선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 이에 본 연구에서는 다양한 효능을 나타내는 상황, 능이, 차가, 노루궁뎅이 그리고 청버섯의 열수 추출물의 항염증 효과를 검증하여 버섯을 이용한 생리 기능성 바이오 소재 개발 및 조리 연구를 위한 기초자료로 활용하고자 한다.
- 본 연구에서는 이렇게 LPS에 의해 생성된 NO 의 저해활성을 노루궁뎅이버섯 추출물을 이용하여 확인하였고 좀 더 심도 있는 연구를 진행하고자 NO생성에 직접적인 영향을 미치는 iNOS 및 NO 에 의해 활성화 되어 염증을 유도하는 COX-2의 발현에 대하여 단백질 발현량 분석을 실시하였다.
- 본 연구에서는 항염증 효과의 기전 중 iNOS와 COX-2의 발현을 억제하는 것을 확인하였다. 하지만 추가적으로 두 단백질의 발현 조절에 관여하는 세포내 주요 인자에 대한 연구가 필요하다.
- 또한, 버섯이라는 천연자원을 이용하였기 때문에 부작용의 문제에서도 자유로울 수 있다고 판단되어지며 추가적으로 염증 반응을 일으키는 기본적인 세포의 산화적 요인에도 적용하여 연구를 폭 넓게 접근할 필요성이 있다. 이러한 기초 연구는 조리업과 외식업계에 버섯류의 효능에 대한 과학적 데이터를 제시함으로써 버섯의 효능도 알리면서 소득 및 매출증대에도 큰 영향을 미칠 것으로 예상되어지는 바이다.
- 본 연구에서는 상황, 능이, 차가, 노루궁뎅이 그리고 청버섯으로부터 열수 추출물의 항염증 효능을 탐색하였다. 5종류의 버섯 열수 추출물을 이용 하여 정상 마크로파지 세포에서 노루궁뎅이버섯 열수 추출물은 NO의 저해 효능도 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다.
제안 방법
- 상황, 능이, 차가, 노루 궁뎅이 그리고 청버섯 건조 분말 시료 50 g에 3차 멸균 증류수 1 L를 첨가하여 추출 하였고 같은 과정을 3회 반복하여 여과지(No. 5, Whatman, Maidstone, England)로 잔재물을 제거한 후 rotary vacuum evaporator(EYELA, Tokyo, Japan)로 농축하고 동결건조 하여 시료화 한 후 –20℃에서 보관하여 사용하였다.
- RAW 264.7 세포를 24-well plates에 5×104 cells/well이 되도록 분주하고 12시간 배양한 후 버섯 추출물을 0, 0.125, 0.25, 0.5 그리고 1.0 mg/mL과 LPS 0.1 μg/mL의 농도로 동시 처리 또는 LPS 단독 처리하여 18시간을 배양하였다.
- 세포를 24-well plates에 5×104 cells/mL 농도로 1.0 mL씩 분주한 뒤 24시간 동안 배양하고 각 시료를 최종 농도(0, 0.125, 0.25, 0.5, 1.0 그리고 2.0 mg/mL)가 되도록 세포에 처리하여 24시간 동안 배양하였다.
- 실험에 사용된 버섯의 효율적인 추출을 위하여 열수 추출을 시행하였다. 상황, 능이, 차가, 노루 궁뎅이 그리고 청버섯 건조 분말 시료 50 g에 3차 멸균 증류수 1 L를 첨가하여 추출 하였고 같은 과정을 3회 반복하여 여과지(No.
- LPS에 의해 손상된 세포로부터 생성된 nitrite를 측정하기 위하여 griess 반응을 이용하였다. MA JS 등 (2010)의 방법을 응용하여 griess 시약의 diazo기가 nitrite를 만나면 분홍색으로 변하게 되는 색의 반응을 측정하였다.
