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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 전이되기 전의 형태인 primary cancer 조직으로부터 분리된 전립선암세포인 RC-58T/h/SA#4 세포를 이용하여 천연 와송과 재배 와송의 처리에 따른 항암효과 및 apoptosis 유도효과를 확인하였으며, dioxin 및 bisphenol A와 같은 환경호르몬에 의해 성장이 유도된 전립선암세포에서 천연 와송과 재배 와송 처리가 세포 성장을 효과적으로 억제하는지를 알아보았다.
제안 방법
- 각각의 건조된 와송을 분쇄한 후 시료 양의 10배(w/v)량 100% 메탄올과 혼합하여 64°C에서 3시간씩 3회 환류추출한 후 여과하였다.
- 대표적인 환경호르몬인 dioxin과 bisphenol A를 각각 처리한 인체 전립선 암세포에서 재배 와송 및 천연 와송의 암세포 증식 억제효과를 알아보았다. Bisphenol A와 dioxin을 처리한 군에서는 세포의 성장을 비정상적으로 촉진시켰으며, 무처리군과 비교하였을 때 암세포가 두 배 이상 증식한 것으로 나타났다(Fig.
- incubator에서 24시간 배양하여 재배 와송과 천연 와송을 0, 150, 300 및 600 μg/mL의 농도로 첨가하고 48시간 동안 반응시켰다. 반응 종료 후 원심분리 하여 trypan blue(GIBCOⓇ/Invitrogenq)로 염색하고 hemacytometer(Marienfeld Superior, Lauda-Konigshofen, Germany)를 이용하여 세포수를 세었다.
- 암세포 사멸능은 세포를 1×105 cells/mL가 되도록 희석하여 24 well plate에 분주한 다음 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양하여 재배 와송과 천연 와송을 0, 150, 300 및 600 μg/mL의 농도로 첨가하고 48시간 동안 반응시켰다.
- 암세포 증식 억제능은 세포를 1×105 cells/mL가 되도록 희석하여 24 well plate에 분주한 다음 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양하여 재배 와송과 천연 와송을 0, 150, 300 및 600 μg/mL의 농도로 첨가하고 48시간 동안 반응시켰다.
- 암세포를 1×105 cells/mL가 되도록 희석하여 24 well plate에 분주한 다음 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양하여 5% cFBS, 5% cFBS+bisphenol A or dioxin, 5% cFBS+bisphenol A 또는 dioxin+와송을 농도별로 첨가하고 48시간 동안 반응시켰다.
- 암세포를 1×106 cells/mL가 되도록 희석하여 6 well plate에 분주한 다음 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양하여 재배 와송과 천연 와송을 0, 150, 300 및 600 μg/mL의 농도로 well plate에 처리하고 48시간 동안 반응시켰다.
- 암세포를 5×105 cells/mL가 되도록 희석하여 6 well plate에 분주한 다음 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양한 후 재배 와송과 천연 와송을 0, 150, 300 및 600 μg/mL의 농도로 처리하여 48시간 동안 반응시켰다.
- 암세포에서 증식 억제효과는 RC-58T/h/SA#4 암세포에 메탄올 추출물을 각각 150, 300 및 600 μg/mL 농도로 처리하여 48시간 반응시킨 후 SRB assay와 trypan blue assay를 이용하여 알아보았다(Fig. 1, 2).
- ) 및 PBS를 섞은 용액을 넣어 37℃에서 염색하였다. 염색된 세포 현탁액은 flow cy tometer(EPICS XL, Beckman Coulter, Brea, CA, USA)를 이용하여 세포주기를 분석하였다.
- )을 첨가하여 실온에서 10분간 염색시킨 후 PBS로 2회 세척하였다. 염색된 핵을 형광현미경으로 관찰하였다.
- incubator에서 24시간 배양하여 재배 와송과 천연 와송을 0, 150, 300 및 600 μg/mL의 농도로 well plate에 처리하고 48시간 동안 반응시켰다. 이후 세포의 형태학적 변화는 200배율의 광학현미경(Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)으로 관찰하고 사진을 촬영하였다.
- 재배 와송(Orostachys japonicus A. Berher)의 종자는 기와 위에서 자생하는 종자를 채취하여 일주일 동안 5℃의 저온처리 발아법으로 파종하였다. 파종 상토는 흙과 모래, 기와가루를 2:2:1의 비율로 혼합하여 40×30 cm의 플라스틱 화분에 파종하여 3년 동안 생육시킨 후 채취하여 음건한 것을 본 실험에서 재배 와송으로 사용하였다(23).
