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문제 정의
- 따라서 본 연구는 굴 효소 가수분해 단백질로부터 간 보호 활성을 탐색할 목적으로 간에 대한 독성과 in vitro 상에서 생체이물 대사에 관한 연구의 좋은 모델로 사용되는 HepG2 세포[18]를 이용하여 타크린으로 독성을 유발한 간 세포 독성에 대한 보호 효과를 탐색하였다.
- 시료들이 간세포의 손상 및 세포괴사에 대해 보호 효과가 있는지 여부를 관찰하기 위한 실험의 전 단계로의 농도 별 간세포 독성을 관찰하였다. HepG2 세포에 농도 별로 시료를 처리하고 24시간 배양한 다음, MTT assay로 세포 생존율을 측정한 결과, 아무런 처치도 하지 않은 control의 세포 생존율을 100%로 보았을 때 시료들을 최고농도 500 μg/ml 첨가 시 세포 생존율이 대조군인 control에 비해 약 90.
- 타크린은 cholinesterase inhibitor로 알츠하이머 질환자에게 치료제로서 사용되고 있지만 복용한 환자에게서 심각한 간 손상으로 인한 부작용이 종종 보고되고있다. 타크린에 의한 간 손상의 원인과 기전에 대하여 여러 보고들이 있으며본 실험에서는 이러한 타크린에 의한 간 손상에 대한 굴 분획물(O) 및 효소별 굴 가수분해물(N, F, P)의 간 보호 효과를 확인하고자 했다. 타크린이 간세포에 미치는 영향을 살펴보기 위하여 HepG2 세포에 타크린을 처리하여 2시간 후 MTT assay로 세포의 생존율을 비교하였다.
가설 설정
- 1)Sample concentration in the reaction system was 2 mg/ml.
제안 방법
- GOT 활성도 측정을 위해 간세포를 free serum DMEM에 5×105 cells/ml로 6 well에 3 ml씩 분주하여 24시간 예비 배양한 다음 굴 분획물(O) 및 효소별 굴 가수분해물(N, F, P)을 처리하여 37℃에서 5% CO2, 95% O2가 유지되는 CO2 incubator에서 24시간 동안 배양하였다.
- Jang [6]의 방법을 변형하여 Neutrase, Flavourzyme, Protamex를 이용한 굴 가수분해물을 제조 하였다. 즉, 냉동굴 1,000 g을 1분 동안 끓는 물에 데치고, 수도수를 2배 양을 가한 후 마쇄하였다.
- 굴 분획물(O) 및 효소별 굴 가수분해물(N, F, P)의 간세포 손상에 대한 영향을 조사하기 위해 배지내의 LDH 활성을 측정하였다. LDH 활성은 GOT 활성 측정과 동일한 방법으로 세포실험을 수행한 후 세포 배양액을 취한 다음 아산제약에서 구입한 LDH assay kit (ASAN parm, seoul, Korea)를 이용하여 LDH 활성을 측정하였다. 이 측정법의 원리는 pyruvic acid와 NADH2가 LDH에 의해 lactic acid가 생성되고 NADH2는 NAD로 될 때, 이 반응에서 소비된 NADH2의 감속속도를 측정하여 LDH를 340 nm에서 UV/Vis spectrophotometer를 사용하여 흡광도를 측정한다.
- 굴 분획물(O) 및 효소별 굴 가수분해물(N, F, P) 0.1 g을 100 ml의 Sodium loding buffer에 녹인 후 1 ml을 취하여 membrane filter 0.20 μm로 여과시켜 Amino Acid Analyzer(Biochrom 30, Biochrom Ltd , UK)를 이용하여 정량 분석하였다.
- 굴 분획물(O) 및 효소별 굴 가수분해물(N, F, P)의 간세포 독성 측정과 동일한 방법으로 예비 배양한 후 타크린에 의한 간독성을 확인하였다. 예비 배양된 배지를 제거한 후 타크린을 PBS에 녹여 농도(0~1.
- 굴 분획물(O) 및 효소별 굴 가수분해물(N, F, P)의 간세포 손상에 대한 영향을 조사하기 위해 배지내의 LDH 활성을 측정하였다. LDH 활성은 GOT 활성 측정과 동일한 방법으로 세포실험을 수행한 후 세포 배양액을 취한 다음 아산제약에서 구입한 LDH assay kit (ASAN parm, seoul, Korea)를 이용하여 LDH 활성을 측정하였다.