- Transfer가 끝나면 ponceau에 담근 후 band를 확인하고 TBST로 5회 이상 세척한 후 꺼내서 5% skim milk로 overnight 시켜 항체의 비특이적 결합을 억제시켰다. 5회 washing 후 1차 antibody(1:1000)를 1시간 동안 반응 시킨 후 다시 2차 antibody(1:1000)를 반응 시키고 ECL kit(Amersham Pharmacia, England)를 이용하여 발현량을 측정하였다. Band density는 LAS-3000(Bid-rad, America)으로 확인하여 Image gauge로 수치화하였다.
- 상황, 차가, 능이, 노루궁뎅이 그리고 청버섯 열수 추출물을 이용하여 마크로파지 세포인 RAW264.7 세포에 대한 세포독성을 확인하기 위하여 MTT assay를 수행하였으며. RAW264.
- 이는 천연물로써 세포주에 특별한 독성이 없다는 것을 의미한다. 지금까지의 결과를 바탕으로 수율이 가장 높고 세포 생존 능력이 가장 우수한 노루궁뎅이버섯을 사용하여 열수 추출물의 NO 생성 억제 효과 측정 및 단백질 발현을 분석하였고 선행연구를 바탕으로 최적의 농도를 0.125, 0.25, 0.5 그리고 1.0 mg/mL를 선택하여 실험을 진행하였다.
- NO 생성 억제에 가장 효능이 우수한 노루궁뎅이버섯의 열수 추출물의 iNOS와 COX-2의 단백질 발현억제에 관한 효과를 wetern blot으로 분석하였다. RAW264.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 버섯은 2011년 9, 10월경 반여 농산물 시장(부산, 한국)에서 구입하여 음지에서 7일간 건조한 후 분쇄기로 분쇄하여 사용하였다(Hanil, 서울, 한국). Lipopolysaccharide(LPS)는 Sigma Chemical Co.
- RAW264.7 마크로파지 세포의 배양은 DMEM 배지에 10% 불활성시킨 FBS를 첨가하고 항생제를 mL 당 10 μg 넣은 것을 사용하였다.
- Louis, MO, USA)사에서 구입하여 사용하였다. 세포 배양계에서 항염증 활성을 측정하기 위해 사용한 RAW264.7 세포는 한국세포주은행(Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였다. 또한, Dulbecco;s Modified Eagle Medium(DMEM), fetal bovine serum(FBS), penicillinstreptomycin 는 Invitrogen사에서 구입하여 사용하였다.
- 7 세포는 한국세포주은행(Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였다. 또한, Dulbecco;s Modified Eagle Medium(DMEM), fetal bovine serum(FBS), penicillinstreptomycin 는 Invitrogen사에서 구입하여 사용하였다. 그 외의 모든 시약은 분석용 특급시약을 사용하였다.
- 7 마크로파지 세포의 배양은 DMEM 배지에 10% 불활성시킨 FBS를 첨가하고 항생제를 mL 당 10 μg 넣은 것을 사용하였다. 세포는 10 - 12번의 계대배양을 통해 세포가 안정된 상태에서 실험을 진행하였고 배양기의 온도는 37℃이었으며 CO2는 5 %의 조건으로 사용하였다.
데이터처리
- 모든 결과는 3회 반복 측정 후 평균±표준편차로 나타내었으며, 유의성 검증은 Window용 SPSS 12.0 version을 이용하여 student t-test one way를 이용하였으며 Duncan’s new multiple range test으로 사후검증 하였다.
이론/모형
- 세포의 생존율은 3-(4,5-dimethylthiazole-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT) 환원 방법을 이용하여 측정하였다. 세포를 24-well plates에 5×104 cells/mL 농도로 1.
- 1 μg/mL의 농도로 동시 처리 또는 LPS 단독 처리하여 18시간을 배양하였다. Nitrite의 측정은 Griess reagent system을 이용하여 분석하였다.
- 단백질 발현량 분석은 Lee SJ 등(2012)의 방법에 준하여 진행하였다. Raw 264.
성능/효과
- Prostaglandin E2(PGE2)는 통증과 발열에 주로 관여하는 염증 인자로서 염증 반응이 일어나면 대식세포의 COX-2에 의해 생성된다(Wang MT 등 2007, Sarkar D 등 2008). 따라서, 염증 반응에서 생성되는 물질 중 iNOS, COX-2와 같은 물질의 생성 억제를 확인하여 항염증 효과를 확인할 수 있다.