- 재배 와송과 천연 와송 메탄올 추출물의 처리에 의한 RC-58T/h/SA#4 전립선암세포에서의 apoptosis 유도효과를 알아보기 위해 세포 주기 중 Sub-G1기의 함량 변화를 flow cytometer를 이용하여 알아보았다(Fig. 4). 그 결과 재배 와송과 천연 와송 모두 농도 의존적으로 sub-G1기의 함량을 증가시켰다.
- 재배 와송과 천연 와송의 항암효과 및 apoptosis 유도효과를 입증하기 위하여 RC-58T/h/SA#4 primary 인체 전립선암세포를 이용하여 다양한 실험을 실시하였다. 그 결과 재배 와송과 천연 와송은 전립선암세포에서 농도 의존적으로 높은 암세포 증식 억제효과를 나타내었으며, 대조군과 비교하여 와송 메탄올 추출물 처리 시 세포의 형태가 수축되고 세포의 수가 감소한 것을 형태학적 관찰을 통해 확인할 수 있 었다.
- 환경호르몬으로부터 유도된 암세포의 증식 억제 효과를 측정하였다. Serum의 호르몬 활성을 최소화하기 위하여 FBS에 5% charcoal을 처리하여 55℃에서 30분 동안 교반한 후 3,000 rpm, 4℃, 20분간 원심분리 하여 상등액을 취하고, 이를 2회 반복하여 얻은 상등액을 여과하여 charcoal-treated FBS(cFBS)를 얻은 후 –20℃에서 보관하여 실험에 사용한다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 RC-58T/h/SA#4 인체 전립선 암세포는 primary prostate cancer cell로서 telomerase-immortalized primary malignant tumor-derived human prostate epithelial cell line이다. 본 세포는 Center for Prostate Disease Research(Department of Surgery, Uniformed Services University of Health Sciences, Bethesda, MD, USA)로부터 분양받아 100 units/mL의 Antibiotic Antimycotic(GIBCOⓇ/InvitrogenTM, Grand Island, NY, USA)과 10% FBS(Fetal Bovine Serum, GIBCOⓇ/InvitrogenTM)가 첨가된 DMEM(GIBCOⓇ/InvitrogenTM)을 이용하여 37℃, 5% CO2 incubator(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)에서 계대 배양하여 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 RC-58T/h/SA#4 인체 전립선 암세포는 primary prostate cancer cell로서 telomerase-immortalized primary malignant tumor-derived human prostate epithelial cell line이다. 본 세포는 Center for Prostate Disease Research(Department of Surgery, Uniformed Services University of Health Sciences, Bethesda, MD, USA)로부터 분양받아 100 units/mL의 Antibiotic Antimycotic(GIBCOⓇ/InvitrogenTM, Grand Island, NY, USA)과 10% FBS(Fetal Bovine Serum, GIBCOⓇ/InvitrogenTM)가 첨가된 DMEM(GIBCOⓇ/InvitrogenTM)을 이용하여 37℃, 5% CO2 incubator(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)에서 계대 배양하여 사용하였다.
- 파종 상토는 흙과 모래, 기와가루를 2:2:1의 비율로 혼합하여 40×30 cm의 플라스틱 화분에 파종하여 3년 동안 생육시킨 후 채취하여 음건한 것을 본 실험에서 재배 와송으로 사용하였다(23). 천연와송은 경상북도 포항시에서 채취된 것을 구입하여 사용하였다. 각각의 건조된 와송을 분쇄한 후 시료 양의 10배(w/v)량 100% 메탄올과 혼합하여 64°C에서 3시간씩 3회 환류추출한 후 여과하였다.
- 파종 상토는 흙과 모래, 기와가루를 2:2:1의 비율로 혼합하여 40×30 cm의 플라스틱 화분에 파종하여 3년 동안 생육시킨 후 채취하여 음건한 것을 본 실험에서 재배 와송으로 사용하였다(23).
데이터처리
- Significant differences were compared with 5% cFBS+bisphenol A group at ***P<0.001 by Student t-test.
- Significant differences were compared with 5% cFBS+dioxin group at ***P<0.001 by Student t-test.
- Significant differences were compared with control at ***P<0.001 by Student t-test.
- Significant differences were compared with control at **P<0.01 and ***P<0.001 by Student t-test.
- Significant differences were compared with control at **P<0.01, ***P<0.001 by Student t-test.
