본 연구에서는 대황 추출물의 항산화 활성, 타이로시네이즈(tyrosinase) 저해 활성을 확인하였다. 대황의 50 %에탄올 추출물, 에틸아세테이트(ethyl acetate) 분획, 아글리콘(aglycone) 분획으로 실험을 진행하였다. 대황 추출물들의 DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 소거활성($FSC_{50}$)은 대표적인 항산화제인 (+)-${\alpha}$-tocopherol보다 낮은 것으로 나타났다. Luminol 발광법을 이용한 $Fe^{3+}$-EDTA/$H_2O_2$ 계에서 생성된 활성산소종에 대한 아글리콘 분획의 소거활성(총 항산화능, $OSC_{50}$)은 $0.265\;{\mu}g/mL$로 매우 큰 활성을 나타내었다. 대황 추출물의 rose-bengal로 증감된 $^1O_2$에 의한 적혈구 파괴에 대한 세포보호 효과는 모든 분획에서 농도 의존적($1{\sim}50\;{\mu}g/mL$)으로 증가하였으며, 특히 아글리콘 분획은 $10\;{\mu}g/mL$ 농도에서 ${\tau}_{50}$이 757.0 min으로 높은 세포 보호 활성을 나타내었다. 대황 추출물 중 아글리콘 분획의 타이로시네이즈 저해활성($IC_{50}$)은 $11.20\;{\mu}g/mL$으로 $226.88\;{\mu}g/mL$인 알부틴(arbutin)보다 큰 활성을 보여주었다. 이상의 결과들로부터 대황 추출물은 활성산소종을 소거하는 항산화제로 이용가능하며, 특히 아글리콘 분획의 현저한 항산화작용 및 큰 타이로시네이즈 저해 효과로부터 이들 분획 또한 화장품원료로서 응용 가능성이 큼을 알 수 있었다.
본 연구에서는 대황 추출물의 항산화 활성, 타이로시네이즈(tyrosinase) 저해 활성을 확인하였다. 대황의 50 %에탄올 추출물, 에틸아세테이트(ethyl acetate) 분획, 아글리콘(aglycone) 분획으로 실험을 진행하였다. 대황 추출물들의 DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 소거활성($FSC_{50}$)은 대표적인 항산화제인 (+)-${\alpha}$-tocopherol보다 낮은 것으로 나타났다. Luminol 발광법을 이용한 $Fe^{3+}$-EDTA/$H_2O_2$ 계에서 생성된 활성산소종에 대한 아글리콘 분획의 소거활성(총 항산화능, $OSC_{50}$)은 $0.265\;{\mu}g/mL$로 매우 큰 활성을 나타내었다. 대황 추출물의 rose-bengal로 증감된 $^1O_2$에 의한 적혈구 파괴에 대한 세포보호 효과는 모든 분획에서 농도 의존적($1{\sim}50\;{\mu}g/mL$)으로 증가하였으며, 특히 아글리콘 분획은 $10\;{\mu}g/mL$ 농도에서 ${\tau}_{50}$이 757.0 min으로 높은 세포 보호 활성을 나타내었다. 대황 추출물 중 아글리콘 분획의 타이로시네이즈 저해활성($IC_{50}$)은 $11.20\;{\mu}g/mL$으로 $226.88\;{\mu}g/mL$인 알부틴(arbutin)보다 큰 활성을 보여주었다. 이상의 결과들로부터 대황 추출물은 활성산소종을 소거하는 항산화제로 이용가능하며, 특히 아글리콘 분획의 현저한 항산화작용 및 큰 타이로시네이즈 저해 효과로부터 이들 분획 또한 화장품원료로서 응용 가능성이 큼을 알 수 있었다.
In this study, the antioxidative effects and inhibitory activities on tyrosinase of Rheum undulatum (R.undulatum) L. extracts were investigated. 50 % ethanol extract, ethyl acetate and aglycone fractions of R. undulatum L. were used in experiments. The DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) scavenging...
