와송과 한약재 복합물의 in vitro 생리활성 평가 In vitro Evaluation of Biological Activities of Wa-song (Orostachys japonicus A. Berger) and Korean Traditional Plants Mixture원문보기
와송의 생리활성을 증대시킬 수 있는 복합물을 제조하기 위하여 와송 추출물, 한약재(백복령, 창출 및 사인)의 혼합물 및 한약재와 와송의 복합물(1:1, PMO-1; 1:3, PMO-3)의 항산화 및 암세포 생육 저해능을 비교하였다. 총 페놀 및 플라보노이드 함량은 한약재 혼합물이 와송 추출물보다 많았으며, 와송 복합물에서는 PMO-1이 PMO-3보다 더 높았다. 라디칼 소거능, 환원력 및 아질산염 소거능은 PMO-1이 PMO-3보다 활성이 높았으며, tyrosinase 활성 저해능 및 MCF-7 및 HT-29 세포의 생육 저해능은 와송의 함유량이 많은 PMO-3의 활성이 더 높았다. 따라서 모든 생리활성시험에서 와송 복합물이 와송 추출물이나 한약재 혼합물에 비해 유의적으로 활성이 높았으며, 와송 복합물은 와송 추출물의 생리활성의 상승에 효과적일 것으로 예상된다.
와송의 생리활성을 증대시킬 수 있는 복합물을 제조하기 위하여 와송 추출물, 한약재(백복령, 창출 및 사인)의 혼합물 및 한약재와 와송의 복합물(1:1, PMO-1; 1:3, PMO-3)의 항산화 및 암세포 생육 저해능을 비교하였다. 총 페놀 및 플라보노이드 함량은 한약재 혼합물이 와송 추출물보다 많았으며, 와송 복합물에서는 PMO-1이 PMO-3보다 더 높았다. 라디칼 소거능, 환원력 및 아질산염 소거능은 PMO-1이 PMO-3보다 활성이 높았으며, tyrosinase 활성 저해능 및 MCF-7 및 HT-29 세포의 생육 저해능은 와송의 함유량이 많은 PMO-3의 활성이 더 높았다. 따라서 모든 생리활성시험에서 와송 복합물이 와송 추출물이나 한약재 혼합물에 비해 유의적으로 활성이 높았으며, 와송 복합물은 와송 추출물의 생리활성의 상승에 효과적일 것으로 예상된다.
This study was carried out to determine the biological activities of Wa-song (Orostachys japonicus) hot water extracts. Four types of extract samples were prepared, including Wa-song, traditional plants mixture [PM; mixture of Baekbokryung (Poria cocos), Changchul (Atractylodis rhizoma), and Sa-in (...
This study was carried out to determine the biological activities of Wa-song (Orostachys japonicus) hot water extracts. Four types of extract samples were prepared, including Wa-song, traditional plants mixture [PM; mixture of Baekbokryung (Poria cocos), Changchul (Atractylodis rhizoma), and Sa-in (Amomum xanthoides)], and two different ratio composites of these (mixture of PM and Wa-song extract, 1:1 (v/v); PMO-1 and 1:3 (v/v); PMO-3). Their biological activities were measured using various in vitro assays. Total phenolic and flavonoid contents of PM were higher compared to those of Wa-song, and those of PMO-1 were higher than those of PMO-3. Further, PMO-1 contained higher ABTS and DPPH radical scavenging, reducing power, and nitrite scavenging activities than PMO-3. On the contrary, PMO-3 contained higher tyrosinase and inhibitory activities of MCF-7 and HT-29 cancer cells than PMO-1. According to the results, biological activities of PMOs were significantly higher than those of Wa-song extract and PM in in vitro assays. Therefore, we expect that PMOs could show higher biological activities than Wa-song extract alone in vivo.
