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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 9종의 주요 glucosinolate 표준물질을 이용하여 브로콜리 유전자원 중의 개별적 desulfo-glucosinolate를 동정하고 그 함량의 변이를 객관적으로 제시하고자 하였으며, 궁극적으로 glucosinolate 고함유 브로콜리의 품질육종을 위한 기초자료로 이용하기 위하여 수행되었다.
- 본 연구는 UPLC를 이용하여 국내 브로콜리 육성계통 95점의 화구 내 desulfo-glucosinolate를 표준물질과 비교하여 정량 분석하고 그 함량변이를 평가하여, 궁극적으로 고기능성 국내 브로콜리 품종 육성의 기초자료로 이용하고자 수행되었다.
제안 방법
- Desulfation된 glucosinolates는 증류수 1.5mL을 column에 가하여 추출하였고 0.2μm PTFE syringe filter를 이용하여 필터링한 후 UPLC 분석에 이용하였다.
- Desulfo-glucosinolate 동정을 위하여 photo diode array (PDA) detector가 장착된 UPLC(H-Class, Waters Co., USA)를 이용하였으며 BEH-C18 컬럼(1.7μm, 2.1 × 100mm, Waters Co., USA)으로 분리하였다.
- , Germany)을 이용하였다. 각각의 표준물질들은 25, 50, 100ppm으로 각각 희석한 후 브로콜리 시료와 동일한 방법으로 desulfation 시키고, UPLC로 분리된 피크의 머무름 시간을 이용하여 동정하였으며, 파장 229nm에서의 각 9종 표준물질들의 농도에 따른 피크의 면적을 이용하여 정량분석하였다.
- 국립원예특작과학원 보유 브로콜리 유전자원 및 육성계통 95점을 대상으로 화구 내 desulfo-glucosinolate 함량 변이를 분석․평가하였다. 국내 브로콜리 주산지인 제주 지역에서 월동 작형으로 재배된 화구를 시험재료로 이용하였다.
- 농촌진흥청 국립원예특작과학원 보유 95점의 브로콜리 유전자원 및 육성계통의 제주도에서 재배한 시료에 대하여 화구 내 주요 desulfo-glucosinolate 종류를 표준물질의 UPLC chromatogram과 비교하여 동정하고 각 개별 glucosinolate의 함량변이를 평가하였다. 비교대상으로 이용한 총 9종의 glucosinolate 표준물질 중 브로콜리 화구에는 6종의 glucosinolates (progoitrin, glucoraphanin, sinigrin, gluconapin, glucobrassicanapin, 및 glucobrassicin)가 동정되었으며, 그 중에서 glucobrassicin (indole 형)을 제외한 5종은 aliphatic형 glucosinolates이었고, 모든 glucosinolates는 8분 이내에 분리되었다(Table 1).
- 미리 추출해 놓은 glucosinolate 추출액 전체를 DEAE-Sephadex A 25가 충진된 column에 가한 후, 10unit의 aryl sulfatase(EC 3.1.6.1, type H-1 from Helix pomatia) 200μL를 가하고 상온조건에서 24시간 동안 desulfation 시켰다.
- 95점의 브로콜리 계통을 8월 25일에 파종하고 9월 25일에 정식한 후 다음 해 1월부터 2월까지 계통별 최적 수확기에 화구를 채취하였다. 브로콜리 95계통에 대하여 수확 적기의 건전한 화구를 각각 3개씩 채취하여 가식부위를 절단한 후골고루 혼합하여 계통별로 균일한 시료가 포함되도록 하였다. 1차 조제된 브로콜리 시료는 -70℃ 냉동고에 보관하였으며, 순차적으로 동결건조하여 분말화한 후 glucosinolate 분석을 위하여 -20℃ 냉동고에 보관하였다.
- 브로콜리 화구 내 glucosinolate 함량변이의 분석에는 Sigmaplot 11.2(Systat Co., USA)와 SAS 9.1을 이용하였다. 개별 glucosinolate 정량분석을 위하여 균질화된 시료를 이용하여 3반복으로 분석하였으며, 계통별 평균함량은 평균과 표준오차(SE)로서 표시하였다.
