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문제 정의
- 다음으로 동과자 에탄올 추출물이 세포 내 지방 축적을 감소시키는 기전을 확인하기 위하여, 동과자 에탄올 추출물이 fatty acid synthesis와 β-oxidation 관련 유전자들에 대해 미치는 영향을 조사하였다.
- 이러한 가설을 확인하기 위하여HepG2 cell에 palmitate를 처리하여 유도한 지방간 질환 세포 모델에 동과자 에탄올 추출물이 미치는 영향을 관찰하고, 동과자의 anti-lipogenic effect의 기전을 이해하기 위해, 동과자 에탄올 추출물이 lipogenesis에 관여하는 LXRα, SREBP-1c, ACC, FAS, SCD-1 과 β-oxidation에 관여하는 CPT-1, PPARα에 미치는 영향을 관찰하여 그 결과를 보고하는 바이다.
- 이에 저자는 이러한 문헌기록과 현대연구들을 바탕으로 동과자가 지방간에도 효능이 있을 것으로 추정하였다. 이러한 가설을 확인하기 위하여HepG2 cell에 palmitate를 처리하여 유도한 지방간 질환 세포 모델에 동과자 에탄올 추출물이 미치는 영향을 관찰하고, 동과자의 anti-lipogenic effect의 기전을 이해하기 위해, 동과자 에탄올 추출물이 lipogenesis에 관여하는 LXRα, SREBP-1c, ACC, FAS, SCD-1 과 β-oxidation에 관여하는 CPT-1, PPARα에 미치는 영향을 관찰하여 그 결과를 보고하는 바이다.
제안 방법
- Lipogenesis 관련 유전자들의 발현을 semi-quantitative RT-PCR을 이용하여 확인하였다. RNeasy Mini Kit(Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 total RNA를 추출하고, M-MLV Reverse Transcriptase(Promega, Madison, WI, USA)를 이용하여 추출된 total RNA를 역전사하여 cDNA를 합성하였다.
- MTT assay를 통해 세포 활성도를 측정하였다. 96-well plate에 104 cells/well의 밀도로 HepG2 Cell을 seeding하였다.
- Nuclear protein은 NE-PER™ nuclear extraction kit(Thermo Scientific, IL, USA)를 이용하여 추출하였다.
- PBS로 세척 후, 상온에서 5분간 Nile Red(100 ng/ml)를 처리하여 세포 내 중성 지방을 염색하였다. Olympus FV-1000 confocal laser scanning microscope(Tokyo, Japan)를 이용하여 촬영하고, Image J 1.46 software를 이용하여 형광을 정량화하였다.
- Lipogenesis 관련 유전자들의 발현을 semi-quantitative RT-PCR을 이용하여 확인하였다. RNeasy Mini Kit(Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 total RNA를 추출하고, M-MLV Reverse Transcriptase(Promega, Madison, WI, USA)를 이용하여 추출된 total RNA를 역전사하여 cDNA를 합성하였다. TaqPCRx DNA Polymerase(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)와 각각의 primer(Bioneer)를 사용하여 합성된 cDNA를 증폭하였으며, 각각의 primer는 아래과 같다.
- RNeasy Mini Kit(Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 total RNA를 추출하고, M-MLV Reverse Transcriptase(Promega, Madison, WI, USA)를 이용하여 추출된 total RNA를 역전사하여 cDNA를 합성하였다. TaqPCRx DNA Polymerase(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)와 각각의 primer(Bioneer)를 사용하여 합성된 cDNA를 증폭하였으며, 각각의 primer는 아래과 같다. 증폭된 DNA는 1.
- Total cell lysate는 protease inhibitor Cocktail(Roche, Indianapolis, IN, USA)를 포함한 radioimmunoprecipitation assay(RIPA) buffer(50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% sodium orthovanadate, 1% Triton X-100, 0.5% deoxycholate, 0.1% SDS)를 사용하여 추출하였다. Nuclear protein은 NE-PER™ nuclear extraction kit(Thermo Scientific, IL, USA)를 이용하여 추출하였다.
- 다음으로 SREBP-1c의 타겟 효소들로서 Fatty acid 합성에 관여하는 ACC, FAS, SCD-1에 동과자 에탄올 추출물이 미치는 영향을 조사하였다. T0901317 10μM 24시간 처리에 의해 ACC, FAS, SCD-1 mRNA level 또한 증가하였으며, LXR agonist에 의한 lipogenic genes의 발현 증가 역시 동과자 에탄올 추출물을 함께 투여할 경우 통계적으로 유의하게 감소하였다(Fig.