- 각 군 간의 통계적 유의성에 대한 검증은 Student's t-test를 실시하여 유의성 여부를 판정하였다(*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001).
- 실험결과는 3 반복에 대한 평균 및 표준편차로 표시하였으며, 각 실험군을 대조군에 대한 백분율로 나타내었다. 각 군 간의 통계적 유의성에 대한 검증은 Student's t-test를 실시하여 유의성 여부를 판정하였다(*P<0.
이론/모형
- 암세포 증식 억제능은 sulforhodamine B(SRB, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)법을 이용하여 측정하였다. SRB법은 생존 세포 내의 단백질 총량을 흡광도로 나타내어 세포 사멸 정도를 확인하는 방법이다.
성능/효과
- 대표적인 환경호르몬인 dioxin과 bisphenol A를 각각 처리한 인체 전립선 암세포에서 재배 와송 및 천연 와송의 암세포 증식 억제효과를 알아보았다. Bisphenol A와 dioxin을 처리한 군에서는 세포의 성장을 비정상적으로 촉진시켰으며, 무처리군과 비교하였을 때 암세포가 두 배 이상 증식한 것으로 나타났다(Fig. 6). 반면 bisphenol A를 처리한 세포에 재배 와송과 천연 와송을 처리하였을 때 농도 의존적으로 암세포의 성장을 억제하였다.
- 4). 그 결과 재배 와송과 천연 와송 모두 농도 의존적으로 sub-G1기의 함량을 증가시켰다. 또한 hoechst 33258 염색을 통해 핵 형태 변화를 관찰한 결과(Fig.
- 재배 와송과 천연 와송의 항암효과 및 apoptosis 유도효과를 입증하기 위하여 RC-58T/h/SA#4 primary 인체 전립선암세포를 이용하여 다양한 실험을 실시하였다. 그 결과 재배 와송과 천연 와송은 전립선암세포에서 농도 의존적으로 높은 암세포 증식 억제효과를 나타내었으며, 대조군과 비교하여 와송 메탄올 추출물 처리 시 세포의 형태가 수축되고 세포의 수가 감소한 것을 형태학적 관찰을 통해 확인할 수 있 었다. 또한 와송 메탄올 추출물의 처리에 따른 RC-58T/h/SA#4 세포에서의 apoptosis 유도효과는 sub-G1기의 함량 증가와 hoechst 염색을 통한 apoptotic bodies 형성 및 핵 형태 변화를 관찰을 통해 확인할 수 있었다.
- Oh 등(10)은 와송이 HL60 인간 급성 전골수성백혈병 세포에서 apoptosis를 유도한다고 보고하였다. 따라서 와송은 RC-58T/h/SA#4 primary 인체 전립선암세포를 포함한 다양한 암세포에서 apoptosis 유도를 통해 세포 성장 억제 효과를 나타낸다는 것을 알 수 있었다.
- 04%로 가장 높은 암세포의 성장 억제효과를 보였다. 또한 dioxin을 처리한 세포에 재배 와송과 천연 와송을 농도별로 처리했을 때 농도 의존적으로 암세포의 성장이 억제되는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 7). 특히 600μg/mL 농도에서는 각각 31.
- 그 결과 재배 와송과 천연 와송 모두 농도 의존적으로 sub-G1기의 함량을 증가시켰다. 또한 hoechst 33258 염색을 통해 핵 형태 변화를 관찰한 결과(Fig. 5), control에서는 핵의 형태가 손상 없이 일정하게 유지되어 있는 반면, 와송 메탄올 추출물을 처리한 군에서는 모두 핵의 응축, 절편 및 apoptotic body가 관찰되었다. 특히 300 및 600 μg/mL 농도에서는 세포 수축 및 apoptotic body가 눈에 띄게 많이 관찰되었다.
- 그 결과 재배 와송과 천연 와송은 전립선암세포에서 농도 의존적으로 높은 암세포 증식 억제효과를 나타내었으며, 대조군과 비교하여 와송 메탄올 추출물 처리 시 세포의 형태가 수축되고 세포의 수가 감소한 것을 형태학적 관찰을 통해 확인할 수 있 었다. 또한 와송 메탄올 추출물의 처리에 따른 RC-58T/h/SA#4 세포에서의 apoptosis 유도효과는 sub-G1기의 함량 증가와 hoechst 염색을 통한 apoptotic bodies 형성 및 핵 형태 변화를 관찰을 통해 확인할 수 있었다. 한편 재배 와송과 천연 와송은 dioxin과 bisphenol A와 같은 환경호르몬 처리에 의해 비정상적으로 증가된 전립선암세포의 성장을 억제하는 것으로 나타났다.