- 동결건조 후 마쇄된 계통별 브로콜리 화구 시료 100mg을 1mL의 끓는 70% methanol로 20분간 추출하고, 4℃에서 10분간 12,000rpm으로 원심분리하여 glucosinolates를 추출하였으며, 이 과정을 3회 반복한 후 상등액을 별도의 용기에 모두 모아 -20℃에서 냉동상태로 보관하였다. 브로콜리 화구로부터 1차 추출한 glucosinolates를 탈황산(desulfation)화 하기 위하여 별도의 Bio-Spin chromatography column(1.2mL bed volume, Bio-Rad Co., USA)을 이용하였다. Column에 충진 시키는 DEAE-Sephadex A 25(Sigma-Aldrich Co.
- 용매는 물(A)과 20%(v/v) acetonitrile(B)을 이용하여 1-99% gradient 변화로 0.2mL․min–1 조건에서 분석하였다(총 머무름시간 15분).
- 제주도에서 재배한 95점 브로콜리 육성계통의 화구에서 동정된 6종 glucosinolate들의 함량변이를 평가하였다(Fig. 2). 총 함량에 있어서는 4.
대상 데이터
- 국내 브로콜리 주산지인 제주 지역에서 월동 작형으로 재배된 화구를 시험재료로 이용하였다. 95점의 브로콜리 계통을 8월 25일에 파종하고 9월 25일에 정식한 후 다음 해 1월부터 2월까지 계통별 최적 수확기에 화구를 채취하였다. 브로콜리 95계통에 대하여 수확 적기의 건전한 화구를 각각 3개씩 채취하여 가식부위를 절단한 후골고루 혼합하여 계통별로 균일한 시료가 포함되도록 하였다.
- 국내 브로콜리 주산지인 제주 지역에서 월동 작형으로 재배된 화구를 시험재료로 이용하였다. 95점의 브로콜리 계통을 8월 25일에 파종하고 9월 25일에 정식한 후 다음 해 1월부터 2월까지 계통별 최적 수확기에 화구를 채취하였다.
- 브로콜리 화구에 존재하는 glucosinolates를 동정하기 위하여, glucoiberin, progoitrin, glucoraphanin, sinigrin, gluconapin, glucobrassicanapin, glucoerucin, glucobrassicin, gluconasturtiin 의 총 9종의 표준물질(Cfm Oskar Tropitzsch Co., Germany)을 이용하였다. 각각의 표준물질들은 25, 50, 100ppm으로 각각 희석한 후 브로콜리 시료와 동일한 방법으로 desulfation 시키고, UPLC로 분리된 피크의 머무름 시간을 이용하여 동정하였으며, 파장 229nm에서의 각 9종 표준물질들의 농도에 따른 피크의 면적을 이용하여 정량분석하였다.
데이터처리
- Pearson’s correlation coefficients for the individual desulfo-glucosinolate contents.
- 1을 이용하였다. 개별 glucosinolate 정량분석을 위하여 균질화된 시료를 이용하여 3반복으로 분석하였으며, 계통별 평균함량은 평균과 표준오차(SE)로서 표시하였다. 개별 glucosinolate 상관분석 에는 Pearson 상관분석법(P ≤ 0.
이론/모형
- 개별 glucosinolate 상관분석 에는 Pearson 상관분석법(P ≤ 0.05)을 사용하였다.
성능/효과
- 본 연구를 통해 브로콜리에서 동정된 6종의 glucosinolate 종류는 기존의 보고와 일치하고 있고 브로콜리의 glucosinolate 함량을 결정하는 주요 물질로 확인되었다.
- 13종의 제한된 유전자원에서 가장 낮은 평균 함량 범위를 보인 progoitrin의 경우, 계통에 따라서는 최대 6.7μmol․g–1 DW의 높은 함량을 나타내어 progoitrin의 동물에 대한 유해성 관련 기존 결과(Chavadej et al., 1994; Ratzka et al., 2002)에 비추어 볼 때, 내적 성분을 목표로 한 선발에 있어서 glucoraphanin과 함께 필수적으로 고려해야 할 성분인 것으로 판단되었다.
- 4). Glucoraphanin 함량이 높았던 상위 10%의 계통들은 glucobrassicanapin 함량도 높은 경향이었으며, 반면 하위 10%의 계통들은 4종 주요 glucosinolate의 함량은 낮으나 progoitrin의 함량이 높은 경향이었다(Fig. 4). 개별적 glucosinolate의 상관분석 결과, 핵심 기능성 물질인 glucoraphanin은 gluconapin(r = 0.