This study was carried out to determine the biological activities of Wa-song (Orostachys japonicus) hot water extracts. Four types of extract samples were prepared, including Wa-song, traditional plants mixture [PM; mixture of Baekbokryung (Poria cocos), Changchul (Atractylodis rhizoma), and Sa-in (Amomum xanthoides)], and two different ratio composites of these (mixture of PM and Wa-song extract, 1:1 (v/v); PMO-1 and 1:3 (v/v); PMO-3). Their biological activities were measured using various in vitro assays. Total phenolic and flavonoid contents of PM were higher compared to those of Wa-song, and those of PMO-1 were higher than those of PMO-3. Further, PMO-1 contained higher ABTS and DPPH radical scavenging, reducing power, and nitrite scavenging activities than PMO-3. On the contrary, PMO-3 contained higher tyrosinase and inhibitory activities of MCF-7 and HT-29 cancer cells than PMO-1. According to the results, biological activities of PMOs were significantly higher than those of Wa-song extract and PM in in vitro assays. Therefore, we expect that PMOs could show higher biological activities than Wa-song extract alone in vivo.
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문제 정의
이와 같이 여러 식물류의 혼합 처방은 각 재료에 함유된 유효 물질간의 상호작용으로 첨가 효과뿐만 아니라 생리활성의 시너지 효과도 발휘할 수 있을 것으로 예상된다. 따라서 본 연구에서는 다양한 약리작용이 있어 과거로부터 고급약재로 사용되어온 와송의 생리활성 연구의 일환으로 와송 추출물의 항산화 및 항암 활성을 측정하였으며, 와송과 유사한 활성을 지니는 한약재로 백복령, 창출 및 사인 등의 한약재를 선별하여 이들의 복합물에 대한 in vitro에서 와송과의 시너지 효과를 알아보고자 하였다.
가설 설정
1)Plants mixture (PM): Baekbokryung, Changchul and Sa-in extracts were mixed with same ratio (v/v).
와송의 생리활성을 증대시킬 수 있는 복합물을 제조하기 위하여 와송 추출물, 한약재(백복령, 창출 및 사인)의 혼합물 및 한약재와 와송의 복합물(1:1, PMO-1; 1:3, PMO-3)의 항산화 및 암세포 생육 저해능을 비교하였다. 총 페놀 및 플라보노이드 함량은 한약재 혼합물이 와송 추출물보다 많았으며, 와송 복합물에서는 PMO-1이 PMO-3보다 더 높았다.
5)을 가하여 반응용액의 총 부피를 10 mL로 한 후 37℃에서 1시간 반응시켰다. 이 반응액 1 mL를 취하여 2% 초산용액과 Griess 시약을 차례로 가하여 520 nm에서 흡광도를 측정하여 시료 무첨가구에 대한 시료 첨가구의 아질산염 소거능을 계산하였다(26)
이를 다시 24시간 배양한 후 5 mg/mL의 MTT 용액 10 μL를 첨가하여 37℃에서 3시간 배양하였으며, 이때 생존 세포와 MTT시약과의 반응으로 생성된 formazan 결정을 100 μL의 dimethyl sulfoxide에 녹여 plate shaker(MX2, FINEPCR, Seoul, Korea)에서 30분간 반응시킨 후 ELISA reader(UVM 340, ASYS Hitech, Eugendorf, Austria)로 540 nm에서 흡광도를 측정하여 암세포 생장 저해능(%)으로 계산하였다.
총 페놀 함량은 시료액, Foline-Ciocalteau 시약 및 10% Na2CO3용액을 각각 동량씩 가하여 혼합한 다음 실온의 암실에서 1시간 동안 반응시킨 후 700 nm에서 흡광도를 측정하였으며, caffeic acid(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)를 사용하여 얻은 표준검량선으로부터 총 페놀 함량을 산출하였다(21). 플라보노이드 함량은 시료액 1 mL에 10% aluminum nitrate 0.