- 본 연구에서 사용한 버섯 5종을 열수 추출을 시행한 결과 각각 32.9(청버섯), 38.2(능이버섯), 41.9(상황버섯), 43.3(차가버섯), 그리고 49.7(노루궁뎅이버섯)%의 수율을 확인하였다(Table 1). 이와 같은 결과는 폐기되어지는 버섯의 추출 후 잔사를 이용하여 유기용매 및 효소를 이용한 가수 분해를 시행함으로써 결과적으로 버려지는 물질을 재사용하는 식품 소재원이 될 것이라고 판단되어진다.
- 세균 내독소로 알려진 LPS를 마크로파지에 처리하게 되면 염증성 cytokine, NO와 같은 매개물질이 생성되어 병리학적 반응이 유발되어진다(Harris SG 등 2002). RAW264.7 세포에 아무 처리를 하지않은 정상군에 비해 LPS(100 ng/mL) 단독 처리군에서는 약 8배의 NO가 증가하였다. 반면, LPS와 노루궁뎅이버섯 열수 추출물을 0.
- 또한 0.5(p<0.05) 와 1.0(p<0.01) mg/mL의 농도에서 유의적인 NO 생성 저해 활성을 나타내었고, 1.0 mg/mL의 농도에서 약 65%의 NO를 저해하는 것을 확인하였다.
- NO 생성 억제에 가장 효능이 우수한 노루궁뎅이버섯의 열수 추출물의 iNOS와 COX-2의 단백질 발현억제에 관한 효과를 wetern blot으로 분석하였다. RAW264.7 세포에 LPS (100 ng/mL) 단독 처리군과 노루궁뎅이버섯 열수 추출물 1.0 mg/mL 동시 처리군을 24시간 배양하였고 그 결과, iNOS 단백질 발현을 약 60% 저해하였으며 이는 노루궁뎅이버섯이 염증성질환 세포주 내에서 긍정적 역할을하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 3). COX2에서도 마찬가지로 유의적으로 큰 차이를 확인 하였고 약 50%의 발현을 억제하는 것을 확인하였다(Fig.
- 3). COX2에서도 마찬가지로 유의적으로 큰 차이를 확인 하였고 약 50%의 발현을 억제하는 것을 확인하였다(Fig. 4). 이러한 결과로부터 노루궁뎅이버섯 열수 추출물이 iNOS와 COX-2의 발현 저해활성이 우수함을 확인할 수 있었으며 iNOS의 발현억제가 NO의 생성저해를 유도하는 것을 확인 할 수 있었다.
- 4). 이러한 결과로부터 노루궁뎅이버섯 열수 추출물이 iNOS와 COX-2의 발현 저해활성이 우수함을 확인할 수 있었으며 iNOS의 발현억제가 NO의 생성저해를 유도하는 것을 확인 할 수 있었다.
- 본 연구에서는 상황, 능이, 차가, 노루궁뎅이 그리고 청버섯으로부터 열수 추출물의 항염증 효능을 탐색하였다. 5종류의 버섯 열수 추출물을 이용 하여 정상 마크로파지 세포에서 노루궁뎅이버섯 열수 추출물은 NO의 저해 효능도 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다. 추가적으로 세포의 면역학적 분석인 western blot으로 iNOS와 COX-2를 수행하였을 때 LPS군에 비해 노루궁뎅이버섯 열수 추출물군에서 iNOS와 COX-2 단백질 발현량이 유의적인 차이로 감소하는 것을 확인하였다.
- 5종류의 버섯 열수 추출물을 이용 하여 정상 마크로파지 세포에서 노루궁뎅이버섯 열수 추출물은 NO의 저해 효능도 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다. 추가적으로 세포의 면역학적 분석인 western blot으로 iNOS와 COX-2를 수행하였을 때 LPS군에 비해 노루궁뎅이버섯 열수 추출물군에서 iNOS와 COX-2 단백질 발현량이 유의적인 차이로 감소하는 것을 확인하였다.