- 또한 본 연구의 glucosinolate 분석은 일반적으로 통용되고 있는, 표준종자물질(BCR367등)과의 비교나 LC-MS에 대한 개별 물질의 분자량 확인 작업이 아닌, 표준물질에 의한 동정과 정량분석을 수행한 것으로서 브로콜리 유전자원 중에 존재하는 주요한 6종 glucosinolate에 대한 객관적인 변이의 평가가 가능하여, 향후 다른 배추과 작물의 기능성 물질 변이 평가에 있어서도 유용한 자료가 될 것으로 판단된다. 개별 물질들 중 glucoraphanin이 가장 변이에 크게 기여하였으며 glucoraphanin 의 함량이 높은 계통들은 glucobrassicanapin 등 다른 aliphatic glucosinolate 함량도 높은 경향이었다. 계통에 따른 progoitrin의 함량은 품종 특이적인 함량 특성을 보였고 핵심 glucosinolate인 glucoraphanin과 progoitrin은 부의 상관 관계가 있음이 확인되었다.
- 8%를 설명할 수 있었다. 개별적 glucosinolate 종류 중 glucobrassicanapin, glucoraphanin, glucobrassicin 및 gluconapin의 4종 glucosinolates가 전체 브로콜리 유전자원의 변이에 크게 영향을 미쳤고, glucoraphanin 함량이 상대적으로 낮았던 계통들의 경우 progoitrin과 sinigrin의 함량이 변이에 중요하게 작용하였다. 따라서 브로콜리의 glucosinolate 종류별 질적인 함량변이는 평균함량이 가장 높았던 glucoraphanin 과 aliphatic glucosinolate인 glucobrassicanapin, gluconapin 의 4종 glucosinolates에 의해 결정되는 것으로 판단되었다 (Fig.
- 4). 개별적 glucosinolate의 상관분석 결과, 핵심 기능성 물질인 glucoraphanin은 gluconapin(r = 0.8183), glucobrassicanapin(r = 0.9786), glucobrassicin(r = 0.8924)과 높은 상관을 보였고 이들 4종 물질들은 상호간에도 높은 정의 상관관계가 있음이 확인되었으며 progoitrin과는 부의 상관관계(r = -0.2143)가 인정되었다(Table 2).
- 개별 물질들 중 glucoraphanin이 가장 변이에 크게 기여하였으며 glucoraphanin 의 함량이 높은 계통들은 glucobrassicanapin 등 다른 aliphatic glucosinolate 함량도 높은 경향이었다. 계통에 따른 progoitrin의 함량은 품종 특이적인 함량 특성을 보였고 핵심 glucosinolate인 glucoraphanin과 progoitrin은 부의 상관 관계가 있음이 확인되었다.
- 동정된 glucosinolate 중 glucobrassicanapin, glucoraphanin, glucobrassicin 및 gluconapin의 4종 물질이 전체 브로콜리 계통의 함량변이에 크게 영향 하였고 이들 4종 물질 상호 간에는 높은 정의 상관관계가 있음이 확인되었다.
- 따라서 본 연구에서 브로콜리 화구에서는 품종에 따라 최대 6종의 개별적 glucosinolates가 표준물질과의 비교를 통해 동정되었으며 1개의 명확한 추가 피크(4-methoxyglucobrassicin 또는 neo-glucobrassicin)가 존재함이 추정되었다. 브로콜리 화구에 존재하는 glucosinolate 종류는 연구자에 따라 달리 보고된 바 있는데, Lee et al.
- 개별적 glucosinolate 종류 중 glucobrassicanapin, glucoraphanin, glucobrassicin 및 gluconapin의 4종 glucosinolates가 전체 브로콜리 유전자원의 변이에 크게 영향을 미쳤고, glucoraphanin 함량이 상대적으로 낮았던 계통들의 경우 progoitrin과 sinigrin의 함량이 변이에 중요하게 작용하였다. 따라서 브로콜리의 glucosinolate 종류별 질적인 함량변이는 평균함량이 가장 높았던 glucoraphanin 과 aliphatic glucosinolate인 glucobrassicanapin, gluconapin 의 4종 glucosinolates에 의해 결정되는 것으로 판단되었다 (Fig. 4). Glucoraphanin 함량이 높았던 상위 10%의 계통들은 glucobrassicanapin 함량도 높은 경향이었으며, 반면 하위 10%의 계통들은 4종 주요 glucosinolate의 함량은 낮으나 progoitrin의 함량이 높은 경향이었다(Fig.
