 p53 유전자와 이에 의해 조절을 받는 p21 유전자의 발현양상을 비교하였다.
- 그리고 조추출물을 용매극성도에 따라 H2O, n-BuOH, 85% aq. MeOH, n-hexane 순서로 얻은 각 용매 분획물을 1 mg/ml로 희석하여 동일한 방법으로 총 폴리페놀 함량을 측정하였다. 그 결과, H2O, n-BuOH, 85% aq.
- O, n-BuOH, 85% aq. MeOH, n-hexane 순서로 용매 분획하여 그 분획물을 얻었으며 각각의 분획물을 이용하여 인체 암세포의 성장에 미치는 영향을 관찰하였다.
- MeOH 분획이 세 종류 암세포 모두에 비교적 좋은 활성을 보였기 때문에 이를 고려하여 높은 암세포 성장 억제효과를 보인 AGS에 대해 apoptosis 관련 유전자들의 발현에 미치는 효과를 관찰하였다. apoptosis 관련 유전자로서는 세포사 억제 유전자인 Bcl-2 유전자와 이와 상호작용하는 Bax 유전자, 종양억제유전자로 많이 알려진 p53 유전자와 이에 의해 조절을 받는 p21 유전자의 발현양상을 비교하였다.
- 이때 housekeeping 유전자인 GAPDH 유전자를 internal control로 사용하였다. 각 PCR 산물들은 1% agarose gel을 이용하여 전기영동하여 ethidium bromide (EtBr, Sigma)를 이용하여 염색한 후 UV 하에서 확인하였다.
- 본 연구에서는 해양 현화식물인 애기거머리말을 대상으로 인체 암세포의 종류에 따른 생리활성효과의 특이성을 파악하고, 생리활성에 의한 발암물질의 생성방지 및 생체 방어작용 그리고 더 나아가 항암물질 개발을 위한 기초 연구로서 활용할 수 있는지 탐색하고자 하였다. 따라서 애기거머리말의 추출물 및 용매 분획물을 제조하여 각 시료의 일정량을 인체 암세포들인 위암세포(AGS), 섬유육종 세포(HT-1080), 유방암세포(MCF-7)에 첨가함으로써 이들 암세포들에 대한 증식 억제효과를 검토하였다.
- MeOH 분획층에 항암 생리활성물질의 존재 가능성을 살펴볼 수 있었다. 또한 애기거머리말 추출물의 주 구성성분을 확인하기 위하여 조추출물 및 용매분획의 총 폴리페놀 함량을 분석하였다. 이미 거머리말속에 속하는 잘피 중에 한 종류인 거머리말(Zostera marina)이 높은 폴리페놀 함량을 가지고 있음이 보고된 바 있다 (Choi et al.
- 배양된 각각의 암세포는 일주일에 2-3회 refeeding하고 6-7일 만에 PBS로 세척한 후 0.05% Trypsin −0.02% EDTA로 부착된 세포를 분리하여 원심분리한 후 집적된 암세포에 배지를 넣고 피펫으로 암세포가 골고루 분산되도록 잘 혼합하여 75 ml cell culture flask에 10 ml씩 일정 수 분할하여 주입하고 계속 6-7일마다 계대 배양하여 실험에 사용하였다.
- 배양된 암세포는 well당 2×104 cells/ml가 되도록 96 well plate에 분주하여 37°C, 5% CO2 배양기에서 24시간 배양 후 전 배양에 사용된 배지를 제거하고 배지 180 µl 와 일정농도의 시료 20 µl(10% aq. DMSO)를 첨가하여 37°C, 5% CO2 배양기에서 48시간 배양하였다.
- 실험에 사용된 암세포에 RNAzol B(GIBCO, USA)를 이용하여 total RNA를 분리하였다. 분리된 RNA를 정량한 뒤, oligo dT primer(Invitrogen, USA)와 AMV reverse transcriptase를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 이 cDNA를 template를 사용하여 Bax, Bcl-2, p53, p21 유전자를 polymerase chain reaction (PCR) 방법으로 증폭하였다 (Table 1).