- 굴 분획물인 Oyster (이하 O)와 식용으로 사용 가능한 효소인 Neutrase, Flavourzyme, Protamex으로 각각 굴을 효소 가수분해하여 만든 분획물(이하 N, F, P)은 phosphate buffered saline (PBS) 용액에 녹여 사용하여 최종농도가 각각 100 μg/ml, 200 μg/ml, 250 μg/ml 및 500 μg/ml 이 되도록 하여 사용하였다.
- 즉, 냉동굴 1,000 g을 1분 동안 끓는 물에 데치고, 수도수를 2배 양을 가한 후 마쇄하였다. 마쇄물의 단백질 농도에 대하여 1%의 농도가 되도록 각각의 효소를 첨가하여 반응 시켰다. Neutrase는 첨가 후 50℃에서, Flavourzyme은 첨가 후 55℃에서, Protamex는 첨가 후 40℃에서 2시간 동안 처리한 후 100℃에서 10분간 가열 처리하여 불활성화 시켰다.
- 배양한 인간 간암 세포주인 HepG2 세포를 PBS로 2회 세척한 다음 Trypsin-Versene (EDTA) Mixture를 3분 동안 처리하여 세포를 분리시키고 serum free DMEM로 각 well당 2.5×105 cells/ml로 조절하여 100 μl씩 96 well plate에 넣은 다음 37℃에서 5% CO2, 95% O2가 유지되는 CO2 incubator에서 24시간 동안 예비 배양하였다.
- 5×105 cells/ml로 조절하여 100 μl씩 96 well plate에 넣은 다음 37℃에서 5% CO2, 95% O2가 유지되는 CO2 incubator에서 24시간 동안 예비 배양하였다. 배지를 제거한 후 준비된 시료를 농도별로 처리한 serum free DMEM으로 24시간 배양한 후, MTT assay를 실시하였다.
- 본 실험 결과에서는 세포 생존율이 가장 높았던 250 μg/ml에서 O, N, F, P이 간세포에서 타크린에 의해 유도된 손상에 대해 보호 효과가 있는지의 여부를 세포막 손상 시 배양액 내로 유출되는 GOT와 LDH 활성도를 측정하여 조사하였다.
- 굴 분획물(O) 및 효소별 굴 가수분해물(N, F, P)의 간세포 독성 측정과 동일한 방법으로 예비 배양한 후 타크린에 의한 간독성을 확인하였다. 예비 배양된 배지를 제거한 후 농도 별로 희석한 시료 용액인 O, N, F, P을 첨가하여 24시간 배양한 다음, 1.2 mM 타크린을 처리한 후 2시간 배양한 후, MTT assay를 실시하였다.
- 굴 분획물(O) 및 효소별 굴 가수분해물(N, F, P)의 간세포 독성 측정과 동일한 방법으로 예비 배양한 후 타크린에 의한 간독성을 확인하였다. 예비 배양된 배지를 제거한 후 타크린을 PBS에 녹여 농도(0~1.8 mM) 별로 처리한 후 2시간 배양한 후, MTT assay를 실시하였다.
- 5 ml의 시료와 혼합하고 20분 후 UV spectrophotometer (Mecasys, Optizen 2120UV, Korea)로 525 nm에서 흡광도를 측정하였다. 음성 대조군으로는 1 ml DPPH에 시료 대신 0.5 ml 증류수를 가한 용액을 사용하였고 양성 대조군으로는 ascorbic acid를 사용하였고 DPPH에 의한 라디칼 소거 활성을 다음 공식으로 계산하였다.
- 간암 세포주인 HepG2 세포는 10% FBS가 함유된 DMEM 배지를 사용하여 37℃에서 5% CO2, 95% O2가 유지되도록 CO2 incubator (Galaxy 170S, New Brunswick, UK)에서 배양하였다. 이 때 세포의 오염이나 증식을 억제하기 위해 1% Penicillin-Streptomycin Mixture을 첨가하였다. 세포가 80% 정도 dish를 덮으면 Phosphate Buffered Saline로 2회 세척한 후 TrypsinVersene (EDTA) Mixture 을 3분 동안 처리하여 세포를 분리시킨 후 계대 배양하였으며 배지는 24시간마다 교환하였다.
