[국내논문]홍화자, 향부자, 형개 추출물의 미백효과에 관한 연구 A Study on the Depigmenting Effect of Carthamus tinctorius Seed, Cyperus rotundus and Schizonepeta tenuifolia Extracts원문보기
본 연구에서는 3가지 홍화자, 향부자, 형개 추출물의 미백효과를 연구하였다. 멜라닌 생성 첫 단계인 tyrosinase 억제활성과 멜라닌 생성 억제효과를 측정한 결과, 홍화자 에탄올 추출물이 tyrosinase 활성과 B16F10 melanoma 세포의 멜라닌 생성 억제하였다. 그 결과, 홍화자 추출물은 B16F10 melanoma 세포에서 melanogenesis 따른 tyrosinase 형성 억제에 따른 멜라닌 합성 관련 인자 MITF, tyrosinase, TRP-1, TRP-2 의 발현을 억제함에 따라 홍화자 추출물의 미백효과를 확인하였다. 따라서 홍화자는 미백효과를 가진 천연 기능성 재료로서 가능성이 매우 높은 것으로 판단된다.
본 연구에서는 3가지 홍화자, 향부자, 형개 추출물의 미백효과를 연구하였다. 멜라닌 생성 첫 단계인 tyrosinase 억제활성과 멜라닌 생성 억제효과를 측정한 결과, 홍화자 에탄올 추출물이 tyrosinase 활성과 B16F10 melanoma 세포의 멜라닌 생성 억제하였다. 그 결과, 홍화자 추출물은 B16F10 melanoma 세포에서 melanogenesis 따른 tyrosinase 형성 억제에 따른 멜라닌 합성 관련 인자 MITF, tyrosinase, TRP-1, TRP-2 의 발현을 억제함에 따라 홍화자 추출물의 미백효과를 확인하였다. 따라서 홍화자는 미백효과를 가진 천연 기능성 재료로서 가능성이 매우 높은 것으로 판단된다.
The objective of the present study was to evaluate the skin depigmentation effect of the extracts of three herbs, Carthamus tinctorius seed, Cyperus rotundus and Schizonepeta tenuifolia. Their effects on tyrosinase and melanin synthesis inhibitory action were assessed. We found that the C. tinctoriu...
The objective of the present study was to evaluate the skin depigmentation effect of the extracts of three herbs, Carthamus tinctorius seed, Cyperus rotundus and Schizonepeta tenuifolia. Their effects on tyrosinase and melanin synthesis inhibitory action were assessed. We found that the C. tinctorius seed ethanol extracts reduced the tyrosinase activity and melanin formation of B16F10 melanoma cells. The C. tinctorius seed suppressed the expression in microphthalmia associated transcription factor (MITF), tyrosinase, tyrosinase related protein 1 (TRP-1), and tyrosinase related protein 2 (TRP-2) in B16F10 melanoma cells. These results show that C. tinctorius seed inhibited melanogenesis on the B16F10 melanoma cell. The underlying mechanism of C. tinctorius seed whitening activity may be the inhibition of tyrisinase, MITF, tyrosinase, TRP-1, and TRP-2 expression. The results suggested that C. tinctorius seed has considerable potential as a natural functional ingredient with a depigmentation effect.
The objective of the present study was to evaluate the skin depigmentation effect of the extracts of three herbs, Carthamus tinctorius seed, Cyperus rotundus and Schizonepeta tenuifolia. Their effects on tyrosinase and melanin synthesis inhibitory action were assessed. We found that the C. tinctorius seed ethanol extracts reduced the tyrosinase activity and melanin formation of B16F10 melanoma cells. The C. tinctorius seed suppressed the expression in microphthalmia associated transcription factor (MITF), tyrosinase, tyrosinase related protein 1 (TRP-1), and tyrosinase related protein 2 (TRP-2) in B16F10 melanoma cells. These results show that C. tinctorius seed inhibited melanogenesis on the B16F10 melanoma cell. The underlying mechanism of C. tinctorius seed whitening activity may be the inhibition of tyrisinase, MITF, tyrosinase, TRP-1, and TRP-2 expression. The results suggested that C. tinctorius seed has considerable potential as a natural functional ingredient with a depigmentation effect.