In this study, the antioxidative effects and inhibitory activities on tyrosinase of Rheum undulatum (R.undulatum) L. extracts were investigated. 50 % ethanol extract, ethyl acetate and aglycone fractions of R. undulatum L. were used in experiments. The DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) scavenging activities ($FSC_{50}$) of R. undulatum L. extracts was lower than (+)-${\alpha}$-tocopherol, known as a typical antioxidant. Reactive oxygen species (ROS) scavenging activities ($OSC_{50}$) of aglycone fraction on ROS generated in $Fe^{3+}$-EDTA/$H_2O_2$ system using the luminol-dependent chemiluminescence assay showed the most prominent effect at a concentration of $0.265\;{\mu}g/mL$. The cellular protective effects of extract/fractions of R. undulatum L. on the rose-bengal sensitized photohemolysis of human erythrocytes were increased in a concentration dependent manner ($1{\sim}50\;{\mu}g/mL$). Especially, aglycone fraction in $10\;{\mu}g/mL$ concentration showed the most protective effect among extracts (${\tau}_{50}$, 757.0 min). The inhibitory effects ($IC_{50}$, $11.20\;{\mu}g/mL$) on tyrosinase of aglycone fraction was much higher than arbutin ($226.88\;{\mu}g/mL$), known as a whitening agent. These results indicate that R. undulatum L. extracts can be used as antioxidant. Particularly, aglycone fraction of R. undulatum L. showed superior antioxdative activity and high inhibitory effect on tyrosinase. Therefore, aglycone fraction of R. undulatum L. could be applicable to new functional cosmetics.
In this study, the antioxidative effects and inhibitory activities on tyrosinase of Rheum undulatum (R.undulatum) L. extracts were investigated. 50 % ethanol extract, ethyl acetate and aglycone fractions of R. undulatum L. were used in experiments. The DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) scavenging activities ($FSC_{50}$) of R. undulatum L. extracts was lower than (+)-${\alpha}$-tocopherol, known as a typical antioxidant. Reactive oxygen species (ROS) scavenging activities ($OSC_{50}$) of aglycone fraction on ROS generated in $Fe^{3+}$-EDTA/$H_2O_2$ system using the luminol-dependent chemiluminescence assay showed the most prominent effect at a concentration of $0.265\;{\mu}g/mL$. The cellular protective effects of extract/fractions of R. undulatum L. on the rose-bengal sensitized photohemolysis of human erythrocytes were increased in a concentration dependent manner ($1{\sim}50\;{\mu}g/mL$). Especially, aglycone fraction in $10\;{\mu}g/mL$ concentration showed the most protective effect among extracts (${\tau}_{50}$, 757.0 min). The inhibitory effects ($IC_{50}$, $11.20\;{\mu}g/mL$) on tyrosinase of aglycone fraction was much higher than arbutin ($226.88\;{\mu}g/mL$), known as a whitening agent. These results indicate that R. undulatum L. extracts can be used as antioxidant. Particularly, aglycone fraction of R. undulatum L. showed superior antioxdative activity and high inhibitory effect on tyrosinase. Therefore, aglycone fraction of R. undulatum L. could be applicable to new functional cosmetics.
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문제 정의
하지만 각종 ROS가 생성되는 Fe3+-EDTA/H2O2 계에서의 총항산화능과 1O2으로유도된 세포손상에 대한 항산화 작용은 보고되어 있지 않았기에 이에 대한 연구를 통해 좀 더 직접적으로 피부 손상과 연관된 대황의 항산화 능력을 살펴보고자 하였다. 또한 50 % 에탄올 추출물과 에틸아세테이트 분획, 아글리콘 분획 등 3가지 분획 대한 타이로시네이즈 저해 효과 차이를 살펴보고자 하였다.
그 중에는 항산화[16,18]와, 타이로시네이즈 활성 저해에 관한 연구[19,20]도 포함되어 있다. 하지만 각종 ROS가 생성되는 Fe3+-EDTA/H2O2 계에서의 총항산화능과 1O2으로유도된 세포손상에 대한 항산화 작용은 보고되어 있지 않았기에 이에 대한 연구를 통해 좀 더 직접적으로 피부 손상과 연관된 대황의 항산화 능력을 살펴보고자 하였다. 또한 50 % 에탄올 추출물과 에틸아세테이트 분획, 아글리콘 분획 등 3가지 분획 대한 타이로시네이즈 저해 효과 차이를 살펴보고자 하였다.
제안 방법
광용혈에 필요한 광조사는 내부를 검게 칠한 50 cm × 20 cm × 25 cm 크기의 상자 안에 20 W 형광등을 장치하고, 형광등으로부터 5 cm 거리에 적혈구 현탁액이 담긴 파이렉스 시험관을 형광등과 평행이 되도록 배열한후 15 min 동안 광조사하였다.