- LDH 활성은 GOT 활성 측정과 동일한 방법으로 세포실험을 수행한 후 세포 배양액을 취한 다음 아산제약에서 구입한 LDH assay kit (ASAN parm, seoul, Korea)를 이용하여 LDH 활성을 측정하였다. 이 측정법의 원리는 pyruvic acid와 NADH2가 LDH에 의해 lactic acid가 생성되고 NADH2는 NAD로 될 때, 이 반응에서 소비된 NADH2의 감속속도를 측정하여 LDH를 340 nm에서 UV/Vis spectrophotometer를 사용하여 흡광도를 측정한다. 양성 대조 약물로는 현재 간 보호 작용이 있는 것으로 알려진 Silymarin을 사용하였다.
- 이 측정법의 원리는 기질액인 L-aspartic acid 및 α- ketoglutaric acid가 GOT에 의하여 oxaloacetic acid로 변하여 정색시액인 2,4-dinitrophenyl hydrazine 과 반응하여 Hydrazone이 생성되며 0.4 N NaOH용액을 사용하여 적갈색으로 발색시킨 후 비색을 측정하였다.
- 2 ml과 잘 혼합하여 37℃에서 60분간 방치한다. 정색시액인 2,4-dinitrophenyl hydrazine을 1 ml 첨가하여 실온에서 20분 방치한 다음, 0.4 N NaOH용액 10 ml과 잘 혼합하여 실온에서 10분간 방치한 다음 505 nm에서 증류수를 대조로 UV/Vis spectrophotometer (Mecasys, Optizen 2120UV, Korea)를 사용하여 흡광도를 측정한다. 양성 대조 약물로는 현재 간 보호 작용이 있는 것으로 알려진 Silymarin을 사용하였다.
- 타크린에 의한 간 손상의 원인과 기전에 대하여 여러 보고들이 있으며본 실험에서는 이러한 타크린에 의한 간 손상에 대한 굴 분획물(O) 및 효소별 굴 가수분해물(N, F, P)의 간 보호 효과를 확인하고자 했다. 타크린이 간세포에 미치는 영향을 살펴보기 위하여 HepG2 세포에 타크린을 처리하여 2시간 후 MTT assay로 세포의 생존율을 비교하였다. 아무런 처치를 하지 않은 control의 세포 생존율을 100%로 보았을 때, 0.
- , Ltd, Korea)한 후 그 상등액을 취하였다. 회수한 상등액은 아산제약에서 구입한 GOT assay kit (ASAN parm, seoul, Korea)를 이용하여 GOT 활성을 측정하였다. GOT 측정용 기질액인 L-aspartic acid 및 α- ketoglutaric acid 1 ml을 37℃에서 5분간 방치한 다음 배양액 0.
대상 데이터
- HepG2 세포 배양에 사용한 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)과 Fetal Bovine Serum (FBS)와 배지용 항생제(Penicillin-Streptomycin Mixture)와 Phosphate Buffered Saline (PBS), Trypsin-Versene (EDTA) Mixture는 Lonza 사(Switzerland)에서, 세포생존율을 측정하기 위한 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 시약은 Sigma에서 구입하였다. Dimethyl sulfoxide (DMSO)와 silymarin 등은 Sigma 사(St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였으며, 기타 일반 시약들은 특급 시약을 사용하였다. 세포배양용 culture dish, 96-well plate, 6-well plate, corning tube는 SPL (Gyeonggido, Korea)을 사용하였다.
- HepG2 세포 배양에 사용한 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)과 Fetal Bovine Serum (FBS)와 배지용 항생제(Penicillin-Streptomycin Mixture)와 Phosphate Buffered Saline (PBS), Trypsin-Versene (EDTA) Mixture는 Lonza 사(Switzerland)에서, 세포생존율을 측정하기 위한 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 시약은 Sigma에서 구입하였다.
- 간 보호 기능이 밝혀진 Silymarin은 최종농도가 20μg/ml 이 되도록 하여 실험에 사용하였다.
- 실험에 사용한 Human hepatocellular carcinoma인 HepG2(KCLB, 88065) 세포는 한국 세포주 은행에서 구입하였다. 간암 세포주인 HepG2 세포는 10% FBS가 함유된 DMEM 배지를 사용하여 37℃에서 5% CO2, 95% O2가 유지되도록 CO2 incubator (Galaxy 170S, New Brunswick, UK)에서 배양하였다. 이 때 세포의 오염이나 증식을 억제하기 위해 1% Penicillin-Streptomycin Mixture을 첨가하였다.
- 굴 효소 가수분해물을 제조하기 위해서 사용한 상업적 효소들 중에서 Neutrase, Flavourzyme, Protamex은 Novozyme 사(Busan, Korea)에서 구입하여 사용하였다.
