[국내논문]도인승기탕의 B16F10 세포주에서의 멜라닌 생성 및 유전자 발현 억제 효과 Effects of Doinsenggitang on Melanin Synthesis and Gene Expression Inhibition in B16F10 Melanoma Cells원문보기
본 연구는 B16F10 melanoma 세포를 사용하여 도인승기탕의 70% EtOH와 물 추출물의 멜라닌 생합성, tyrosinase 활성, western blotting으로 측정하였다. 도인승기탕 추출물은 농도 의존적으로 멜라닌 생합성과 tyrosinase활성을 저해하였다. 그 결과 도인승기탕 70% 에탄올 추출물이 멜라닌 합성을 40%, tyrosinase는 51% 저해효과를 나타내었다. Western blot을 이용하여 B16F10 melanoma 세포 내에 tyrosinase, TRP-1, TRP-2, MITF의 발현을 억제하는 효과를 관찰하였다. 이상의 결과에 따라 도인승기탕의 70% 에탄올 추출물은 미백 소재로서 가능성을 가지는 것으로 나타났다.
본 연구는 B16F10 melanoma 세포를 사용하여 도인승기탕의 70% EtOH와 물 추출물의 멜라닌 생합성, tyrosinase 활성, western blotting으로 측정하였다. 도인승기탕 추출물은 농도 의존적으로 멜라닌 생합성과 tyrosinase활성을 저해하였다. 그 결과 도인승기탕 70% 에탄올 추출물이 멜라닌 합성을 40%, tyrosinase는 51% 저해효과를 나타내었다. Western blot을 이용하여 B16F10 melanoma 세포 내에 tyrosinase, TRP-1, TRP-2, MITF의 발현을 억제하는 효과를 관찰하였다. 이상의 결과에 따라 도인승기탕의 70% 에탄올 추출물은 미백 소재로서 가능성을 가지는 것으로 나타났다.
This study involved observation of the inhibitory effect of 70% EtOH and water extracts from Doinseunggitang on melanin synthesis, tyrosinase activity, and western blotting using B16F10 melanoma cells. Doinseunggitang extracts inhibited melanin synthesis and tyrosinase activity in a dependent manner...
This study involved observation of the inhibitory effect of 70% EtOH and water extracts from Doinseunggitang on melanin synthesis, tyrosinase activity, and western blotting using B16F10 melanoma cells. Doinseunggitang extracts inhibited melanin synthesis and tyrosinase activity in a dependent manner. As a result, it was found that Doinseunggitang 70% EtOH extracts inhibit melanin synthesis and tyrosinase activity, respectively, by 40% and 51%. In addition, western blotting analysis showed that 70% EtOH extracts inhibited tyrosinase, MITF, TRP-1, and TRP-2 expression. These results show that 70% ethanol extracts of Doinseunggitang could be developed as a skin whitening material in cosmetics.
This study involved observation of the inhibitory effect of 70% EtOH and water extracts from Doinseunggitang on melanin synthesis, tyrosinase activity, and western blotting using B16F10 melanoma cells. Doinseunggitang extracts inhibited melanin synthesis and tyrosinase activity in a dependent manner. As a result, it was found that Doinseunggitang 70% EtOH extracts inhibit melanin synthesis and tyrosinase activity, respectively, by 40% and 51%. In addition, western blotting analysis showed that 70% EtOH extracts inhibited tyrosinase, MITF, TRP-1, and TRP-2 expression. These results show that 70% ethanol extracts of Doinseunggitang could be developed as a skin whitening material in cosmetics.
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제안 방법
배지를 제거한 후 각 cell에 도인승기탕 추출물(10, 50, 100 μg/ml)과 arbutin (100μg/ml)을 48시간 동안 처리 후 PBS로 세척하였다.
L-DOPA를 2 mg/ml 농도로 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 6.8)에 녹여 기질을 준비하고 기질 160 μl 에 효소용액 40 μl를 가하고 37℃에서 1시간 가온하고 생성된 DOPA chrome의 양을 490 nm에서 측정한 후 (1-시료의 흡광도/대조구의 흡광도)×10 에 의하여 억제율을 계산하였다.
B16F10 melanoma cell을 6 well에 5×104 cell이 되도록 접종하여 배양하고, 24시간 뒤 각 well에 도인승기탕 추출물(10, 50, 100 μg/ml)과 arbutin (100 μg/ml)을 48시간 동안 처리한다.
10% dimethyl sulfoxide (DMSO)가 첨가된 1N NaOH 용액을 150 μl 첨가하고 60℃에서 1시간 용해하였으며 405 nm에서 흡광도를 측정한 후 실험군의 멜라닌 양은 대조군의 멜라닌 양에 대한 백분율로 계산하여 나타내었다.