후속연구
- 이러한 버섯류의 효능으로 미루어 볼 때, 향후 고부가가치 기능성 식품소재로써 사용이 기대되므로 식품 및 조리학적인 측면에서 구체적으로 연구해야할 필요가 있다.
- 7(노루궁뎅이버섯)%의 수율을 확인하였다(Table 1). 이와 같은 결과는 폐기되어지는 버섯의 추출 후 잔사를 이용하여 유기용매 및 효소를 이용한 가수 분해를 시행함으로써 결과적으로 버려지는 물질을 재사용하는 식품 소재원이 될 것이라고 판단되어진다.
- 또한, 버섯 추출물과 염증 반응간에 관련된 다른 사이토카인의 관계에 대한 연구가 필요하고 버섯 추출물의 염증 억제에 대한 효과를 명확하게 확인하기 위해서는 TNF-α와 같이 염증 초기에 관여하는 단백질 발현에 버섯 추출물이 미치는 영향 등에 대한 다양한 연구가 필요하다.
- 본 연구에서는 항염증 효과의 기전 중 iNOS와 COX-2의 발현을 억제하는 것을 확인하였다. 하지만 추가적으로 두 단백질의 발현 조절에 관여하는 세포내 주요 인자에 대한 연구가 필요하다. 또한, 버섯 추출물과 염증 반응간에 관련된 다른 사이토카인의 관계에 대한 연구가 필요하고 버섯 추출물의 염증 억제에 대한 효과를 명확하게 확인하기 위해서는 TNF-α와 같이 염증 초기에 관여하는 단백질 발현에 버섯 추출물이 미치는 영향 등에 대한 다양한 연구가 필요하다.
- 이러한 연구를 바탕으로 기존에 버섯의 유효성분의 염증관련 질환에 대하여 직접적으로 처리하여 효능을 확인하였던 한의학에서 벗어나 좀 더 진보 된 형태의 경구 복용으로서의 활용 가능성이 있을 것으로 추정된다. 또한, 버섯이라는 천연자원을 이용하였기 때문에 부작용의 문제에서도 자유로울 수 있다고 판단되어지며 추가적으로 염증 반응을 일으키는 기본적인 세포의 산화적 요인에도 적용하여 연구를 폭 넓게 접근할 필요성이 있다.
- 이러한 연구를 바탕으로 기존에 버섯의 유효성분의 염증관련 질환에 대하여 직접적으로 처리하여 효능을 확인하였던 한의학에서 벗어나 좀 더 진보 된 형태의 경구 복용으로서의 활용 가능성이 있을 것으로 추정된다. 또한, 버섯이라는 천연자원을 이용하였기 때문에 부작용의 문제에서도 자유로울 수 있다고 판단되어지며 추가적으로 염증 반응을 일으키는 기본적인 세포의 산화적 요인에도 적용하여 연구를 폭 넓게 접근할 필요성이 있다. 이러한 기초 연구는 조리업과 외식업계에 버섯류의 효능에 대한 과학적 데이터를 제시함으로써 버섯의 효능도 알리면서 소득 및 매출증대에도 큰 영향을 미칠 것으로 예상되어지는 바이다.
- 버섯은 수천 종이 자생 또는 재배되어지고 있으며 기능성 식품에서도 큰 주목을 받고 있다. 그러나 그 추세가 원료공급을 통한 식품원으로써 제한적인 현실이고 그 효능을 나타내는 유효물질에 대하여 최근에 연구가 진행되어지는 단계로써 아직까지 명확히 확립되어있는 상태가 아니기 때문에 본 연구를 바탕으로 얻어진 결과는 외식산업에 버섯과 염증성질환과의 관계에 대한 기초 지식을 제공할 것으로 사료되어지지만 좀 더 명확한 결과를 위하여 차후 필수 연구인 분리, 정제를 통하여 유효 물질을 발굴하여 새로운 소재를 찾아내는 연구가 필요할 것으로 판단되어지며 효소활성 및 동물모델의 확립 등이 추가적으로 필요할 것으로 판단된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.