- 실험에 사용한 Human hepatocellular carcinoma인 HepG2(KCLB, 88065) 세포는 한국 세포주 은행에서 구입하였다. 간암 세포주인 HepG2 세포는 10% FBS가 함유된 DMEM 배지를 사용하여 37℃에서 5% CO2, 95% O2가 유지되도록 CO2 incubator (Galaxy 170S, New Brunswick, UK)에서 배양하였다.
- 4 N NaOH용액 10 ml과 잘 혼합하여 실온에서 10분간 방치한 다음 505 nm에서 증류수를 대조로 UV/Vis spectrophotometer (Mecasys, Optizen 2120UV, Korea)를 사용하여 흡광도를 측정한다. 양성 대조 약물로는 현재 간 보호 작용이 있는 것으로 알려진 Silymarin을 사용하였다.
- incubator에서 4시간 동안 방치하고 상등액을 제거한 뒤 DMSO 200 μl를 넣고 10분간 실온에서 방치하여 formazan을 용해시키고 ELISA plate reader (Spectra MAX 250, Molecular Devices, USA)를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정한다. 양성 대조약물은 silymarin을 사용하였다.
- 참굴(Crassostrea gigas, 각장 4.6±2.3 cm, 각중 9.9±3.2 g)은 경남 통영 연안의 양식장에서 채취하여 인근의 가공공장에서 Individual Quick Frozen (IQF)으로 가공한 제품으로서 냉동보관된 제품을 가수분해 시료로 사용하였다.
데이터처리
- 실험한 결과의 통계처리는 SPSS 12.0 program을 이용하여 각 실험군의 평균과 표준 편차로 나타냈으며, 각 군의 비교는 유의수준은 p<0.001에서 One-way ANOVA test로 나타내었으며, 유의성 검증은 Duncan's multiple range test를 이용하였다.
이론/모형
- 각 시료의 SOD 활성은 SOD assay kit-WST (Dojindo, Japan)를 사용하였다. 96 well plate를 이용하여 각각의 시료 20 μl를 WST-1 용액 200 μl, enzyme용액 20 μl와 반응시키고, blank는 시료대신 증류수를 첨가하여 37℃에서 20분간 반응 시키고 난 후, ELISA reader (Molecular Devices, Spectra MAX 250, USA)로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
성능/효과
- 8 mg/g으로 가장 높은 함량을 나타내었으며 다음으로 alanine, glycine, proline, serine 순으로 높게 나타났다. Cysteine은 0.8 mg/g으로 가장 낮은 함량을 나타내었고, tryptophan도 비교적 낮은 함량이었다.
- 본 실험 결과에서는 세포 생존율이 가장 높았던 250 μg/ml에서 O, N, F, P이 간세포에서 타크린에 의해 유도된 손상에 대해 보호 효과가 있는지의 여부를 세포막 손상 시 배양액 내로 유출되는 GOT와 LDH 활성도를 측정하여 조사하였다. GOT 측정에서는 타크린 손상을 준 결과에 비해 25~45%의 저해 효과를 보였고, P에서는 약 45% 저해 효과를 보여 positive control인 Silymarin보다 현저하게 우수한 저해 효과를 나타냈다. LDH에 대한 실험에서 굴 분획물(O) 및 효소별 굴 가수분해물(N, F, P) 처리 시 타크린 손상을 준 결과에 비해 약 8~50%의 저해 효과를 보였고, P에서는 약 50%의 저해 효과를 보이므로, 굴 분획물(O) 및 효소별 굴 가수분해물(N, F, P)이 GOT와 LDH 모두 뚜렷한 저해 효과를 나타내어 간 보호 효과를 확인할 수 있었다(Fig.
- HepG2 세포에 농도 별로 시료를 처리하고 24시간 배양한 다음, MTT assay로 세포 생존율을 측정한 결과, 아무런 처치도 하지 않은 control의 세포 생존율을 100%로 보았을 때 시료들을 최고농도 500 μg/ml 첨가 시 세포 생존율이 대조군인 control에 비해 약 90.10±6.10 ~ 96.89±6.85%로 세포 생존율의 감소 현상을 보였지만, 250 μg/ml 이하 농도를 처리한 O, N, F, P 실험군에서는 세포 생존율이 104.86±6.10~12 .53±3.80%로 O, N, F, P에 의한 세포 괴사가 일어나지 않는 것으로 보이며, 250 μg/ml 이하의 농도로 O, N, F, P을 전 처리하여도 간세포에 유의성 있는 독성을 나타내지 않았다(Fig. 2).