B16F10 melanoma cell을 6 well에 5×104 cell이 되도록 접종하여 배양하고, 24간 뒤 각 well에 도인승기탕 추출물(10, 50, 100μg/ml)와 arbutin (100 μg/ml)을 48시간 동안 처리하였다.
배양 후 5 mg/ml 농도로 제조한 MTT 용액 20 μl를 첨가하여 3시간 배양한 후 배양액을 제거하고 각 well당 DMSO 200 μl를 가하여 실온에서 30분간 반응 시킨 뒤 ELISA reader로 550 nm에서 흡광도를 측정한 후 (1-시료의 흡광도/대조구의 흡광도)×100에 의하여 생존율을 계산하였다.
따라서 본 연구에서는 B16F10 melanoma 세포를 배양한 후 도인승기탕 추출물을 처리하여 melanin 함량, tyrosinase 활성, western blot을 이용하여 MITF, tyrosinase, TRP-1, TRP-2 등의 단백질 발현을 통해 미백효과에 미치는 영향을 관찰하였다.
도인승기탕 제조에 필요한 구성약재는 휴먼허브(경북 경산시)에서 구입하여 사용하였다. 시료는 대황 30 g, 계지 20 g, 도인 100 g, 망초 20 g, 감초 100 g을 혼합하여 열수 추출은 시료에 증류수를 1배의 양을 가하여 85℃에서 3시간 환류 냉각 추출한 뒤 상등액과 침전물을 분리하여 3회 반복 추출하였다. 에탄올 추출물은 시료에 10배 양의 70% 에탄올을 첨가하여 실온에서 24시간 동안 침지 추출한 후 상등액과 침전물을 분리하는 방법으로 3회 반복 추출하였다.
시료는 대황 30 g, 계지 20 g, 도인 100 g, 망초 20 g, 감초 100 g을 혼합하여 열수 추출은 시료에 증류수를 1배의 양을 가하여 85℃에서 3시간 환류 냉각 추출한 뒤 상등액과 침전물을 분리하여 3회 반복 추출하였다. 에탄올 추출물은 시료에 10배 양의 70% 에탄올을 첨가하여 실온에서 24시간 동안 침지 추출한 후 상등액과 침전물을 분리하는 방법으로 3회 반복 추출하였다. 그리고 Whatman No.
B16F10 melanoma cell은 ATCC (American Type Culture Collection)에서 분양 받아 사용하였으며, Michikaw 등[23]의 방법에 따라 배양하였다. 세포에 0.25% trypsin 용액을 희석 처리한 후 세포를 분리한 다음 DMEM배지에 10% FBS와 1% penicillin/streptomycin (100 U/ml)을 첨가하여 37℃, 5% CO2 incubator에 적응시켜 배양하였다.
멜라닌 양은 Hosoi 등[10]의 방법을 변형하여 사용하였다. B16F10 melanoma cell을 6 well에 5×104 cell이 되도록 접종하여 배양하고, 24간 뒤 각 well에 도인승기탕 추출물(10, 50, 100μg/ml)와 arbutin (100 μg/ml)을 48시간 동안 처리하였다.
Tyrosinase 활성 측정은 Choi 등[4]의 방법을 변형하여 측정하였다. B16F10 melanoma cell을 6 well에 5×104 cell이 되도록 접종하여 배양하고, 24시간 뒤 각 well에 도인승기탕 추출물(10, 50, 100 μg/ml)과 arbutin (100 μg/ml)을 48시간 동안 처리한다.
원심분리하여 얻은 단백질은 BCA (bicinchoninic acid) kit assay로 정량하였으며, 60 μl의 단백질을 10%의 SDS-PAGE를 이용하여 전기 영동 한 후, 항체의 비특이적 결합을 억제시키기 위해 PVDF membrane에 옮긴 다음 400 mV에서 2시간 transfer하였다.
Transfer가 끝난 membrane은 5% skim milk로 1시간 동안 blocking을 한 뒤 1차 antibody tyrosinase, TRP-1, TRP-2, MITF는 3% skim milk로 1:1000희석하여 사용하고 overnight 한다. Tris-buffered salin and tween 20 (TBST)로 3번 세척한뒤 2차 antibody anti-goat, anti-mouse, anti-rabbit은 3% skim milk로 1:1,000 희석하여 1시간 동안 붙이고 TBST로 3번 세척한 뒤 enhanced chemiluminescense (ECL) kit (Milipore, Germany)를 이용하여 발현 양상을 측정하였다. Band density 는 gel doc (Amersham Pharmacia, England)을 이용하여 확인하였다.
