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문제 정의
- 본 연구에서는 미백활성이 있으며, 피부에 안전한 소재인천연물에 대한 연구가 활발하게 진행됨에 따라 한국 전역에 자생하고 있는 노간주나무 추출물을 이용하여 화장품약리활성 및 피부메커니즘을 검증한 후, 새로운 기능성 화장품 소재로서의 가능성을 탐색하고자 한다.
제안 방법
- DEPC를 50 μl씩 분주하여 녹인 후 96 well plate에 RNA 5 ul와 멸균수 195 μl를 첨가하여 260 nm, 280 nm에서 각각 흡광도를 측정하여 total RNA양을 측정하였다.
- Oligo (dT) 15 primer (500 μg/ml) 1 μg, 추출한 RNA (2 μg)와 nuclease free water로 10 μl를 맞추고 75℃에서 5분, 4℃에서 5분간 반응시킨 후 5× reaction buffer, MgCl2, PCR nucleotide mix, recombinant rnasin ribonuclease inhibitor, reverse transcriptase, nuclease free water을 첨가하여(총 20 μl) 25℃ 5분, 42℃ 60분, 70℃ 15분, 4℃ 유지로 반응시켜 cDNA를 합성시켰다.
- Oligo (dT) 15 primer (500 μg/ml) 1 μl, 추출한 RNA (2 μg)와 nuclease free water로 10 μl를 맞추고 75℃에서 5분간 반응시킨 후 5X reaction buffer, MgCl2, PCR necleotide mix, rnasin inhibitor, reverse transcriptase, ruclease free water를 첨가하여 25℃에서 5분, 42℃에서 60분, 70℃에서 15분간 반응시켜 cDNA를 합성시켰다.
- PCR tube 에 5× green GoTaq flexi buffer, MgCl2, PCR nucleotide mix (10 mM), primer, GoTaq DNA polymerase, nuclease free water, 합성한 cDNA를 첨가하여 잘 섞은 후 PCR을 실행하였다.
- Tyrosinase는 94℃ 3분, 94℃ 30초, 60℃ 45초, 72℃ 45초, 72℃5분(40 cycles)를 하였으며, TRP-1, TRP-2, MITF은 94℃ 3분, 94℃ 30초, 58℃ 45초, 72℃ 45초, 72℃ 5분(40 cycles)를 하였으며, GAPDH는 94℃ 3분, 94℃ 30초, 55℃ 45초, 72℃ 45초, 72℃ 5분(35 cycles)를 하였다. PCR로 합성 시킨 후 0.002% ethidium bromide를 첨가한 1.5% agarose gel에 100 V에서 40분간 전기영동 후 LAS 4,000을 이용하여 밴드를 확인하여 분석 정량하였다.
- Tyrosinase, MITF, TRP-1, TRP-2의 mRNA 발현을 알아보기 위하여 polymerase chain reaction (PCR)을 실시하였다. 실험에 사용한 primer sequences는 Table 1과 같다.
- PCR tube 에 5× green GoTaq flexi buffer, MgCl2, PCR nucleotide mix (10 mM), primer, GoTaq DNA polymerase, nuclease free water, 합성한 cDNA를 첨가하여 잘 섞은 후 PCR을 실행하였다. Tyrosinase는 94℃ 3분, 94℃ 30초, 60℃ 45초, 72℃ 45초, 72℃5분(40 cycles)를 하였으며, TRP-1, TRP-2, MITF은 94℃ 3분, 94℃ 30초, 58℃ 45초, 72℃ 45초, 72℃ 5분(40 cycles)를 하였으며, GAPDH는 94℃ 3분, 94℃ 30초, 55℃ 45초, 72℃ 45초, 72℃ 5분(35 cycles)를 하였다. PCR로 합성 시킨 후 0.
- 시료의 에탄올 추출물은 70% 에탄올 10배의 양을 가하여 실온에서 24시간 침지하여 상등액과 침전물을 분리하여 동일한 방법으로 3회 반복 추출하였고, 열수 추출물은 증류수 10배의 양을 가하여 80℃에서 3시간가량 환류냉각 추출해 실온에서 24시간 침지하여 상등액과 침전물을 분리하여 동일한 방법으로 3회 반복 추출하였다. 각 시료 추출물은 여과지(Whatman No.2)를 이용하여 여과한 후 EYELA evaporator로 감압 농축하여 용매를 완전히 제거한 후 동결 건조하여 -20℃ 에 보관하면서 본 실험의 시료로 사용하였으며, 효소 실험 후 활성이 우수한 에탄올 추출물을 이용하여 세포실험을 실시하였다.
- 그 후 cDNA 와 2× SYBR green mix, primer, ROX를 각각 넣어 ABI step one plus (Applied biosystem, USA) 기기를 이용하여 95℃ 10분, 95℃ 3초, 60℃ 30초, 95℃ 15초, 60℃ 1분, 95℃ 15초(45 cycles)로 실시간 정량 분석을 한 뒤 analysis program을 이용하여 결과를 분석하였다.