- 애기거머리말(Zostera japonica)를 −25°C의 냉동고에 보관하였다가 해빙하여 잘게 자른 후, acetone과 methylene chloride (1:1)의 혼합 용매를 사용하여 24시간 동안 추출한 후 여과하였다.
- 애기거머리말의 조추출물과 용매분획물을 1 mg/ml로 희석하여 총 폴리페놀 함량을 측정하였다. 그 결과, acetone/methylene chloride(A+M)과 methanol(MeOH) 추출물은 총 폴리페놀 함량이 각각 635.
- 이 과정을 2번 반복하였으며, 얻어진 추출액을 40°C 수욕 상에서 rotary vacuum evaporator (EYELA JAPAN, N-N series)로 농축하여 acetone/methylene chloride (A+M) 조추출물을 얻었다.
- 1990). 이때 생성된 formazan결정을 DMSO에 녹여서 ELISA reader(Bio-Tek instruments, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하여 억제율 (%)을 구하였다.
- 이러한 결과를 바탕으로 농도 변화에 따른 이들 유전자의 양상을 200 µg/ml, 100 µg/ml, 50 µg/ml의 처리 농도에서 관찰하였다.
- 해양 현화식물인 애기거머리말의 항암 생리활성 물질 탐색을 위한 기초 연구로서 애기거머리말의 조추출물을 이용하여 AGS 인체 위암세포, HT-1080 인체 섬유육종 세포 및 MCF-7 인체 유방암 세포에 증식에 미치는 영향을 관찰하였다. 애기거머리말의 용매추출물을 5, 10, 50, 100 및 200µg/ml로 처리한 결과 시료 처리 농도의 증가에 따라 농도 의존적으로 암세포의 증식 억제율이 증가하는 경향을 나타내었다(Fig.
대상 데이터
- AGS와 HT-1080, MCF-7 인체 암세포는 100 units/ml의 penicillin-streptomycin과 10%의 FBS가함유된 RPMI 1640을 사용하여 37°C, 5% CO2 incubator (Forma Scientific, Japan)에서 배양하였다.
- 14 g). 두 추출물을 합한 조추출물 209.73 g을 용매 극성에 따라 순차적으로 분획하고 각 분획층을 감압 농축 후 건조한 분말로 만들어 시료로 사용하였다. 이 때 얻어진 n-hexane, 85% aq.
- 본 실험에 사용한 암세포주인 AGS 인체 위암세포 (AGS human gastric adenocarcinoma cell)와 HT-1080 인체 섬유육종 세포(HT-1080 human sarcoma cell), MCF-7 인체 유방암 세포(MCF-7 human breast cancer cell)는 한국 세포주 은행(서울의대)으로부터 분양받아 배양하여 실험에 사용하였다. AGS와 HT-1080, MCF-7 인체 암세포는 100 units/ml의 penicillin-streptomycin과 10%의 FBS가함유된 RPMI 1640을 사용하여 37°C, 5% CO2 incubator (Forma Scientific, Japan)에서 배양하였다.
- 세포 배양에 필요한 Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM)은 Hyclone사(Logan, UT)에서 구입하였으며, RPMI 1640 medium, fetal bovine serum(FBS), penicillinstreptomycin, phosphate buffered saline(PBS) 등은 GIBCO사 (Grand Island, NY) 제품을 사용하였다.
- 실험에 사용된 암세포에 RNAzol B(GIBCO, USA)를 이용하여 total RNA를 분리하였다. 분리된 RNA를 정량한 뒤, oligo dT primer(Invitrogen, USA)와 AMV reverse transcriptase를 이용하여 cDNA를 합성하였다.
- 실험에 사용한 애기거머리말(Zostera japonica)는 2007년 7월 경상남도 창원시 진동면 다구리에서 직접 채집하였으며 응달에서 건조한 후 추출하기 전까지 −25℃에서 냉동 보관하였다.