Louis, MO, USA)를 사용하여 얻은 표준검량선으로부터 총 페놀 함량을 산출하였다(21). 플라보노이드 함량은 시료액 1 mL에 10% aluminum nitrate 0.1 mL, 1 M potassium acetate 0.1 mL 및 ethanol 4.3 mL를 차례로 가하여 혼합한 다음 실온의 암실에서 40분간 반응시킨 후 415 nm에서 흡광도를 측정하였으며, quercetin(Sigma Chemical Co.)을 사용하여 얻은 표준검량선으로 플라보노이드 함량을 계산하였다(22).
한약재 혼합물(PM)은 각각 추출된 3종의 한약재 추출물을 동량으로(1:1:1, w/w/w) 혼합하였으며, 와송 복합물(PMO)은 한약재 혼합물(PM)에 와송 추출물을 첨가하여PMO-1(한약재 혼합물 : 와송 추출물=1:1, w/w)과 PMO-3(한약재 혼합물 : 와송 추출물=1:3, w/w)으로 각각 제조하여 즉시 실험에 사용하였다.
1 mL를 차례로 가하여 혼합한 후 37℃에서 30분간 반응시킨 다음 470 nm에서 흡광도(SOD)를 측정하였다. 효소액 대신에 증류수를 사용하여 측정한 흡광도(BOD) 및 시료액 대신에 증류수를 첨가하여 측정한 흡광도(COD)를 이용하여 다음의 식에 따라 tyrosinase 활성저해능을 산출하였다.
대상 데이터
와송은 경남 산청지역의 산에 자생된 것을 동정 후 구입하여 지상부를 수세한 후 열풍건조 시켰으며(20), 한약재는 문헌을 통하여 와송과 유사한 생리활성을 지니는 식물류를 선정하였으며, 경남 진주시 소재 약재상에서 시판되는 건조품인 백복령, 창출 및 사인을 구입하였다. 와송과 3종의 한약재는 건조시료 중량에 대해 10배의 물을 가하여 95℃의 수욕상에서 3시간 동안 2회 반복 추출하여 추출물을 얻었다.
인체 위암 세포주(AGS), 유방암 세포주(MCF-7) 및 결장암 세포주(HT-29)는 한국세포주은행(KCLB, Korea Cell Line Bank, Seoul, Korea)에서 분양받아 10% FBS, 5000unit/mL의 penicillin-streptomycin을 첨가한 RPMI-1640배지로 37℃ 및 5% CO2 조건에서 배양하였다. 시료액에 의한 암세포의 생장 저해능은 MTT[3-(4,5-dimethylthiazol)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide]법(28)으로 측정하였으며, 세포 배양용 96 well plate에 4×104 cells/mL을 100 μL씩 분주하여 37℃ 및 5% CO2 incubator에서 24시간 동안 배양한 후, 농도를 달리한 시료액을 100 μL씩 접종하였다.
데이터처리
각 시험구에 대한 유의차 검정은 분산분석을 한 후 p<0.05 수준에서 Duncan's multiple range test를 실시하였다.
모든 결과는 5회 이상 반복하여 평균±표준편차로 나타내었다.
이론/모형
Tyrosinase 활성 저해능은 효소의 반응으로 생성되는 DOPA chrome을 비색법에 따라 측정하였다(27). 0.
시료액에 의한 암세포의 생장 저해능은 MTT[3-(4,5-dimethylthiazol)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide]법(28)으로 측정하였으며, 세포 배양용 96 well plate에 4×104 cells/mL을 100 μL씩 분주하여 37℃ 및 5% CO2 incubator에서 24시간 동안 배양한 후, 농도를 달리한 시료액을 100 μL씩 접종하였다.
와송 복합물의 환원력은 Oyaizu(25)의 방법에 따라 시료액, 200 mM의 인산 완충액(pH 6.6) 및 1%의 potassium ferricyanide 용액을 동량으로 혼합하여 50℃의 수욕상에서 20분간 반응시켰다. 여기에 10% TCA용액을 가하여 반응을 정지시키고 5000 rpm에서 5분간 원심분리 하여 얻은 상층액에 증류수 및 0.
성능/효과
2)PMO-1: PM and Wa-song extract were mixed with 1:1 (v/v)ratio.