- 동과자 에탄올 추출물을 10 μg/ml 에서 1000 μg/ml 사이의 여러 농도로 투약하고 24시간 배양한 다음 MTT assay로 HepG2 cell의 활성도를 측정하였다.
- 동과자 에탄올 추출물이 β-oxidation에 미치는 영향을 관찰하기 위해 HepG2 cell에 동과자 에탄올 추출물을 투여하고 PPAR-α, CPT-1의 변화를 관찰하였다.
- 동과자 에탄올 추출물이 간세포 내 지방 축적을 감소시키는지 확인하기 위해 palmitate를 처리하여 유발한 비알코올지방간 세포 모델에 동과자 에탄올 추출물을 처리하였다. HepG2 cell에 지방증을 유발시키기 위해 1% bovine serum albumin을 포함한 배지에서 0.
- 동과자 에탄올 추출물이 세포 내 지방 축적을 감소시키는 기전을 확인하기 위하여, lipogenesis를 유발하는 주요 신호 체계인 LXRα-SREBP-1c pathway에 동과자 에탄올 추출물이 미치는 영향을 조사하였다.
- 동과자 에탄올 추출물이 세포 독성을 유발하지 않는 한계 농도를 확인하기 위해 MTT assay를 시행하였다. 동과자 에탄올 추출물을 10 μg/ml 에서 1000 μg/ml 사이의 여러 농도로 투약하고 24시간 배양한 다음 MTT assay로 HepG2 cell의 활성도를 측정하였다.
- 본 연구에서는 이러한 문헌기록과 현대연구들을 바탕으로 동과가 지방간에도 효능이 있을 것으로 추정하였고, 이러한 가설을 확인하기 위하여 HepG2 cell에 palmitate를 처리하여 유도한 지방간질환 세포 모델을 이용하였다. 동과자 에탄올 추출물이 간세포 내 지방 축적을 감소시키는지 확인하기 위해 palmitate와 함께 동과자 에탄올 추출물을 처리하고, Nile Red staining을 통해 세포 내 축적된 지방을 관찰한 결과 동과자 에탄올 추출물을 동시에 투여한 경우 지방 축적 정도가 통계적으로 유의하게 감소하는 것을 확인하였다.
- TaqPCRx DNA Polymerase(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)와 각각의 primer(Bioneer)를 사용하여 합성된 cDNA를 증폭하였으며, 각각의 primer는 아래과 같다. 증폭된 DNA는 1.2% agarose gel에 전기영동하고 ethidium bromide으로 염색 후 자외선으로 band를 확인하였으며, GAPDH를 control로 사용하였다.
- 하룻밤 경과 후, 준비된 동과자 에탄올 추출물(10, 50, 100, 500, 1000 μg/ml)을 투약하고 24시간 배양하였다.
- 한편 동과자 에탄올 추출물이 β-oxidation에 미치는 영향을 관찰하기 위해 HepG2 cell에 동과자 에탄올 추출물을 투여하고 β-oxidation에 관여하는 것으로 알려진 PPAR-α 32,33와 CPT-134의 변화도 확인하였다.
대상 데이터
- Human hepatocellular carcinoma 세포주인 HepG2 cell을 American Type Culture Collection(Manassas, VA, USA)로부터 구입하였다. 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin 및 10% heat-inactivated fetal bovine serum을 포함한 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)을 이용하여, 37 ℃, 5% CO2 환경에서 배양하였다.
- SREBP-1 antibody(SC8984), Lamin A/Cantibody(SC7293), CPT-1 antibody(SC98834), PPARα(SC9000), β-Actin(SC47778) 및 horseradish peroxidase(HRP)-conjugated goat anti-rabbit IgG(SC2004)는 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였다.
- 5 mM, 용매에 대하여 1% 농도였다. 배양액은 1% bovine serum albumin을 함유한 DMEM을 사용하였다.
- 실험에 사용된 동과자는 대한약전외한약(생약) 규격집에 근거하여 (주)옴니허브로부터 구매한 것을 사용하였다. 동과자 200 g을 정량하여 제분기로 분쇄하였다.
- 각 well에 MTT (final concentration, 500 μg/ml)를 처리하고 4시간 뒤 medium을 제거하였다. 활성이 있는 세포들이 MTT를 환원하여 생성한 formazan crystal을 DMSO를 사용하여 용해하였고, background subtraction을 630 nm로 하고 570 nm에서의 흡광도를 측정하였다.
데이터처리
- 모든 측정값은 평균(mean) ± 표준오차(SEM)으로 표시하였다. One-way analysis of variance(ANOVA) test 로 그룹 간 비교를 시행하였고, 사후분석은 Turkey test를 사용하였다. 모든 검정에서 P＜0.