광용혈에 필요한 광조사는 내부를 검게 칠한 50 cm × 20 cm × 25 cm 크기의 상자 안에 20 W 형광등을 장치하고, 형광등으로부터 5 cm 거리에 적혈구 현탁액이 담긴 파이렉스 시험관을 형광등과 평행이 되도록 배열한후 15 min 동안 광조사하였다. 광조사가 끝난 후 암반응(post-incubation)에 의한 적혈구의 파괴정도를 15 min 간격으로 700 nm에서 투광도(transmittance, %)로부터 구하였다. 이 파장에서 적혈구 현탁액의 투광도 증가는 적혈구의 용혈정도에 비례한다.
대조군(control)은 시료를 제외하고 시료에 해당하는 용매를 넣었고, 공시험(blank)은 ROS를 생성시키는 주요 물질인 H2O2와 FeCl3 · 6H2O를 제외하고 나머지는 실험군과 조건이 동일하게 하였다.
대황 추출물을 이용해서 활성산소에 의해 발생하는 세포 손상에 대한 보호 효과를 확인하였다. 적혈구 세포가 50 % 파괴되는데 걸리는 시간(τ50)은 세포 보호 활성이 클수록 크게 나타난다.
대황 추출물의 광용혈에 미치는 효과는 암반응 시간과 용혈정도로 구성된 그래프로부터 적혈구의 50 %가 용혈되는 시간인 τ50을 구하여 비교하였다.
DPPH는 비교적 안정한 자유라디칼로 실험에 응용하기 용이한 물질이고, 자유라디칼은 그 높은 에너지로 인해 피부의 여러 물질을 화학적으로 변질시킴으로 피부노화와 손상을 일으키는 것으로 알려져 있다. 따라서 DPPH를 이용하여 대황 추출물에 대한 자유라디칼의 소거활성을 측정하였다. 실험방법은 메탄올에 용해된 0.
따라서 DPPH를 이용하여 대황 추출물에 대한 자유라디칼의 소거활성을 측정하였다. 실험방법은 메탄올에 용해된 0.2 mM DPPH 용액 1 mL, 에탄올 1 mL, 다양한 농도의 대황 추출물 1 mL을 혼합한 후 실온에서 10 min 동안 반응시간을 주고 spectrophotometer로 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 소거 활성은 DPPH의 농도가 50 % 감소되는데 필요한 시료의 농도(free radical scavenging activity, FSC50, µg/mL)로서 표기하였다.
암소에서 30 min 동안 미리 항온배양시킨 후, 광증감제인 rose-bengal (12 µM) 0.5 mL를 가하고 파라필름(Whatman laboratory sealing film, UK)으로 입구를 막은 후 15 min 동안 광조사하였다.
적혈구 현탁액 3.5 mL를 파이렉스 시험관(No. 9820)에 넣은 후, 농도가 다른 대황 추출물을 각각 50 µL씩 첨가하였다.
사람 적혈구를 대상으로 활성산소에 의한 세포손상 및 파괴 실험은 활성산소에 의한 세포손상 모델로 적합한 점이 많다. 활성산소에 의한 지질 과산화반응, 단백질 산화 그리고 항산화제의 파괴 및 세포의 파괴 등을 이 실험 법을 이용하여 알아볼 수 있다. 무엇보다 사람 피부의 자외선에 의한 노화를 방어할 수 있는 피부 보호물질을 검색하는데 있어서 사람 유래 적혈구 세포를 이용한다는 점이 실질적이다.
대상 데이터
EDTA, 루미놀, 헤파린, 증감제로 사용된 rose-bengal, 자유라디칼 소거활성에 사용한 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 라디칼은 Sigma Chemical Co. (USA)에서 구입하여 사용하였다.
UV-visible spectrophotometer는 Varian (Australia) 사의 Cary 50, 적혈구 광용혈에 사용한 Spectronic 20D 는 Milton Roy Co. (USA) 제품, 화학발광기는 Berthold (Germany)사의 6-channel LB9505 LT를, pH 미터는 Istek (Korea)사 제품을 사용하였다.
기타 FeCl3·6H2O는 Junsei Chemical Co. (Japan) 제품을, H2O2는 Dae Jung Chemical & Metals (Korea)사 제품을 사용하였다.
비교물질로 사용한 (+)-α-tocopherol (1,000 IU vitamin E/g), L-ascorbic acid, 알부틴은 Sigma (USA)에서 구입하였다.
비교물질은 대표적 수용성 항산화제인 L-ascorbic acid를 사용하였으며 L-ascorbic acid의 OSC50은 1.50 ± 0.85 µg/mL로 나타났다.
실험에 사용된 적혈구 현탁액은 700 nm에서 O.D.가 0.6이었으며 이때 적혈구 수는 약 1.5 ×107 cells/mL이었다.