250 μg/mL 이상의 농도에서 PM은 와송 추출물에 비해 아질산염 소거능이 유의적으로 높았으며, 모든 농도에서 PMO-1이 PMO-3보다 유의적으로 높은 활성이었으나 500 μg/mL 농도에서는 그 차이가 적었다.
250∼500 μg/mL 농도에서는 PMO-1이 다른 실험구에 비해 유의적으로 소거능이 높았으며, 더욱이1000 μg/mL 농도에서도 PMO-1은 PMO-3보다 유의적으로 소거능이 높아 ABTS 라디칼 소거능과 유사한 경향성을 보였다.
3)PMO-3: PM and Wa-song extract were mixed with 1:3 (v/v)ratio.
DPPH 라디칼 소거능은 1000 μg/mL 농도에서 PM이 84.71%로 와송 추출물이나 와송 복합물에 비해 유의적으로 활성이 높았다.
MCF-7 세포의 생육 저해능은 와송 추출물에 비해 PM이 유의적으로 높았으나, 와송 복합물의 경우 와송의 함유량이 많은 PMO-3가 PMO-1에 비해 유의적으로 활성이 높아 와송 복합물의 암세포 생육 저해능이 와송에 기인된 것으로 추정된다. HT-29 세포의 생육 저해능은 와송 복합물이 와송 추출물이나 PM에 비해 유의적으로 높았으며, 와송 함유량에 따른 유의차는 보이지 않았다.
700nm에서 측정한 시료액의 흡광도 값이 클수록 환원력이 높은 것으로 판단할 수 있는데, 와송 추출물의 환원력은 100∼500 μg/mL 농도에서 PM보다 유의적으로 낮았지만, 1000μg/mL 농도에서는 비슷하였다. PMO-1의 환원력은 PMO-3에 비해 모든 농도에서 유의적으로 높았으며, 와송 복합물은 와송 추출물이나 PM에 비해 약 2배 정도 활성이 높았다. 더욱이 500 μg/mL 농도에서 환원력은 라디칼 소거능과도 유사한 경향성을 보여 500 μg/mL 농도의 와송 복합물은 와송의 생리활성 증가를 위한 적정 농도인 것으로 사료된다.
1배 정도 높았기 때문이라 판단된다. 더욱이 한약재의 구성성분인 사인 추출물의 총 페놀 및 플라보노이드 함량이 192.12 mg/g 및 19.59 mg/g으로 백복령 및 창출에 비해 월등히 높아 한약재 혼합물의 생리활성에 주된 역할을 할 것으로 생각되며, 와송 추출물과 한약재를 동량으로 혼합한 PMO-1은 PMO-3에 비해 시료 중의 총 페놀 및 플라보노이드 함량에 기인된 생리활성의 향상을 위한 효과적인 조성 비율인 것으로 사료된다.
라디칼 소거능, 환원력 및 아질산염 소거능은 PMO-1이PMO-3보다 활성이 높았으며, tyrosinase 활성 저해능 및MCF-7 및 HT-29 세포의 생육 저해능은 와송의 함유량이 많은 PMO-3의 활성이 더 높았다. 따라서 모든 생리활성시험에서 와송 복합물이 와송 추출물이나 한약재 혼합물에 비해 유의적으로 활성이 높았으며, 와송 복합물은 와송 추출물의 생리활성의 상승에 효과적일 것으로 예상된다.
총 페놀 및 플라보노이드 함량은 한약재 혼합물이 와송 추출물보다 많았으며, 와송 복합물에서는 PMO-1이 PMO-3보다 더 높았다. 라디칼 소거능, 환원력 및 아질산염 소거능은 PMO-1이PMO-3보다 활성이 높았으며, tyrosinase 활성 저해능 및MCF-7 및 HT-29 세포의 생육 저해능은 와송의 함유량이 많은 PMO-3의 활성이 더 높았다. 따라서 모든 생리활성시험에서 와송 복합물이 와송 추출물이나 한약재 혼합물에 비해 유의적으로 활성이 높았으며, 와송 복합물은 와송 추출물의 생리활성의 상승에 효과적일 것으로 예상된다.
