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문제 정의
- 또한 공업용으로서 즉, 바이오디젤을 생산할 때 이들 포화지방산들은 저온 필터 막힘의 원인이 된다. 따라서 본 연구에서는 돈지의 이러한 문제점을 개선하기 위하여 수행되었다.
- 분획(fractionation)은 유지를 결정생성온도의 차에 의하여 liquid와 solid 층으로 나누어 획득하는 방법으로써 이와 같은 분획방법으로는 dry fractionation, detergent fractionation과 solvent fractionation이 알려져 있다(Deffense, 1985). 본 연구에서는 solvent fractionation 방법을 이용하여 동물성 지방인 돈지(lard)를 원료로 하여 다양한 유지식품 및 산업적 이용(저포화 바이오디젤의 생성 등)이 용이하도록 포화도를 낮추고자 하였다. 포화도를 낮추기 위한 분획실험을 수행하기 위하여 용제로서 acetone과 hexane을 사용하였으며, 분별온도(-15, 5, 10, 15℃)및 분별시간(3, 6, 12 hr), 용매비율(1:1, 1:3, 1:5, 1:10, lard : solvent, w/v) 조건을 달리하여 수행하였다.
- 포화도를 낮추기 위한 분획실험을 수행하기 위하여 용제로서 acetone과 hexane을 사용하였으며, 분별온도(-15, 5, 10, 15℃)및 분별시간(3, 6, 12 hr), 용매비율(1:1, 1:3, 1:5, 1:10, lard : solvent, w/v) 조건을 달리하여 수행하였다. 이로서 분별용매, 용매비율, 분별온도, 분별시간에 따른 돈지의 포화지방산 감소 정도를 살펴보았다.
가설 설정
- 1)Solvent ratio for solvent fractionation was 1:5 (lard : solvent, w/v).
- 2)Values with different letters in the same column in each solvent are significantly different (p<0.05).
제안 방법
- 2 g의 돈지와 일정 비율(1:1, 1:3, 1:5, 1:10, w/v)의 acetone 또는 hexane을 각각 취하여 50 mL의 vial에 넣고 vortex 하였다. 이후 vial은 각 온도(-15, 5, 10, 15℃)가설정된 incubator에 넣고, 계획된 fractionation 시간(3, 6, 24 hr)에 따라 방치하였다.
- Injector 온도는 250℃, detector 온도는 260℃로 각각 설정하였고, split ratio는 50:1로써 사용된 carrier gas는 nitrogen으로 1 mL/min을 유지시켰으며, 시료 1 μL을 주입하여 지방산 메틸에스테르 분석을 실행하였다(Moon et al., 2011).
- 얻어진 크로마토그램에서 partition number(PN)를 이용하여 피크를 구분하였다. TAG 조성 분석을 위한 C18 column 상에서 PN은 불포화지방산(이중결합 함유)이 함유될수록 PN이 작아지고, 지방산의 탄소수가 길어질수록 PN이 높아지는 원리를 이용하여 아래와 같이 구하였다.
- 각 조건에서 분별된 분획물의 triacylglycerol(TAG)의 조성 변화를 알아보기 위해서 reversed-phase high performance liquid chromatography(RP-HPLC) 분석을 실행하였다. 사용된 HPLC system은 SP930D dual pump(Young-lin, Anyang, Korea)와 ZAM 3000 evaporative light scattering detector(ELSD) 및 auto sampler(Marathon, Young-lin Instrument Co.
- 돈지에 함유되어 있는 포화지방산의 포화도를 감소시키기 위하여, acetone과 hexane을 이용한 용제분별에 따른 포화도 저감화 정도를 비교하였다. 분별조건은 -15℃, 5℃, 10℃ 및 15℃의 분별온도와 1:1, 1:3, 1:5 및 1:10의 돈지와 사용 용매의 비율(w/v)로 분별시간은 3, 6 및 24시간이었다.
- 본 실험에서는 50 mL의 vial을 이용하여 3, 6, 24 분별시간과 -15, 5, 10, 15℃의 분별온도에 변화를 주면서acetone과 hexane의 용매의 비율을 돈지 2 g에 대하여(1:1, 1:3, 1:5, 1:10, w/v) 분별용매비율에 차이를 준 후, 분별 후의 liquid와 solid 분획물을 wt%로 Table 1에 나타내었다.
- , 2011). 얻어진 크로마토그램에서 partition number(PN)를 이용하여 피크를 구분하였다. TAG 조성 분석을 위한 C18 column 상에서 PN은 불포화지방산(이중결합 함유)이 함유될수록 PN이 작아지고, 지방산의 탄소수가 길어질수록 PN이 높아지는 원리를 이용하여 아래와 같이 구하였다.