비교물질로 사용한 (+)-α-tocopherol (1,000 IU vitamin E/g), L-ascorbic acid, 알부틴은 Sigma (USA)에서 구입하였다. 실험에 사용한 대황 재료는 2011년 6월 경동시장에서 구입하여 사용하였다.
에틸아세테이트 분획에서 얻은 파우더 0.2 g을 산 가수분해 반응시켜 당이 제거 된 아글리콘 파우더 얻고 실험에 사용하였다. 실험 방법은 에틸아세테이트 파우더를 H2SO4 및 아세톤 용액을 넣고, 70 ℃에서 4 h 동안 중탕 가열하면서 환류 · 냉각시킨다.
완충용액 제조에 사용된 Na2HPO4 · 12H2O, NaH2PO4 · 2H2O, NaCl, H2SO4, 그리고 에탄올(EtOH), 메탄올(MeOH), 에틸아세테이트(EtOAc), 헥산 등 각종 용매는 시판 특급 시약을 사용하였다.
적혈구는 건강한 성인 남녀로부터 얻었다. 채혈 즉시 헤파린이 첨가된 시험관에 넣은 후, 3,000 rpm으로 5 min 동안 원심분리하여 적혈구와 혈장을 분리하였다.
데이터처리
모든 실험은 3회 반복하였고 통계분석은 5 % 유의수준에서 Student’s t-test를 행하였다.
성능/효과
1) 대황 추출물의 자유라디칼 소거활성(FSC50) 측정 결과 에틸아세테이트 분획(18.98 µg/mL) > 50 % 에탄올 추출물(19.23 µg/mL) > 아글리콘 분획(19.55 µg/mL) 순서로 나타났다.
10 µg/mL의 농도에서 아글리콘 분획이 가장 우수한 세포 보호 활성을 나타내었고, 에틸아세테이트 분획과 50 % 에탄올 추출물에서는 비슷한 세포 보호 활성을 나타내었다.
2) 대황 추출물의 활성산소 소거활성(총 항산화능, OSC50)은 아글리콘 분획(0.265 µg/mL) > 에틸아세테이트 분획(0.335 µg/mL) > 50 % 에탄올 추출물(2.520 µg/mL) 순서로 나타났으며, 에틸아세테이트와 아글리콘 분획은 기준 물질로 사용한 L-ascorbic acid (1.50 µg/mL)보다 뛰어난 활성산소 소거활성을 보였다.
3) 대황 추출물의 1O2으로 유도된 적혈구 파괴에 대한 세포보호 효과는 모든 분획에서 농도 의존적으로 증가하였으며, 특히 아글리콘 분획의 10 µg/mL 농도에서 757.0 min으로 높은 세포 보호 활성을 나타내었다.
4) 대황 추출물의 타이로시네이즈 저해활성(IC50)은 아글리콘 분획(11.20 µg/mL)과 에틸아세테이트 분획(37.72 µg/mL), 50 % 에탄올 추출물(108.50 µg/mL)에서 모두 기준물질인 알부틴(226.88 µg/mL)보다 높게 나타났고, 특히 아글리콘 분획에서 뛰어난 효과를 보였다.
대황 추출물의 총 항산화능에 해당하는 활성산소 소거활성을 Figure 1에 나타내었다. 결과값은 ROS를 50 % 소거하는 농도인 OSC50 (reactive oxygen species scavenging activities)로 나타내었다. 대황 50 % 에탄올 추출물의 OSC50은 2.
대황 50 % 에탄올 추출물의 경우 τ50이 1, 10, 25 µg/mL의 농도에서 각각 54.8, 271.3, 1282.0 min, 에틸아세테이트 분획의 경우 37.2, 301.4, 1817.0 min, 아글리콘 분획의 경우 106.1, 757.0, 1991.5 min으로 농도 의존적으로 세포 보호 효과를 나타내었다(Table 2).
이상의 결과들로부터 대황 추출물의 항산화 효과 미백효과를 확인하였다. 대황 추출물 중 특히 아글리콘 분획의 뛰어난 항산화 효과 및 높은 타이로시네이즈 저해 효과가 확인되었고 이는 아글리콘 분획이 화장품원료로서 응용 가능성이 큼을 시사한다.
대황 추출물들이 DPPH 소거능에서는 상대적으로 기준 물질인 (+)- α-tocopherol보다 낮은 효과를 보였지만, 루미놀 발광법을 이용한 계에서는 활성산소 소거 활성이 우수한 것으로 나타났다.