3%로 페놀 화합물이나 플라보노이드 함량이 높은 복합제에서 소거능이 높은 것으로 확인되었으며, 특히 플라보노이드 함량이 높은 복합제는 DPPH라디칼 소거능도 우수하여 천연물 복합제의 아질산염 소거능이 총 페놀보다는 오히려 플라보노이드류의 함량에 대한의존도가 높다고 보고되어 있다(39). 본 연구 결과 와송 복합물 중 PMO-1의 총 페놀 및 플라보노이드 함량이 PMO-3보다 높은 것으로 볼 때 아질산염 소거능도 이들 물질과 관련된 것으로 사료된다. 따라서 아질산염이 생체 내 위장의 pH조건에서 발암성 nitrosamine을 생성하는 전구물질로 작용하는 것을 고려해 본다면 와송 복합물은 아질산염 소거제로써의 생체 방어기능에도 유효할 것으로 생각된다.
본 연구 결과 와송 복합물의 항산화 활성은 와송 추출물에 비해 유의적으로 높았으나, AGS 및 MCF 세포에 대해 생육저해능은 오히려 와송 복합물의 활성이 다소 낮았다. 이러한 현상은 각 시료 추출물에는 여러 가지의 활성물질이 함께 존재하므로 이들의 상호작용과 반응기질에 대한 복합물의 반응 차이(6)인 것으로 추정된다.
또, 약용식물류 추출물을 각각 2종씩 동량으로 혼합하여 항산화 활성을 측정한 결과, 혼합 전과 비교해 보아 대차를 보이지 않아 약용식물류 추출물의 혼합 시 생리활성의 안정화가 가능하다는 보고도 있다(36). 본 연구에서도 한약재의 혼합물이 와송 추출물에 첨가되었을 때 라디칼 소거능이 상승되는 것으로 보아, 상대적인 유효물질의 함량증가와 더불어 생리활성의 안정화를 유지함으로써 시너지효과를 내는 것으로 추정된다.
와송 복합물은 100∼250 μg/mL 농도에서 PMO-3가 PMO-1보다 유의적으로 높은 소거능을 보였으나, 500 μg/mL 농도에서는 오히려 PMO-1이 51.52%로 PMO-3(38.37%)에 비해 유의적으로 높은 소거능을 보였고 1000 μg/mL 농도에서는 90% 이상으로 비슷한 활성이었다.
와송 복합물의 tyrosinase 활성 저해능은 Table 6에 나타낸 바와 같이, 와송 추출물의 tyrosinase 활성 저해능은 500μg/mL 미만의 농도에서는 PM과 유의차가 없었으나 500 μg/mL 이상의 농도에서는 유의적으로 높았다.
64%였으며, 그 외 실험구에서는 모두 50%미만이었다. 와송 추출물은 각각 46.49%, 27.80% 및 24.50%(AGS, MCF-7 및 HT-29 세포)의 생육 저해능을 보여 PM이 와송 추출물보다 유의적으로 높은 활성이었다.
즉, 와송 복합물은 500μg/mL 이상의 농도에서 PM이나 와송 추출물보다 소거능이 유의적으로 높아 이들 각 한약재의 혼합에 따른 ABTS 라디칼 소거능에 시너지 효과를 보이는 것으로 판단된다.
와송의 생리활성을 증대시킬 수 있는 복합물을 제조하기 위하여 와송 추출물, 한약재(백복령, 창출 및 사인)의 혼합물 및 한약재와 와송의 복합물(1:1, PMO-1; 1:3, PMO-3)의 항산화 및 암세포 생육 저해능을 비교하였다. 총 페놀 및 플라보노이드 함량은 한약재 혼합물이 와송 추출물보다 많았으며, 와송 복합물에서는 PMO-1이 PMO-3보다 더 높았다. 라디칼 소거능, 환원력 및 아질산염 소거능은 PMO-1이PMO-3보다 활성이 높았으며, tyrosinase 활성 저해능 및MCF-7 및 HT-29 세포의 생육 저해능은 와송의 함유량이 많은 PMO-3의 활성이 더 높았다.