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문제 정의
그러나 경북지역에서 재배된 홍화자, 향부자, 형개의 미백효과에 대한 연구는 아직 미미한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 천연의 미백제를 찾기 위해 홍화자, 향부자, 형개 추출물 비교를 통해 tyrosinase 활성 및 melanin 형성 저해효과, melanogenesis 관련 메카니즘을 규명하고자 한다.
본 연구에서는 3가지 홍화자, 향부자, 형개 추출물의 미백효과를 연구하였다. 멜라닌 생성 첫 단계인 tyrosinase 억제활성과 멜라닌 생성 억제효과를 측정한 결과, 홍화자 에탄올 추출물이tyrosinase 활성과 B16F10 melanoma 세포의 멜라닌 생성 억제하였다.
제안 방법
DMEM 배지로 배양된 melanoma 세포를 100 mm culture dish에 2×106 cell/dish가되도록 분주하고, 24시간 배양 후 시료를 농도별로 조제하여 2 mL 첨가하고, 48시간 후에 인산완충액(pH 7.4)으로 세척한 후 원심분리하여 세포 침전물을 만들었다.
Melanoma(B16F10) 세포로 부터의 melanin 생합성 저해 측정은 Hosoi 등(26)의 방법을 변형하여 측정하였다. DMEM 배지로 배양된 melanoma 세포를 100 mm culture dish에 2×106 cell/dish가되도록 분주하고, 24시간 배양 후 시료를 농도별로 조제하여 2 mL 첨가하고, 48시간 후에 인산완충액(pH 7.
Total RNA 2 µg과 PCR primer oligonucleotide를 RT-PCR mixer와 혼합하고 RT-PCR을 실시하였다.
따라서 B16F10 세포에서 세포독성이 없으므로 50 µg/mL 농도 이하에서 melanin 생합성 저해 및 단백질 발현정도 실험을 진행하였다.
Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. 또한 Band density는 LAS4000 image analyzer(Fujifilm Life science, Tokyo, Japan)기기를 사용하여 측정하였다.
10% DMSO가 첨가된 1NNaOH 용액을 150 µL 첨가하고 60℃에서 1시간 용해하였으며 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 멜라닌 양은 합성 멜라닌을 사용하여 작성된 표준 직선에서 구하고 실험군의 멜라닌 양은 대조군의 멜라닌 양은 대조군의 멜라닌 양에 대한 백분율로 계산하여 나타내었다.
미백관련 인자 MITF, tyrosinase, TRP-1, TRP-2 발현에 미치는 영향을 보기 위하여 B16F10 melanoma 세포를 100 mm tissue culture dish에 2×104 cells/well에 되도록 분주하고 24시간 동안 배양하였다.
RT의 조건은 42℃에서 1시간 방치하여 cDNA를 제조하고 94℃에서 5분간 방치하여reverse transcriptase를 불활성화 시켰다. 이어 PCR 조건은 94℃에서 30초(denaturation), 50℃에서 30초(annealing), 72℃에서 90초(extension)의 반응을 25-35회 반복하는 것을 기본으로 target cDNA 종류에 따라 최적의 조건으로 조절하였다. 증폭된 cDNA는 1.
이에 홍화자 추출물이 melanin 합성관련 MITF, tyrosinase, TRP-1, TRP-2 mRNA 발현에 미치는 영향을 5, 10, 25, 50 µg/mL 농도에서 측정하였다(Fig. 8).
이어 PCR 조건은 94℃에서 30초(denaturation), 50℃에서 30초(annealing), 72℃에서 90초(extension)의 반응을 25-35회 반복하는 것을 기본으로 target cDNA 종류에 따라 최적의 조건으로 조절하였다. 증폭된 cDNA는 1.2% agarose gel을 사용한 전기영동으로 분리하고 LAS4000 image analyzer(Fujifilm Life science, Tokyo, Japan)으로 확인하였다.
이들 경북약용식물은 실온에서 70% 에탄올로 3회 반복 추출하였다. 추출액은 여과지를 사용하여 여과하고 rotary vacuum evaporator(Rotavapor R-205, BUCHI, Postfach, Switzerland)로 감압농축한 후 동결 건조하여 미백활성 검정에 사용하였다.