- GOT 측정에서는 타크린 손상을 준 결과에 비해 25~45%의 저해 효과를 보였고, P에서는 약 45% 저해 효과를 보여 positive control인 Silymarin보다 현저하게 우수한 저해 효과를 나타냈다. LDH에 대한 실험에서 굴 분획물(O) 및 효소별 굴 가수분해물(N, F, P) 처리 시 타크린 손상을 준 결과에 비해 약 8~50%의 저해 효과를 보였고, P에서는 약 50%의 저해 효과를 보이므로, 굴 분획물(O) 및 효소별 굴 가수분해물(N, F, P)이 GOT와 LDH 모두 뚜렷한 저해 효과를 나타내어 간 보호 효과를 확인할 수 있었다(Fig. 5).
- 타크린이 세포 내에서 glutathione과 같은 단백질과 결합하여 대사되는데, glutathione과 같은 저분자 peptide가 함유된 굴 효소 가수분해물과 결합하여 타크린 독성을 감소 시킴으로 간 보호 활성을 나타내는 것이라 생각된다. Protamex로 효소 분해한 가수분해물인 P에서 가장 높은 세포 생존율을 확인하였는데, 이는 Neutrase와 Flavourzyme이 가수분해하지 못했던 단백질을 분해하였기 때문에 세포 생존율의 상승효과가 생긴 것으로 판단되며 아미노산 조성 분석을 통하여 각기 다른 oligopeptide가 생성되었음을 간접적으로 확인하였다(Fig. 4)
- SOD 활성 측정 결과에서는 굴 분획물인 O의 활성이 76.02±2.13%로 가장 높았으나, 다양한 효소 가수분해물에서는 항산화 활성이 떨어진 결과를 보였다.
- 굴 분획물 및 굴 효소 가수분해물의 DPPH radical scavenging 및 SOD 활성 측정 결과는 Table 1에서와 같이 가장 높은 활성을 가지고 있는 것은 Protamex를 이용한 굴 효소 가수분해물이 가장 높은 활성을 가지며, 그 활성은 69.65±0.53%의 활성이었다.
- 굴 분획물(O)과 효소별 굴 가수분해물 중 N, F은 250 μg/ml 농도 이하에서는 농도와 상관없이 타크린으로 유발한 간세포의 독성에 대해 보호 효과를 나타냈으나, P에서는 농도 의존적으로 유의적인 세포 생존율의 증가를 확인할 수 있었는데, 200 μg/ml과 250 μg/ml에서 각각 83.17±4.31%, 88.75±7.86%로 PC보다 높은 세포 생존율을 확인하였다.
- 굴 분획물인 O와 Neutrase를 이용한 효소 가수분해물에서는 각각 65.17±0.94%, 63.89±1.64%의 DPPH radical scavenging 활성을 보였다.
- 반면 굴 분획물(O) 및 효소별 굴 가수분해물(N, F, P)를 100~250 μg/ml씩 농도 별로 전 처리한 다음, 타크린을 처리한 실험군에서는 세포 생존율이 대조군인 control 대비 65.45±3.62~8 .75±7.56%의 생존율을 보였으며, 간 보호 효과가 알려진 silymarin인 positive control(PC)의 세포 생존율은 76.54±3.61%였다.
- 아무런 처치도 하지 않은 control의 세포 생존율을 100%로보았을 때, 타크린만을 처리한 negative control에서는 세포 생존율이 51.84±4.25% 로 현저하게 감소하였다.
- 타크린이 간세포에 미치는 영향을 살펴보기 위하여 HepG2 세포에 타크린을 처리하여 2시간 후 MTT assay로 세포의 생존율을 비교하였다. 아무런 처치를 하지 않은 control의 세포 생존율을 100%로 보았을 때, 0.2 mM의 독성이 증가할 때마다 약 10% 정도의 세포 생존율이 감소하였다. 이것으로 미루어 볼 때 타크린은 농도 의존적으로 HepG2 세포의 생존율을 억제시키는 것으로 확인되었다(Fig.
- 2 mM의 독성이 증가할 때마다 약 10% 정도의 세포 생존율이 감소하였다. 이것으로 미루어 볼 때 타크린은 농도 의존적으로 HepG2 세포의 생존율을 억제시키는 것으로 확인되었다(Fig. 3)
후속연구
- 이는 굴 단백질이 다양한 효소에 의해 각기 다른 oligopeptide를 생성시켰음을 나타낸다. 본 연구를 통하여 타크린 독성에 대한 신약, 식품의 기초 자료를 제공할 수 있을 것으로 기대된다.
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