대황의 50 % 에탄올 추출물(108.50 µg/mL), 에틸아세테이트 분획(37.72 µg/mL), 아글리콘 분획(11.20µg/mL) 모두 대표적인 미백제인 알부틴(226.88 µg/mL) 보다 낮은 IC50 값을 나타내었다.
85 µg/mL로 나타났다. 대황의 에틸아세테이트 및 아글리콘 분획이 비교물질로 사용한 L-ascorbic acid보다 활성산소 소거활성이 큼을 확인할 수 있었다. 특히 이것은 L-ascorbic acid과 비교하였을 때, 에틸아세테이트 분획의 경우 약 4 ~ 5배, 아글리콘 분획의 경우 약 5 ~ 6배 높은 값으로서 각각의 분획이 뛰어난 활성산소 소거활성을 나타내는 것을 알 수 있었다.
또한 8 g의 50 % 에탄올 추출물은 감압 농축한 후 물과 헥산은 이용하여 비극성 성분을 제거하고 이후 에틸아세테이트 분획을 감압⋅농축하여 파우더를 얻었다. 따라서 50 % 에탄올 추출물의 건조 중량당 에틸아세테이트 분획의 수율은 50.49 %로 확인되었다. 50 % 에탄올 추출물과 에틸아세테이트 분획을 얻는 과정은 모두 40 ℃ 이하에서 진행하였다.
모든 경우의 실험에서 대조군은 τ50이 33 min으로 오차범위 ± 1 min 이내로 재현성이 양호하게 나타났다.
비교 물질로 사용한 지용성 항산화제인 (+)- α -tocopherol의 세포 보호 효과는 10 µg/mL의 농도에서 38.0 min로, 대황 추출물들이 (+)- α -tocopherol보다 세포 보호 효과가 뛰어나다는 것을 확인할 수 있었다(Figure 2).
이상의 결과들로부터 대황 추출물의 항산화 효과 미백효과를 확인하였다. 대황 추출물 중 특히 아글리콘 분획의 뛰어난 항산화 효과 및 높은 타이로시네이즈 저해 효과가 확인되었고 이는 아글리콘 분획이 화장품원료로서 응용 가능성이 큼을 시사한다.
이와 같은 데이터에 의하면, 자유라디칼 소거활성에서는 대황의 50 % 에탄올 추출물, 에틸아세테이트 분획, 아글리콘 분획이 비교물질인 (+)- α -tocopherol보다 낮은 활성을 갖는 것으로 나타났다(Table 1).
하지만 이 값은 대두에 많이 포함되어있는 항산화 물질로 잘 알려진 제니스테인(1756.56 ± 10.02)과 비교하였을 때는[21] 월등히 높은 수치로, 대황 추출물에 자유 라디칼 소거 능력이 있음을 확인하였다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
자유 라디칼 설에 의하면 활성산소종은 무엇에 의해 생성되는가?
광 노화에 대한 여러 이론들 중 자유 라디칼 반응(free radical theory)에 의해 노화가 진행된다고 주장하는 자유 라디칼 설은 오랜 기간 다양한 연구로 인해 많은 근거가 뒷받침된 이론이다[5-7]. 자유 라디칼 설에 의하면 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)은 방사선, 자외선 등에의 노출, 대기오염 물질, 체내의 생화학적 반응에 의해 생성된다. 이렇게 생성된 ROS는 피부의 많은 조직들을 산화시키고 MMPs 등의 효소 생성을 과발현시켜 피부 구성 물질의 분해를 촉진 시킨다.
피부가 노화하는 원인에는 무엇을 들 수 있는가?
피부가 노화하는 원인으로 크게 내인성 노화와 광 노화를 들 수 있다[1]. 이 중 시간에 의한 자연적 현상인 내인성 노화를 제외하고, 광범위한 연구가 광 노화에 집중되고 있다[2-4].
활성산소종은 어떤 반응을 일으키는가?
자유 라디칼 설에 의하면 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)은 방사선, 자외선 등에의 노출, 대기오염 물질, 체내의 생화학적 반응에 의해 생성된다. 이렇게 생성된 ROS는 피부의 많은 조직들을 산화시키고 MMPs 등의 효소 생성을 과발현시켜 피부 구성 물질의 분해를 촉진 시킨다. 사람의 피부에는 ROS와 같은 산화적 환경으로부터 자신을 보호하는 항산화 네트워크가 존재하는데, ROS가 과도하게 생성될 경우 이러한 항산화 네트워크를 망가뜨리고 여러 가지 문제를 야기시킨다고 알려져 있다[8-10].
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