도인승기탕 추출물의 멜라닌 생성 억제 효과를 분석하기 위해 MITF, tyrosinase, TRP-1, TRP-2의 유전자 발현 양상을 관찰하였다(Fig. 4). Tyrosianse에 관한 도인승기탕 추출물은 물 추출물 및 70% 에탄올 추출물 100 μg/ml에서 각각 17%, 24%를 저해하였고 arbutin은 2% 저해하였다.
대상 데이터
실험에 사용한 기기는 ELISA reader (Tecan, Mönnedorf, Switzerland), rotary vacuum evaporator (Rikakikai Co., Tokyo, Japan), freeze drier (Ilsin, Gyonggi-do, Korea), centrifuge (Eppendorf, AG, Germany), microscope (Nikon, Tokyo, Japan), CO2 incubator (Hanbaek, Gyeonggi-do, Korea), haemacytometer (Marienfeld, Germany)를 사용하였다.
도인승기탕 제조에 필요한 구성약재는 휴먼허브(경북 경산시)에서 구입하여 사용하였다. 시료는 대황 30 g, 계지 20 g, 도인 100 g, 망초 20 g, 감초 100 g을 혼합하여 열수 추출은 시료에 증류수를 1배의 양을 가하여 85℃에서 3시간 환류 냉각 추출한 뒤 상등액과 침전물을 분리하여 3회 반복 추출하였다.
Louis, USA)에서 구입하여 사용하였다. 1차 항체 인 tyrosinase, MITF, TRP-1, TRP-2와 2차 항체는 santa cruz (CA, USA)에서 구입하여 사용하였다. 실험에 사용한 기기는 ELISA reader (Tecan, Mönnedorf, Switzerland), rotary vacuum evaporator (Rikakikai Co.
B16F10 melanoma cell은 ATCC (American Type Culture Collection)에서 분양 받아 사용하였으며, Michikaw 등[23]의 방법에 따라 배양하였다. 세포에 0.
세포배양을 위한 Dulbeco's modified eagle’s medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), streptomycin penicillin, trypsin 250은 Gibco BRL Co. (Grand Island, NY, USA)로부터 구입하여 사용하였고, 3-[4,5-dimethyl-thiazol-2-yl]-2,5- diphenyl-tetrazoliumbromide (MTT), arbutin, L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA)는 Sigma Chemical Co. (St. Louis, USA)에서 구입하여 사용하였다.
데이터처리
결과 통계처리는 SPSS 10.0을 사용하였으며, 유의차 검증은 분산분석(ANOVA: analysis of variance)을 한 후 α=0.05 수준에서 Tukey’s HSD test에 의해 유의성을 분석하였다.
이론/모형
세포 생존률 측정은 Carmichael 등[3]의 방법에 따라 측정하였다. 세포를 96 well plate에 0.
성능/효과
도인승기탕 70%에탄올 추출물 100 μg/ml에서 51%의 활성 억제가 관찰 되었고 물 추출물은 100 μg/ml에서 28%의 억제효과가 나타났다.
멜라닌 합성 억제는 물 추출물보다 70% 에탄올 추출물을 처리하였을때 우수하였으며 특히 70%에탄올 추출물을 100 μg/ml로 처리하였을 때 55%의 멜라닌 합성 억제 효과를 관찰하였다.
도인승기탕 추출물의 멜라닌 합성을 확인한 결과, arbutin의 경우 100 μg/ml으로 처리하였을 때 멜라닌 합성을 58% 저해하였다(Fig. 2).
도인승기탕 추출물의 B16F10 melanoma cell증식에 미치는 영향을 알아보기 위하여 도인승기탕 70% 에탄올 추출물 및 물 추출물을 10, 25, 50, 75, 100, 250 μg/ml의 농도로 처리하고 48시간 후에 MTT방법으로 세포의 증식을 관찰한 결과 대조군의 세포 증식율을 100%로 하였을 때 250 μg/ml 이하 농도에서는 독성이 관찰되지 않았다(Fig. 1).
Tyrosinase의 활성은 melanosome에서 멜라닌이 생성되게 하는 효소로써 피부노화 촉진 및 색소 침착 등의 문제를 야기 시킬 수 있다[33]. 도인승기탕 추출물 첨가에 따른 tyrosinase 활성 측정 결과 시료의 처리 농도가 높아질수록 tyrosinase 활성이 억제 됨을 확인 할 수 있었다(Fig. 3). 도인승기탕 70%에탄올 추출물 100 μg/ml에서 51%의 활성 억제가 관찰 되었고 물 추출물은 100 μg/ml에서 28%의 억제효과가 나타났다.