- 세포 배양에 필요한 Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM)은 Hyclone사(Logan, UT)에서 구입하였으며, RPMI 1640 medium, fetal bovine serum(FBS), penicillinstreptomycin, phosphate buffered saline(PBS) 등은 GIBCO사 (Grand Island, NY) 제품을 사용하였다. 암세포의 증식 억제 효과를 실험하기 위한 시약으로 MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide]는 Sigma사(St. Louis, MO)로부터 구입하였으며, 그 외의 연구에 사용된 용매는 Junsei사(Tokyo, Japan)의 일급시약을 증류하여 사용하였다.
데이터처리
- 대조군과 각 시료로부터 얻은 실험 결과들의 유의성을 검정하기 위하여 분산분석(ANOVA)을 행한 후 p<0.05 수준에서 Duncan's multiple range test를 실시하였으며, 그 결과는 평균(Mean)±표준편차(Standard deviation, SD)로 표시하였다.
- 05 수준에서 Duncan's multiple range test를 실시하였으며, 그 결과는 평균(Mean)±표준편차(Standard deviation, SD)로 표시하였다. 모든 통계 분석은 Statistic Analysis System (v8.2 SAS Institute Inc., NC, USA) 통계프로그램을 이용하여 처리하였다.
이론/모형
- 애기거머리말로부터 얻은 추출물과 용매 분획물에 포함된 폴리페놀의 함량은 Folin-Denis 법으로 측정하였다. 추출물 및 용매분획물을 1 mg/ml의 농도로 희석시킨 후, 희석액 20 µl에 Folin-Ciocalteu's reagent solution을 500 µl를 가하고 3분간 정치시킨 뒤 10% Na2CO3 용액을 500 µl 가하여 혼합하여 20분간 정치시킨 뒤 750 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 분리된 RNA를 정량한 뒤, oligo dT primer(Invitrogen, USA)와 AMV reverse transcriptase를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 이 cDNA를 template를 사용하여 Bax, Bcl-2, p53, p21 유전자를 polymerase chain reaction (PCR) 방법으로 증폭하였다 (Table 1). 이때 housekeeping 유전자인 GAPDH 유전자를 internal control로 사용하였다.
성능/효과
- 10 µg/ml의 농도에서는 acetone/methylene chloride (A+M)와 methanol(MeOH) 추출물이 약한 암세포 성장 억제 활성을 나타내지만 농도가 증가될 때 마다 농도 의존적으로 억제 활성이 증가하였으며 200 µg/ml의 농도에 서는 각각 75.9%와 90.8%의 높은 암세포 성장 억제 활성을 나타내었다.
- AGS 세포에 200 µg/ml의 농도로 용매분획물을 처리하여 각 유전자의 발현 양상을 관찰한 결과(Fig. 6), 용매추출물에 의해 Bcl-2 유전자의 발현은 감소하였으며, Bax 유전자와 p21 유전자의 발현은 증가시켰다.
- 애기거머리말의 용매 분획물을 1, 5, 10, 50, 100 및 200 µg/ml의 농도로 첨가하여 암세포 증식억제 정도에 미치는 영향을 관찰한 결과, 85% aq. MeOH 분획층에서 농도 의존적으로 우수한 암세포 증식 억제효과를 보였으며 그 억제율은 각각 7.1, 7.1, 12.1, 42.5, 87.4, 92.3%였다. H2O 층의 경우에도 농도 의존적으로 유의적인 섬유육종 세포 성장 억제 효과를 나타내었으며 200 µg/ml의 농도에서 57%의 억제효과를 나타내었다.
- 시료처리 농도 1, 5, 10, 50, 100 및 200 µg/ml에서, 85% aq. MeOH 분획층은 대조군에 비해 각각 5.7, 10.0, 13.3, 30.0, 54.1 및 83.7%의 암세포 증식 억제효과를 나타내었으며, n-hexane 분획층은 각각 10.5, 12.1, 11.6, 15.4, 51.5 및 89.5%의 암세포 증식억제효과를 나타내었다. n-BuOH과 H2O 분획층의 경우에 모든 처리 농도에서 각각 32.