- 노간주 나무 에탄올 추출물의 멜라노마 세포의 생존율을 확인한 결과 Fig. 2에서 보는 바와 같이 노간주나무 에탄올 추출물의 경우 10 μg/ml 이하에서 90% 이상의 세포 생존율을 나타내었으므로 본 실험에서 50 μg/ml 이하의 농도에서 실험을 하였다.
- 노간주나무 에탄올 추출물이 melanin 합성에 관계된 효소인 tyrosinase에 미치는 영향을 알아보기 위하여 B16F10 mouse melanoma 세포에 농도별로 5, 25, 50 μg/ml 처리 한 후 24시간 후에 tyrosinase, MITF, TRP-1, TRP-2 protein 발현을 western blotting으로 확인하였다.
- 또한 노간주나무 에탄올 추출물이 melanin 합성에 관계된 key enzyme인 tyrosinase, MITF, TRP- 1, TRP-2 mRNA에 미치는 영향을 알아보기 위하여 B16F10 mouse melanoma 세포에 농도별로 5, 25, 50 μg/ml 처리한 후 24시간 후에 polymerase chain reaction (PCR)으로 mRNA 발현양을 측정하였다.
- 멜라노마 세포로부터 추출 되어진 RNA를 260 nm, 280 nm에서 흡광도를 측정하여 정량 하였다. Oligo (dT) 15 primer (500 μg/ml) 1 μg, 추출한 RNA (2 μg)와 nuclease free water로 10 μl를 맞추고 75℃에서 5분, 4℃에서 5분간 반응시킨 후 5× reaction buffer, MgCl2, PCR nucleotide mix, recombinant rnasin ribonuclease inhibitor, reverse transcriptase, nuclease free water을 첨가하여(총 20 μl) 25℃ 5분, 42℃ 60분, 70℃ 15분, 4℃ 유지로 반응시켜 cDNA를 합성시켰다.
- 멜라닌 생성에 관여하는 유전자 중 tyrosinase, MITF, TRP1, TRP-2, GAPDH의 활성을 확인하기 위하여 cell line B16F10을 100 mm tissue culture dish에 cell seeding 후 24시간 동안 배양하여 cell을 안정화 시켰다. 배지를 제거한 후 추출물을 농도별로 처리한 배지로 24∼48시간 배양한 후 다시 배지를 제거하고 phosphate buffered saline (PBS)로 2 세척해주었다.
- 본 연구에서는 노간주나무 추출물이 멜라닌 생성에 관여하는 유전자들에 미치는 영향을 평가하는 일환으로 tyrosinase, MITF, TRP-1, TRP-2의 단백질과 mRNA 발현에 미치는 영향을 측정하였다(Fig. 3∼Fig. 6의 A, B).
- )는 충북 괴산에서 2012년 봄에 생산 된 건채를 구입하여 추출시료로 사용하였다. 시료의 에탄올 추출물은 70% 에탄올 10배의 양을 가하여 실온에서 24시간 침지하여 상등액과 침전물을 분리하여 동일한 방법으로 3회 반복 추출하였고, 열수 추출물은 증류수 10배의 양을 가하여 80℃에서 3시간가량 환류냉각 추출해 실온에서 24시간 침지하여 상등액과 침전물을 분리하여 동일한 방법으로 3회 반복 추출하였다. 각 시료 추출물은 여과지(Whatman No.
- 노간주나무 에탄올 추출물이 melanin 합성에 관계된 효소인 tyrosinase에 미치는 영향을 알아보기 위하여 B16F10 mouse melanoma 세포에 농도별로 5, 25, 50 μg/ml 처리 한 후 24시간 후에 tyrosinase, MITF, TRP-1, TRP-2 protein 발현을 western blotting으로 확인하였다. 이때 세포의 여러 조건에서도 그 발현 정도의 차이가 거의 없는 house keeping gene인 GAPDH를 positive control로 사용하였다. Fig.
대상 데이터
- Louis, MO)에서 구입하였으며, MMP-1, tyrosinase, TRP-1, TRP-2, GAPDH, primary antibody와 mouse-anti-goat, rabbbit-anti-mouse 등 secondary antibody는 Santacruz (CA, USA) 에서 구입하였으며, MITF는 Abcam (USA)에서 구입하였다. Real-time PCR에 사용된 HotStart-IT SYBR Green qPCR Master Mix (2X)는 USB Products Affymetrix (Inc, Cleveland, Ohio USA)에서 구입하였다.
- 미백효과 측정에 사용된 시약인 tyrosinase mushroom, dimethyl sulfoxide (DMSO), L-3,4-dihydroxy-phenyl-alanine (L-DOPA) 등은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO)에서 구입하였으며, MMP-1, tyrosinase, TRP-1, TRP-2, GAPDH, primary antibody와 mouse-anti-goat, rabbbit-anti-mouse 등 secondary antibody는 Santacruz (CA, USA) 에서 구입하였으며, MITF는 Abcam (USA)에서 구입하였다. Real-time PCR에 사용된 HotStart-IT SYBR Green qPCR Master Mix (2X)는 USB Products Affymetrix (Inc, Cleveland, Ohio USA)에서 구입하였다.