후속연구
그러나 대부분의 천연 식물류 혼합물의 높은 생리활성은 식물체간의 상호작용에 의한 시너지효과가 주 요인인 것으로 알려져 있다(6,17). 더욱이 8종의 한약재 복합물에서 금은화의 첨가 유무에 따라 항산화 활성에 차이를 보인다는 보고(33)로 볼 때, 본 연구에서와 같이 사인과 같은 총 페놀 화합물의함량이 많은 시료의 사용은 주 성분의 활성 증가를 위한 보조제로써의 이용 가능성이 높을 것으로 예상된다.
본 연구 결과 와송 복합물 중 PMO-1의 총 페놀 및 플라보노이드 함량이 PMO-3보다 높은 것으로 볼 때 아질산염 소거능도 이들 물질과 관련된 것으로 사료된다. 따라서 아질산염이 생체 내 위장의 pH조건에서 발암성 nitrosamine을 생성하는 전구물질로 작용하는 것을 고려해 본다면 와송 복합물은 아질산염 소거제로써의 생체 방어기능에도 유효할 것으로 생각된다.
이와 같이 여러 식물류의 혼합 처방은 각 재료에 함유된 유효 물질간의 상호작용으로 첨가 효과뿐만 아니라 생리활성의 시너지 효과도 발휘할 수 있을 것으로 예상된다. 따라서 본 연구에서는 다양한 약리작용이 있어 과거로부터 고급약재로 사용되어온 와송의 생리활성 연구의 일환으로 와송 추출물의 항산화 및 항암 활성을 측정하였으며, 와송과 유사한 활성을 지니는 한약재로 백복령, 창출 및 사인 등의 한약재를 선별하여 이들의 복합물에 대한 in vitro에서 와송과의 시너지 효과를 알아보고자 하였다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
복령의 triterpenoids 성분의 효능은?
사인의 메탄올 추출물로부터 terpenoids, sesquiterpenes, 페놀 화합물 및 플라보노이드가 분리·동정된 바 있으며, 이들 물질은 인체 암세포에 대한 생육 저해능이 보고된 바 있다(43). 복령의 triterpenoids 성분도 폐암, 피부암 및 직장암 등의 암세포에 대한 생육 저해능이 높다고 보고되어 있다(44). 더욱이 항산화능을 지니는 폴리페놀 성분은 hydroxy기가 발암성을 갖는 유리기와 결합함으로써 발암성 물질을 불활성화시키기 때문에 항암활성에도 효과적인 것으로 보고되고 있다(45).
와송 복합물의 성분 중 폴리페놀의 기능은 무엇인가?
복령의 triterpenoids 성분도 폐암, 피부암 및 직장암 등의 암세포에 대한 생육 저해능이 높다고 보고되어 있다(44). 더욱이 항산화능을 지니는 폴리페놀 성분은 hydroxy기가 발암성을 갖는 유리기와 결합함으로써 발암성 물질을 불활성화시키기 때문에 항암활성에도 효과적인 것으로 보고되고 있다(45).
와송(Wasong, Orostachys japonicus A. Berger)의 기능은 무엇인가?
민간과 한의학에서 이용되는 천연식물 소재인 와송(Wasong, Orostachys japonicus A. Berger)은 민간요법에서 오래전부터 면역작용이나 암치료에 이용되어져 왔으며, 항산화(8,9), 항궤양(10) 등의 효능이 알려져 있다. 백복령(Baekbokryung, P oria cocos Wolf)은 내부가 백색인 복령으로 항암, 위궤양 개선, 혈당 강하(11,12) 및 항산화 활성(13)이 있으며, 창출(Changchul, Atractylodis rhizoma)은 지방세포의 분화 억제에 효과적이며, 민간요법에서는 위장관 계통의 질환에 사용되기도 한다(14).
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