- 반면 PR96-1 계통의 glucoraphanin 함량은 평균 1.6μmol․g-1 DW로, 최대 함량을 보였던 M448 계통에 비해 8.7배 낮은 함량을 보였고, progoitrin 함량은 3.7μmol․g-1 DW의 비교적 높은 함량을 나타내어, 계통에 따라 개별적 glucosinolate 함량과 질적인 변이의 차이가 큰 것으로 나타났다.
- 본 연구의 결과로, 광범위한 유전자원 집단에 대한 개별적 glucosinolate의 정량분석 결과, progoitrin과 sinigrin의경우 낮은 평균함량(0.40-0.41μmol․g-1 DW)으로, gluconapin, glucobrassicanapin, glucobrassicin의 3종 물질은 중간 정도의 평균함량(1.47-2.24μmol․g-1 DW)의 변이를 보였으며, glucoraphanin이 가장 높은 함량으로 분포하는 것으로 확인되 었다.
- 브로콜리 화구에서 9종의 표준물질과 비교하여 progoitrin, glucoraphanin, sinigrin, gluconapin, glucobrassicanapin 및 glucobrassicin 등 6종의 glucosinolate가 동정되었다. 전체 브로콜리 육성계통 95점에 대해서 총 glucosinolate 함량은 4.
- 브로콜리 화구에서의 desulfo-glucosinolate 동정은 별도로 이용한 9종의 표준물질과의 비교를 통해 수행되었으며(Fig.1), 총 9종의 glucosinolate 각각 표준물질들은 본 실험의 UPLC 분석조건에 의하여 명확히 분리 동정되었다(Fig. 1A). 브로콜리에서 핵심 기능성 물질로 알려져 있는 glucoraphanin 함량이 낮은 계통(PR96-1)의 경우, 총 6종의 서로 다른 glucosinolates가 동정되었으나(Fig.
- 1A). 브로콜리에서 핵심 기능성 물질로 알려져 있는 glucoraphanin 함량이 낮은 계통(PR96-1)의 경우, 총 6종의 서로 다른 glucosinolates가 동정되었으나(Fig. 1B and Table 1), glucoraphanin 함량이 상대적으로 높은 계통(M448)의 경우에는 progoitrin, gluconapin, 및 glucobrassicanapin은 동정 되지 않았거나 미미한 농도로 존재함이 확인되었다(Fig.1C). 대부분의 브로콜리 화구 시료에서 9종 glucosinolate 표준물질에 해당하지 않는 RT = 11.
- 비교대상으로 이용한 총 9종의 glucosinolate 표준물질 중 브로콜리 화구에는 6종의 glucosinolates (progoitrin, glucoraphanin, sinigrin, gluconapin, glucobrassicanapin, 및 glucobrassicin)가 동정되었으며, 그 중에서 glucobrassicin (indole 형)을 제외한 5종은 aliphatic형 glucosinolates이었고, 모든 glucosinolates는 8분 이내에 분리되었다(Table 1).
- 주성분 분석 결과, 주성분 1(Prin 1)로 전체 변이의 63.3%를 설명할 수 있었고 주성분 2(Prin 2)로는 전체 변이의 21.8%를 설명할 수 있었다. 개별적 glucosinolate 종류 중 glucobrassicanapin, glucoraphanin, glucobrassicin 및 gluconapin의 4종 glucosinolates가 전체 브로콜리 유전자원의 변이에 크게 영향을 미쳤고, glucoraphanin 함량이 상대적으로 낮았던 계통들의 경우 progoitrin과 sinigrin의 함량이 변이에 중요하게 작용하였다.
- 총 glucosinolate 중 glucoraphanin의 함량은 1.6-13.9μmol․g-1 DW로 가장 높은 비율을 차지하였고 progoitrin은 제한적인 13개의 계통에 서만 특이적으로 함유되어 있었으며 glucoraphanin의 함량과는 부의 상관관계를 보였다.
- 총 glucosinolate 함량은 15.9-59.3μmol․g-1 DW 범위로 본 연구에 비해 다소 높은 변이 폭을 보였다.
- 총 함량 중 glucoraphanin이 높은 비율을 차지하고 있었으며, 최소 1.6μmol․g-1 DW, 최대 13.9μmol․g-1 DW의 함량을 보였다.
- 총 함량에 있어서는 4.2-29.0μmol․g-1 dry weight(DW)의 범위로 확인되었으며 전체 95계통에 대한 평균 함량은 10.9μmol․g-1 DW이었다.