- 특히 600 μg/mL 농도에서 가장 높은 세포 증식 억제능을 나타내었다. 또한 재배 와송과 천연 와송 메탄올 추출물의 처리에 따른 RC-58T/h/SA#4 전립선 암세포를 형태학적 변화 관찰을 통하여 확인한 결과, control에서는 culture plate에 안정적으로 부착되어 정상적인 증식이 이루어진 모습을 보였으나 재배 와송과 천연 와송을 처리한 세포는 추출물의 농도가 높아질수록 세포가 부착되어 있지 않고 부유하였으며 세포의 수가 감소한 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 3). 특히 600 μg/mL 농도에서는 거의 모든 세포가 부착되지 못하고 부유하고 있는 것을 확인하였다.
- 한편 재배 와송과 천연 와송은 dioxin과 bisphenol A와 같은 환경호르몬 처리에 의해 비정상적으로 증가된 전립선암세포의 성장을 억제하는 것으로 나타났다. 본 연구 결과, 재배 와송과 천연 와송은 RC-58T/h/SA#4 전립선암 세포에서 유사한 암세포 성장 억제효과와 apoptosis 유도효과를 가지고 있음을 확인하였으며, 환경호르몬에 의해 유발될 수 있는 암에 대해서도 유사한 보호 효과를 가지고 있음을 증명하였다.
- 위의 결과를 통해 재배 와송은 RC-58T/h/SA#4 세포에서 천연 와송과 유사하게 높은 세포 성장 억제 효과를 가지고 있다는 것을 알 수 있다. 이밖에도 Kim 등(9)은 SW480인체 대장암세포에서 재배 와송과 천연 와송 메탄올 추출물 모두 암세포의 성장을 농도 의존적으로 억제하였으며, 특히 500 μg/mL의 농도에서 높은 암세포 성장 억제효과를 나타내었다고 보고하였다.
- Kwon 등(22)은 환경호르몬의 처리에 의해 증식이 유도된 RC-58T/h/SA#4 인체 전립선암세포에서 산수유 에탄올 추출물이 전립선암세포의 증식을 억제하였다고 보고하였으며, Park 등(29)은 당귀 메탄올 추출물 및 decursin의 처리가 환경호르몬에 의해 증식이 유도된 MCF-7 인체 유방암 세포의 증식을 억제하였다고 보고하였다. 위의 실험 결과들과 같이 재배 와송과 천연 와송이 모두 dioxin 및 bisphenol A와 같은 환경호르몬에 의한 전립선암세포의 비정상적인과 증식을 억제한다는 것을 알 수 있었다.
- 특히 300 및 600 μg/mL 농도에서는 세포 수축 및 apoptotic body가 눈에 띄게 많이 관찰되었다. 이러한 결과를 통해서 재배 와송 및 천연 와송 메탄올 추출물에 의한 세포 사멸이 apoptosis에 의한 것임을 알 수 있었다.
- 33%로 가장 높은 암세포의 성장 억제효과를 보였다. 이러한 결과를 통해서 재배 와송과 천연 와송은 환경호르몬에 의해 성장이 촉진된 암세포에 대해서 우수한 세포 성장 억제효과를 나타낸다는 것을 알 수 있었다.
- 특히 600 μg/mL 농도에서 가장 높은 세포 증식 억제능을 나타내었다.
- 특히 600 μg/mL 농도에서는 거의 모든 세포가 부착되지 못하고 부유하고 있는 것을 확인하였다.
- 또한 와송 메탄올 추출물의 처리에 따른 RC-58T/h/SA#4 세포에서의 apoptosis 유도효과는 sub-G1기의 함량 증가와 hoechst 염색을 통한 apoptotic bodies 형성 및 핵 형태 변화를 관찰을 통해 확인할 수 있었다. 한편 재배 와송과 천연 와송은 dioxin과 bisphenol A와 같은 환경호르몬 처리에 의해 비정상적으로 증가된 전립선암세포의 성장을 억제하는 것으로 나타났다. 본 연구 결과, 재배 와송과 천연 와송은 RC-58T/h/SA#4 전립선암 세포에서 유사한 암세포 성장 억제효과와 apoptosis 유도효과를 가지고 있음을 확인하였으며, 환경호르몬에 의해 유발될 수 있는 암에 대해서도 유사한 보호 효과를 가지고 있음을 증명하였다.
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