- 모든 측정값은 평균(mean) ± 표준오차(SEM)으로 표시하였다.
성능/효과
- Palmitate에 의해 세포 내 지방 축적이 증가한 것을 Nile Red staining을 통해 확인할 수 있었으며, Palmitate에 의해 발생한 세포 내 지방 축적은 동과자 에탄올 추출물 300 μg/ml이 함께 투여된 경우 통계적으로 유의하게 감소하였다(Fig. 2).
- T0901317 10μM 24시간 처리에 의해 ACC, FAS, SCD-1 mRNA level 또한 증가하였으며, LXR agonist에 의한 lipogenic genes의 발현 증가 역시 동과자 에탄올 추출물을 함께 투여할 경우 통계적으로 유의하게 감소하였다(Fig. 4).
- T0901317에 의해 LXRα mRNA 발현이 증가되는 것을 확인하였으며, 동과자 에탄올 추출물을 함께 투여할 경우 LXRα mRNA 발현 증가가 억제되었다(Fig. 3A).
- 본 연구에서는 이러한 문헌기록과 현대연구들을 바탕으로 동과가 지방간에도 효능이 있을 것으로 추정하였고, 이러한 가설을 확인하기 위하여 HepG2 cell에 palmitate를 처리하여 유도한 지방간질환 세포 모델을 이용하였다. 동과자 에탄올 추출물이 간세포 내 지방 축적을 감소시키는지 확인하기 위해 palmitate와 함께 동과자 에탄올 추출물을 처리하고, Nile Red staining을 통해 세포 내 축적된 지방을 관찰한 결과 동과자 에탄올 추출물을 동시에 투여한 경우 지방 축적 정도가 통계적으로 유의하게 감소하는 것을 확인하였다. 다음으로 동과자 에탄올 추출물이 세포 내 지방 축적을 감소시키는 기전을 확인하기 위하여, 동과자 에탄올 추출물이 fatty acid synthesis와 β-oxidation 관련 유전자들에 대해 미치는 영향을 조사하였다.
- 따라서, 동과자 에탄올 추출물이 비알코올성 지방간을 완화시키는 기전이 β-oxidation을 증가시키는 방법을 통해 일어날 가능성은 비교적 낮은 것으로 추정되었다.
- 본 실험에서는 LXRα agonist인 T0901317을 처리하여 LXRα, SREBP-1c, ACC, FAS 및 SCD-1의 발현을 증가시켰으며, 동과자 에탄올 추출물을 함께 투여할 경우 이들 유전자의 발현이 모두 감소하는 것을 확인하였다.
- 본 실험에서도 HepG2 cell에 T0901317 10μM을 24시간 처리한 경우 LXRα mRNA의 증가와 함께, SREBP-1cmRNA 와 SREBP-1c protein의 발현도 증가하는 것이 확인되었다.
- 이 결과로 동과자 에탄올 추출물이 1000 μg/ml 이하의 농도에서는 HepG2 cell에 세포 독성을 유발하지 않음을 확인하였으며, 세포 독성을 일으키는 한계 농도를 확인하지는 못하였으나 동과자의 안전 범위가 매우 넓을 것으로 추정할 수 있었다.
- 2). 이 결과로 동과자 에탄올 추출물이 세포 내 지방 축적을 주요 특징으로 하는 실제 비알코올성 지방간질환에서도 지방증을 감소시키는 효과가 있을 것으로 추정할 수 있었다.
- 이상의 결과를 요약하면 동과자 에탄올 추출물은 비알코올성 지방간 실험 모델에 있어서 유의한 지방증 완화 작용이 있는 것으로 판단되며, 이러한 반응이 LXRα-SREBP-1c signal pathway를 통해 lipogenic enzyme들이 발현되는 과정을 억제함으로써 나타난다는 것을 알게 되었다.
후속연구
- 이상의 결과를 요약하면 동과자 에탄올 추출물은 비알코올성 지방간 실험 모델에 있어서 유의한 지방증 완화 작용이 있는 것으로 판단되며, 이러한 반응이 LXRα-SREBP-1c signal pathway를 통해 lipogenic enzyme들이 발현되는 과정을 억제함으로써 나타난다는 것을 알게 되었다. 이러한 결과는 한의학에서의 동과자 사용에 대한 현대의학적 근거가 될 수 있으며, 향후 추가적인 연구가 진행된다면 비알코올성 지방간질환의 새로운 치료제로도 활용될 수 있을 것으로 생각된다.
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