- 8μmol․g-1 DW)의 5종 glucosinolate은 최대 함량을 보이는 계통들에 있어서도 평균 glucoraphanin 함량에 미치지 못하였다. 특히 progoitrin의 경우 95 공시계통 중 13종 계통의 화구에서만 존재하는 것으로 나타나 유전자원 및 계통에 따라 변이가 극명히 다른, 계통 특이적인 물질로 확인되었다. 본 연구의 결과로, 광범위한 유전자원 집단에 대한 개별적 glucosinolate의 정량분석 결과, progoitrin과 sinigrin의경우 낮은 평균함량(0.
후속연구
- 결론적으로, 본 연구는 glucosinolate 표준물질과 비교 하여 국내 브로콜리 육성계통 및 유전자원에 대한 주요 glucosinolate 변이를 폭넓은 유전자원을 대상으로 평가한 것으로서, 향후 브로콜리 품질육종을 위한 중요한 근거자료로 이용될 수 있을 것으로 판단된다.
- 그리고 이와는 별도로 progoitrin 함량이 높은 특이 계통과 그 함량이 상대적으로 낮은 일반 계통과의 대사 생리적 차이에 대한 구명이 추가 적으로 필요할 것으로 보이며, 향후 glucosinolate의 개별적 함량에 있어서의 질적․양적 차이에 대한 체계적인 평가가 국내 배추과 작물 전반에 대하여 연구될 필요가 있을 것으로 판단된다.
- 또한 본 연구의 glucosinolate 분석은 일반적으로 통용되고 있는, 표준종자물질(BCR367등)과의 비교나 LC-MS에 대한 개별 물질의 분자량 확인 작업이 아닌, 표준물질에 의한 동정과 정량분석을 수행한 것으로서 브로콜리 유전자원 중에 존재하는 주요한 6종 glucosinolate에 대한 객관적인 변이의 평가가 가능하여, 향후 다른 배추과 작물의 기능성 물질 변이 평가에 있어서도 유용한 자료가 될 것으로 판단된다.
- Progoitrin은 dihomo-methionine으로부터 시작하여 glucoraphanin으로, 다시 gluconapin으로 chain elongation되며 최종적으로 progoitrin 으로 합성되는데, glucoraphanin과 progoitrin의 함량간 부의 상관관계가 나타나며 일부 계통에서만 특이적으로 progoitrin 이 검출되는 것은 chain elongation 과정에 관여하는 GSLALK 또는 GSL-OH 효소의 활성에 있어서의 계통간 유전적 특성의 차이 때문으로 추정해 볼 수 있다. 또한 브로콜리에 있어서 glucoraphanin 함량을 높이기 위해서는 하위단계 생성 물질인 gluconapin이나 progoitrin으로의 전환을 억제하는 육종적, 생명공학적 전략이 가능할 것으로 판단된다.
- 반면, 미량으로 존재하는 물질에 대해서는 6-14종으로 연구자에 따라 달리 동정되었으며, 이들 동정 물질들의 상호관계와 질적인 함량 차이에 대한 정보 역시 부족한 상태로 이에 대한 추가 검토가 필요할 것으로 판단된다. 또한 본 연구의 glucosinolate 분석은 일반적으로 통용되고 있는, 표준종자물질(BCR367등)과의 비교나 LC-MS에 대한 개별 물질의 분자량 확인 작업이 아닌, 표준물질에 의한 동정과 정량분석을 수행한 것으로서 브로콜리 유전자원 중에 존재하는 주요한 6종 glucosinolate에 대한 객관적인 변이의 평가가 가능하여, 향후 다른 배추과 작물의 기능성 물질 변이 평가에 있어서도 유용한 자료가 될 것으로 판단된다.
- 동정된 glucosinolate 중 glucobrassicanapin, glucoraphanin, glucobrassicin 및 gluconapin의 4종 물질이 전체 브로콜리 계통의 함량변이에 크게 영향 하였고 이들 4종 물질 상호 간에는 높은 정의 상관관계가 있음이 확인되었다. 본 연구결과에서 선발된 브로콜리 유망 계통에 대해서는, 향후 재배 작형 및 연차간 물질함량의 안정성 평가와 유전자원 간 추가적인 비교평가 연구를 통하여 고기능성 육종소재로의 개발이 가능할 것으로 판단된다.
- 이들 중 M448과 EM478의 계통들은 desulfoglucoraphanin 함량으로서 10μmol․g-1 DW을 상회하는 계통으로 확인되어 향후 고품질 육종의 소재로서 활용 가치가 높을 것으로 판단되었다.
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