이 효소는 아미노산인 tyrosine을 DOPA로 전환시키 향후 DOPA quinone 그리고 dihydroxyindole(DHI)로부터 DOPAchrome거쳐 흑갈색의 melanin을 형성한다(27). 홍화자, 향부자, 형개 3가지 천연 추출물을 대상으로 tyrosinase 저해활성을 측정하였다(Fig. 1). 홍화자, 향부자, 형개 에탄올 추출물 1000 µg/mL에서 각각 27, 6, 23%로 홍화자 추출물이 가장 높은 저해율을 나타냈으며, 100, 500 µg/mL의 낮은 농도에서도 3가지 추출물 중 홍화자 추출물이 가장 높은 저해율을 나타냈다.
MITF는 melanin 합성 과정에서 중요한 전사 조절 인자로 tyrosinase, TRP-1, TRP-2의 전사를 촉진한다(8-10). 홍화자, 향부자, 형개 추출물의 미백효과검증을 위한 melanin 합성관련 MITF, tyrosinase, TRP-1, TRP-2 단백질 발현정도를 측정하였다(Fig. 4-7). 각 추출물을 50 µg/mL농도로 처리한 결과, 3가지 추출물 중 홍화자 추출물이 전사조절 인자인 MITF 발현을 가장 많이 감소시켰다.
이 효소의 작용으로 아미노산의 일종인 tyrosine에서 몇 단계의 합성을 거쳐, 기저층의 melanin세포 melanoma site라는 흑색소포 표면에 침착하여 검고 갈색의 작은 melanin 입자가 만들어 진다(27). 홍화자, 향부자, 형개추출물의 melanoma 세포에서의 melanin생합성 저해활성을 측정하였다(Fig. 3). 각 추출물 25, 50 µg/mL 농도에서 향부자, 형개추출물은 대조군에 비해 100% 이상으로 오히려 증가하여 melanin 생합성을 촉진시켜 미백효과가 전혀 나타나지 않았다.
대상 데이터
본 실험에서 사용한 경북 지역에서 재배된 약용식물로 3종 홍화자(C. tinctorius, seed), 향부자(C. rotundus, root), 형개(S. tenuifolia, leaf)로 홍화자는 경북영천, 향부자는 경북고령, 형개는 경북청송에서 재배된 것으로 휴먼허브(Dae-Gu, Korea)에서 구입하여 사용하였다(Table 1). 이들 경북약용식물은 실온에서 70% 에탄올로 3회 반복 추출하였다.
Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. 세포 생존율 측정에 사용된 melanoma 세포인 B16F10는 Korean Cell Line Bank(KCLB, Seoul, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 세포 생존율 측정 시약은 Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), fetal bovine serum(FBS), penicillin/streptomycin, trypsin 250, 0.
데이터처리
실험결과는 통계분석은 SAS program을 이용하여 일원분산분석법을 실시하여 Duncan’s multiple range test에 의해 시료간의 유의적 차이(p<0.05)를 검정하였다.
이론/모형
마우스 흑색 (B16F10) 세포는 Michikawa 등(24)의 방법에 따라 배양 세포에 0.25% trypsin 용액을 희석 처리한 후 세포를 분리한 다음 DMEM 배지에 10% FBS과 1% penicillin/streptomycin(100 U/mL)을 첨가하여 37℃, 5% CO2 incubator에 적응시켜 배양하였다.
세포 생존률 측정은 Carmichael 등(25)의 방법에 따라 측정하였다. Melanoma(B16F10)을 96-well plate에 5×104 cells/well이 되도록 0.
측정 Tyrosinase 저해활성 측정은 Yagi 등(23)의 방법에 따라 측정하였다. 반응구는 0.
성능/효과
각 추출물을 50 µg/mL농도로 처리한 결과, 3가지 추출물 중 홍화자 추출물이 전사조절 인자인 MITF 발현을 가장 많이 감소시켰다. Tyrosinase발현 역시 홍화자 추출물이 가장 많이 감소됨을 확인하였다. 더 나아가tyrosinase related protein으로 알려져 있는 단백질로서 5,6-dihydroxy indole-2-carboxylic acid(DHICA)를 oxidation시켜 indole-2-carboxylic acid(IQCA)를 생성하여 흑갈색을 나타나게 하는 TRP-1과 DOPA chrome을 DHICA로 이성화하는 TRP-2 의 단백질 발현정도를 측정한 결과, 앞선 실험의 결과와 동일하게 홍화자 추출물이 가장 낮게 감소하여 발현되는 것을 확인하였다.