- 용매분획물 중에서 85% aq. MeOH 추출물은 다른 용매 분획물에 비해 Bax, Bcl- 2, p53, p21 등 apoptosis 관련 유전자들의 발현을 가장 적절히 조절하는 효과를 보였다.
- MeOH, n-hexane 분획물에서 526.8, 548.6, 769.5, 270.4 µg/mg의 폴리페놀을 포함하고 있음을 확인하였다(Fig. 1).
- n-BuOH 층은 200 µg/ml의 고농도 에서도 22.3%의 낮은 억제율을 보였으며 n-hexane 층의 경우에는 100 µg/ml의 농도에서는 15.3%의 낮은 억제율을 보였으나 200 µg/ml의 농도에서 약간 증가한 44.3%의 암세포 성장 억제율을 보였다.
- 그 결과, acetone/methylene chloride(A+M)과 methanol(MeOH) 추출물은 총 폴리페놀 함량이 각각 635.0, 652.2 µg/mg로 측정이 되었다.
- 동일한 조건하에서 애기거머리말의 용매 분획물을 1, 5, 10, 50, 100 및 200 µg/ml의 농도로 MCF-7 인체 유방암 세포에 처리하고 세포독성을 확인한 결과(Fig. 5) 다른 인체 암세포들과는 달리 n-hexane 층이 가장 높은 암세포 증식 억제효과를 가짐을 확인할 수 있었다.
- 시료 처리농도 100 µg/ml에서는 acetone/methylene chloride (A+M)와 methanol(MeOH) 추출물은 대조군에 비해 각각 73.4%와 75.7% 암세포 증식억제효과를 나타내었으며, 시료의 처리농도 200 µg/ml에서는 각각 82.9%와 88.0% 의 높은 암세포 증식 억제율을 보여 주었다.
- 애기거머리말의 용매추출물을 5, 10, 50, 100 및 200µg/ml로 처리한 결과 시료 처리 농도의 증가에 따라 농도 의존적으로 암세포의 증식 억제율이 증가하는 경향을 나타내었다(Fig. 2).
- 이상의 결과로부터 해양 현화식물의 한 종류인 애기거머리말은 높은 암세포성장 억제 활성을 보였으며, 특히 모든 인체 암세포에 좋은 성장억제율을 보인 애기거머리말의 85% aq. MeOH 용매분획층에서 항암 생리활성물질의 존재 가능성을 살펴볼 수 있었다.
- 이상의 결과로부터 해양 현화식물의 한 종류인 애기거머리말은 높은 암세포성장 억제 활성을 보였으며, 특히 용매 분획물 중 높은 암세포 성장억제율을 보인 애기거머리 말의 85% aq. MeOH 분획층에 항암 생리활성물질의 존재 가능성을 살펴볼 수 있었다.
후속연구
- 잘피는 잎과 땅속줄기·관다발 조직이 잘 발달되어 있으며 바다에 서식하는 해조류와는 매우 다른 바다풀로, 꽃이 피는 현화식물이며 뿌리는 식용으로도 이용된다. 따라서 해양 현화식물중에 하나인 애기거머리말은 기존의 해조류와 매우 다른 이차 대사 물질을 함유할 가능성이 매우 높으므로 이 식물에 대한 집중적인 연구를 통해 새로운 항암 생리활성물질의 개발이 기대된다.
- 잘피는 잎과 땅속줄기·관다발 조직이 잘 발달되어 있으며 바다에 서식하는 해조류와는 매우 다른 바다풀로, 꽃이 피는 현화식물이며 뿌리는 식용으로도 이용된다. 따라서 해양 현화식물중에 하나인 애기거머리말은 기존의 해조류와 매우 다른 이차 대사 물질을 함유할 가능성이 매우 높으므로 이 식물에 대한 집중적인 연구를 통해 새로운 항암 생리활성물질의 개발이 기대된다.
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