- 본 실험에 사용된 노간주나무(Juniperus rigida Sieb.)는 충북 괴산에서 2012년 봄에 생산 된 건채를 구입하여 추출시료로 사용하였다. 시료의 에탄올 추출물은 70% 에탄올 10배의 양을 가하여 실온에서 24시간 침지하여 상등액과 침전물을 분리하여 동일한 방법으로 3회 반복 추출하였고, 열수 추출물은 증류수 10배의 양을 가하여 80℃에서 3시간가량 환류냉각 추출해 실온에서 24시간 침지하여 상등액과 침전물을 분리하여 동일한 방법으로 3회 반복 추출하였다.
- 본 실험에 이용한 각 세포의 배양은 10% FBS와 1% penicillin/streptomycin (100 U/ml)을 첨가한 DMEM 배지를 사용하였으며, 37℃, 5% CO2 세포배양기에 적응시켜 계대 배양하였다.
- 실험에 사용된 기기는 ELISA Reader (Tecan, Austria), PCR (C-100, Bio-Rad, USA), Real-time PCR (StepOnePlus, Applied Biosystems, Germany), Multilabel plate Reader (VICTOR X5, PerkinElmer, USA), Multi Shaker (FINEPCR, Korea), ImageQuant LAS 4000 (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Sweden), Semi-Dry Transfer unit (TE77XP, Hoefer, USA)을 사용하였다.
이론/모형
- Tyrosinase 저해활성 측정은 Yagi 등의 방법[24]에 따라 측정하였다. 반응구는 67 mM sodium phosphate buffer (pH 6.
- 세포 생존율 측정은 Carmichael의 방법[4]에 따라 측정하였다. 멜라노마세포(B16F10)을 96 well plate에 5×104 cells/well이 되게 0.
성능/효과
- 6의 각 A결과에서 보는 바와 같이 노간주나무 에탄올 추출물을 농도별로 5, 25, 50 μg/ml을 처리한 B16F10에서는 tyrosinase, MITF, TRP-1, TRP-2 protein의 발현이 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
- Fig. 3∼6의 각 B결과에서 보는 것과 같이 노간주나무 에탄올 추출물을 농도별로 5, 25, 50 μg/ml을 처리한 B16F10세포에서는 tyrosinase, MITF, TRP-1, TRP-2 mRNA 발현이 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
- 노간주나무 열수 추출물의 경우 1,000 μg/ml에서 49.4%, 노간주나무 에탄올 추출물의 경우 1,000 μg/ml에서 80.0%로 노간주나무 에탄올 추출물의 저해효과가 더 높다는 것을 확인하였다.
- 본 실험에서 tyrosinase, MITF, TRP-1, TRP-2의 mRNA를 노간주나무 에탄올 추출물을 처리하여 실시간으로 분석한 결과 농도 의존적으로 mRNA 발현이 줄어듦을 확인할 수 있었다(Fig. 7∼Fig. 10).
- 3∼6의 각 B결과에서 보는 것과 같이 노간주나무 에탄올 추출물을 농도별로 5, 25, 50 μg/ml을 처리한 B16F10세포에서는 tyrosinase, MITF, TRP-1, TRP-2 mRNA 발현이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 이와 같은 결과로 노간주나무 에탄올 추출물이 B16F10 흑세포종에 대하여 멜라닌 색소 생성 억제 및 tyrosinase, MITF, TRP-1, TRP-2의 억제 효과를 가지고 있는 것으로 보임에 따라 미백 관련 기능성 화장품 소재로서의 가능성이 있음을 보여준다.
후속연구
- 이러한 결과로 미루어 보아 노간주나무 에탄올 추출물이 tyrosinase, MITF, TRP-1 및 TRP-2 단백질 발현 및 mRNA 발현량 등에서 효능이 있음을 확인할 수 있었으며, 미백개선용 화장품 소재로 응용이 가능할 것으로 판단된다. 차후 화장품 제형에서 노간주나무 추출물이 얼마나 안정하게 피부에 적용이 되는지에 대한 연구가 계속된다면 우수한 미백개선용 화장품 천연 소재가 될 것으로 생각된다.
- 이러한 결과로 미루어 보아 노간주나무 에탄올 추출물이 tyrosinase, MITF, TRP-1 및 TRP-2 단백질 발현 및 mRNA 발현량 등에서 효능이 있음을 확인할 수 있었으며, 미백개선용 화장품 소재로 응용이 가능할 것으로 판단된다. 차후 화장품 제형에서 노간주나무 추출물이 얼마나 안정하게 피부에 적용이 되는지에 대한 연구가 계속된다면 우수한 미백개선용 화장품 천연 소재가 될 것으로 생각된다.
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