TRP-1은 물 추출물과 70% 에탄올 추출물 100 μg/ml에서 각각 23%, 31%저해하였으며 arbutin은 100 μg/ml에서 7% 저해율을 관찰할수 있었다.
그리고 도인승기탕 추출물의 MTTF 발현에 미치는 효과를 관찰한 결과 물 추출물과 70% 에탄올 추출물 100 μg/ml에서 각각 23%, 35% 저해되었고 arbutin은 100 μ g/ml에서 22% 저해되는 것을 관찰 할 수 있었다.
TRP-1은 물 추출물과 70% 에탄올 추출물 100 μg/ml에서 각각 23%, 31%저해하였으며 arbutin은 100 μg/ml에서 7% 저해율을 관찰할수 있었다. TRP-2의 발현 양상 역시 TRP-1과 마찬가지로 도인승기탕 70% 에탄올 추출물이 물 추출물과 arbutin보다 저해율이 우수하였다. 그리고 도인승기탕 추출물의 MTTF 발현에 미치는 효과를 관찰한 결과 물 추출물과 70% 에탄올 추출물 100 μg/ml에서 각각 23%, 35% 저해되었고 arbutin은 100 μ g/ml에서 22% 저해되는 것을 관찰 할 수 있었다.
김 등[13]의 연구결과에 따르면 이러한 MITF의 억제는 tyrosinase의 발현 억제를 통하여 melanin 색소 생성을 억제할수 있으며 MITF의 발현이 억제되면 색소생성이 억제될 수 있다고 보고하였다. 본 연구에서는 멜라닌 생합성에 관여하는 MITF, tyrosinase, TRP-1, TRP-2의 단백질 발현을 측정한 결과와 멜라닌 생합성을 확인한 실험 결과와 연관성이 있는 것으로 확인할 수 있었다.
후속연구
이와 같은 연구결과를 바탕으로 향후 도인승기탕 추출물이 천연 미백 소재로 활용할 수 있을 것으로 생각된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
멜라닌(melanin)이란?
멜라닌(melanin)은 자연계에 널리 존재하는 생체 고분자 물질로 인간의 피부 색깔을 결정짓는 색소로 알려져 있으며 자외선이나 free radical 로부터 피부가 손상되는 것을 방지하는 역할을 담당하고 있다[19]. 이 색소는 멜라닌형성세포 내에 위치하는 멜라노좀(melanosome)에 의해 만들어지며 형성된 멜라닌은 각질형성세포로 이동하여 피부 상피층에 축적되어 색소침착 현상이 나타난다[22].
멜라닌 색소침착 현상이 나타나는 과정은?
멜라닌(melanin)은 자연계에 널리 존재하는 생체 고분자 물질로 인간의 피부 색깔을 결정짓는 색소로 알려져 있으며 자외선이나 free radical 로부터 피부가 손상되는 것을 방지하는 역할을 담당하고 있다[19]. 이 색소는 멜라닌형성세포 내에 위치하는 멜라노좀(melanosome)에 의해 만들어지며 형성된 멜라닌은 각질형성세포로 이동하여 피부 상피층에 축적되어 색소침착 현상이 나타난다[22]. 멜라닌 합성은 아미노산의 하나인 tyrosine을 기질로 tyrosinase, tyrosinase related protein-1 (TRP-1), tyrosinase related protein-2 (TRP-2)에 의해 3,4-dihydroxyphenylalanine (DOPA)를 거쳐 DOPA quinone으로 전환되고 자동산화반응과 효소반응으로 DOPA chrome을 거쳐 흑갈색의 공동합체인 멜라닌이 생성하게 된다[30].
현재 알려진 멜라닌 합성 저해를 위한 미백원료 물질이 가진 문제점은?
특히 tyrosinase 효소는 melanocyte에서 멜라닌 색소의 합성에서 주요 핵심 효소로써 eumelanin과 pheomelanin의 합성에 절대적으로 필요한 것으로 알려져 있고[9,26,32,34], 최근에는 이와 같은 효소를 억제하여 멜라닌 합성 저해를 위한 연구가 활발히 이루어지고 있다[28]. 현재 알려진 미백원료로는 arbutin, kojic acid, ascorbic acid 등의 물질들이 대표적으로 사용되어 왔으나 이러한 물질 들은 불안정하여 분해나 착색, 이취, 효과의 불분명 및 안전성 문제 등으로 사용이 제한되고 있는 실정이다[36,5,35,38]. 이에 따라 세포에 영향을 미치지 않으며 melanin 합성을 감소시키는 천연 미백제에 대한 연구가 활발히 진행 중이다.
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