각 추출물 25, 50 µg/mL 농도에서 향부자, 형개추출물은 대조군에 비해 100% 이상으로 오히려 증가하여 melanin 생합성을 촉진시켜 미백효과가 전혀 나타나지 않았다.
각 추출물을 50 µg/mL농도로 처리한 결과, 3가지 추출물 중 홍화자 추출물이 전사조절 인자인 MITF 발현을 가장 많이 감소시켰다.
멜라닌 생성 첫 단계인 tyrosinase 억제활성과 멜라닌 생성 억제효과를 측정한 결과, 홍화자 에탄올 추출물이tyrosinase 활성과 B16F10 melanoma 세포의 멜라닌 생성 억제하였다. 그 결과, 홍화자 추출물은 B16F10 melanoma 세포에서 melanogenesis 따른 tyrosinase 형성 억제에 따른 멜라닌 합성 관련 인자 MITF, tyrosinase, TRP-1, TRP-2 의 발현을 억제함에 따라 홍화자 추출물의 미백효과를 확인하였다. 따라서 홍화자는 미백효과를 가진 천연 기능성 재료로서 가능성이 매우 높은 것으로 판단된다.
그러나 홍화자 추출물은 농도 의존적으로 감소함을 확인하였으며, 50 µg/mL농도에서 melanin 생합성 14%의 저해 효과를 나타내었다.
Tyrosinase발현 역시 홍화자 추출물이 가장 많이 감소됨을 확인하였다. 더 나아가tyrosinase related protein으로 알려져 있는 단백질로서 5,6-dihydroxy indole-2-carboxylic acid(DHICA)를 oxidation시켜 indole-2-carboxylic acid(IQCA)를 생성하여 흑갈색을 나타나게 하는 TRP-1과 DOPA chrome을 DHICA로 이성화하는 TRP-2 의 단백질 발현정도를 측정한 결과, 앞선 실험의 결과와 동일하게 홍화자 추출물이 가장 낮게 감소하여 발현되는 것을 확인하였다. 이는 여정자 추출물(32), 백강잠 추출물(33)의 미백효과 검증기전 연구에서 보고된 바와 같이 MITF 발현 억제를 통하여 tyrosinase, TRP-1, TRP-2의 단백질 발현이 감소하는 것으로 사료된다.
또한 미백제로 사용되고 있는 arbutin의 양성대조군과 홍화자 추출물을 50 µg/mL 농도에서 비교한 결과, 홍화자 추출물이 MITF,tyrosinase, TRP-1, TRP-2의 mRNA 발현을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다.
그러나 홍화자 추출물은 농도 의존적으로 감소함을 확인하였으며, 50 µg/mL농도에서 melanin 생합성 14%의 저해 효과를 나타내었다. 또한, 9% 저해율을 나타낸 arbutin보다 더 우수한 홍화자 추출물의melanin 저해 효과를 확인하였다. 이는 유럽밤나무 꽃 MeOH, EtOH, water 추출물을 통한 melanin저해 연구에서 보고된 50 µg/mL 농도에서 melanin 생합성 저해는 9, 11, 8%로 홍화자 추출물이 높은 저해 효과를 보였고(30), 초음파 병행을 통한 병풀 EtOH, water 추출물의 melanin 생합성 저해는 200 µg/mL의 농도에서 10% 이하의 효과를 나타낸 결과와 비교하여 홍화자 추출물의 melanin 저해 활성이 우수함을 확인하였다(31).
본 연구에서는 3가지 홍화자, 향부자, 형개 추출물의 미백효과를 연구하였다. 멜라닌 생성 첫 단계인 tyrosinase 억제활성과 멜라닌 생성 억제효과를 측정한 결과, 홍화자 에탄올 추출물이tyrosinase 활성과 B16F10 melanoma 세포의 멜라닌 생성 억제하였다. 그 결과, 홍화자 추출물은 B16F10 melanoma 세포에서 melanogenesis 따른 tyrosinase 형성 억제에 따른 멜라닌 합성 관련 인자 MITF, tyrosinase, TRP-1, TRP-2 의 발현을 억제함에 따라 홍화자 추출물의 미백효과를 확인하였다.
미백효과검증을 위한 melanin 합성관련 단백질 발현정도에서 홍화자 추출물이 가장 뛰어난 활성을 가지는 것을 확인하였다. 이에 홍화자 추출물이 melanin 합성관련 MITF, tyrosinase, TRP-1, TRP-2 mRNA 발현에 미치는 영향을 5, 10, 25, 50 µg/mL 농도에서 측정하였다(Fig.
본 결과와 유사한 연구에서 신선초 추출물은 endothelin-1 mRNA와 단백질 생성량을 감소시킴으로써 melanin 생성량을 감소시킨다고 보고하였고(34), 정공피 추출물 역시 melanin 형성에 관여하는 tyrosinase, TRP-1, TRP-2 유전자 발현을 억제함으로써 미백 작용을 하는 것으로 보고 하였다(35). 이상의 결과, 홍화자 추출물은 tyrosinase 활성과 melanin 합성 억제효과를 갖고 있으며, 이러한 효과는 MITF 발현 억제를 통한 tyrosinase, TRP-1, TRP-2의 발현 감소를 규명하였다. 따라서 홍화자 추출물의 미백효과를 확인하였고, 더 나아가 천연의 미백 기능적 소재로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
홍화자, 향부자, 형개 에탄올 추출물 1000 µg/mL에서 각각 27, 6, 23%로 홍화자 추출물이 가장 높은 저해율을 나타냈으며, 100, 500 µg/mL의 낮은 농도에서도 3가지 추출물 중 홍화자 추출물이 가장 높은 저해율을 나타냈다.
홍화자, 향부자, 형개 추출물에 의한 melanoma 세포의 생존율을 확인한 결과(Fig. 2), 3가지 추출물 모두 10, 25, 50, 100µg/mL 농도에서 100% 이상의 세포 생존율을 확인하였다.
후속연구
이상의 결과, 홍화자 추출물은 tyrosinase 활성과 melanin 합성 억제효과를 갖고 있으며, 이러한 효과는 MITF 발현 억제를 통한 tyrosinase, TRP-1, TRP-2의 발현 감소를 규명하였다. 따라서 홍화자 추출물의 미백효과를 확인하였고, 더 나아가 천연의 미백 기능적 소재로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
미백제로 사용되는 arbutin은 무엇과 경쟁적으로 작용하는 저해제인가?
현재 미백제로 가장 많이 사용되는 arbutin은 L-tyrosine과 경쟁적으로 작용하는 저해제이며(11), arbutin, ascorbic acid는 tyrosinase 활성 부위의 copper를 chelating하여 tyrosine에서 DOPA로 그리고 DOPA에서 DOPA quinone으로 진행되는 과정을 저해한다(12). 그러나 현재 의학계나 화장품업계에서는 피부 안전성, 제형 안정성 등의 문제로 제한된 양만 사용되고 있다(13,14).
향부자의 약리 작용은 무엇인가?
성미는 맵고 약간 쓰며, 달고 따뜻한 성질을 가지고 있으며, 주로 작용하는 장기는 간장이다. 약리를 보면 자궁 억제작용을 나타내며, 항염증, 진통작용 및 일정한 해열작용과 중추신경 억제작용이 있다. 강심작용과 혈압강하작용이 있으며, 이질균과 피부진균에도 억제효과를 나타낸다(19-21).
Melanin 합성 경로는?
최근에는 tyrosinase 뿐만 아니라 microphthalmia-associatedtranscription factor(MITF), tyrosinase related protein-1(TRP-1), tyrosinase related protein-2(TRP-2) 등과 같은 단백질을 이용하여 melanin합성 억제에 대한 연구가 이루어지고 있다(7). Melanin은 몇 가지 세포내 신호전달 기전을 통하여 합성되는데, 첫째 cyclic adenosine monophosphate(cAMP)/PKA(protein kinase A)경로, 둘째 nitric oxide에 의한 cyclic guanosine monophosphate(cGMP) 경로, 셋째 protein kinase C(PKC)의 경로, 넷째 p38 MAP kinase경로 등이 알려져 있다. 그 중 cAMP/PKA경로가 melanin 합성의 주요 경로로서 UV에 피부가 노출되었을 때 melanin 세포의 cAMP가 증가되고 하류 신호전달 물질인 PKA를 활성화시키며, cAMP response element binding protein(CREB)을 거쳐 MITF의 발현을 증가시킨다(8,9).
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