- 이때 획득되는 liquid층 분획물의 양(yield) 및 ∑SFA(포화지방산의 총합)와 triacylglycerol(TAG) 조성을 비교하였다.
- 이후 fractionation된 시료의 liquid와 solid 층으로 분획물을 나누어 분리하였다. 이를 위하여 사용된 깔때기를 예비냉각을 하였고 분리작업은 fractionation이 이루어진 incubator에서 수행하였으며 모든 실험을 2회 반복하였다. 분리된 liquid와 solid 층의 분획물은 다시 50 mL vial에 보관하였고, 획득된 liquid층 분획물은 질소가스를 이용하여 사용된 용매를 제거하였다.
- 5 mL을 넣고 vortex 한 후, 100℃에서 2분 동안 반응하고 다시 찬물에 냉각하였다. 이후 2 mL의 iso-octane과 포화 NaCl용액을 1 mL 넣고 1분 동안 vortex를 한 후 원심분리기로 1500 rpm에서 3분 동안 수행하여 층 분리 후 얻어진 상층을 sodium sulfate anhydrous column으로 수분을 제거하고 분석하였다. 분석 장치는 flame ionization detector가 장착된 gas chromatograph(Hewlett-Packard 6890 series, Avondale, PA, USA)를 사용하였다.
- 지방산 조성을 분석하기 위하여 시료를 methylation 한 후, gas chromatograph(GC) 분석을 실행하였다. 시험관에 샘플(대략 20 mg)을 취한 후 0.
- 본 연구에서는 solvent fractionation 방법을 이용하여 동물성 지방인 돈지(lard)를 원료로 하여 다양한 유지식품 및 산업적 이용(저포화 바이오디젤의 생성 등)이 용이하도록 포화도를 낮추고자 하였다. 포화도를 낮추기 위한 분획실험을 수행하기 위하여 용제로서 acetone과 hexane을 사용하였으며, 분별온도(-15, 5, 10, 15℃)및 분별시간(3, 6, 12 hr), 용매비율(1:1, 1:3, 1:5, 1:10, lard : solvent, w/v) 조건을 달리하여 수행하였다. 이로서 분별용매, 용매비율, 분별온도, 분별시간에 따른 돈지의 포화지방산 감소 정도를 살펴보았다.
대상 데이터
- 18 wt%로 solid층 분획물을 획득하였다. 또한, hexane을 이용할 경우, -15℃에서 24 시간동안 1:5의 용매비율로 분획하였을 때 19.91 wt%의 liquid층 분획물과 80.09 wt%의 solid층 분획물을 획득하였다. 이때 분획된 solid층에는 가장 많은 포화지방산을 함유한 TAG들이 분별되었다.
- 식용돈지는 축산물의 가공기준 및 성분규격에서 원료돈지와 식용돈지로 구분하고 있다. 본 실험에 사용된 동물성 유지는 돈지(lard)로써 이의 지방산 조성은 약 1.5% myristic acid(C14:0), 26.0% palmitic acid(C16:0), 2.2%, palmitoleic acid (C16:1), 12.1% stearic acid(C18:0), 44.7% oleic acid(C18:1)와 12.7% linoleic acid(C18:2)로써 약 39.6%의 총 포화지방산과 59.6%의 총 불포화지방산으로 구성 되어있다. 이외에 소량의 여러 가지 지방산을 함유한다.
- 본 실험에서 사용된 시료는 시중에 유통되고 있는 D사(Dongnam Co., Ltd., Geonggi Do, Korea)의 돈지(정제돈지)로 2010년 7월에 구입하여 -15℃에 보관하였다. 구입당시 산가(acid value)는 0.
- 각 조건에서 분별된 분획물의 triacylglycerol(TAG)의 조성 변화를 알아보기 위해서 reversed-phase high performance liquid chromatography(RP-HPLC) 분석을 실행하였다. 사용된 HPLC system은 SP930D dual pump(Young-lin, Anyang, Korea)와 ZAM 3000 evaporative light scattering detector(ELSD) 및 auto sampler(Marathon, Young-lin Instrument Co., Ltd., Emmen, Netherlands)로 구성되었으며, ELSD에 사용되는 주입 기체의 압력은 1.7 bar로 설정하였다. Column은 Nova-Pak C18 60Å 4 μm(3.
데이터처리
- 실험 결과는 평균±표준편차로 나타내었고, 각 그룹간의 유의성은 SAS(Statistical Analysis System, version 8.01) program의 Duncan's multiple range test를 실시하여 p< 0.05 수준에서 유의성을 검정하였다.
- 획득한 liquid층 분획물에서 각 조건별로 포화지방산들(myristic acid, C14:0; palmitic acid, C16:0; stearic acid, C18:0)의 함량변화를 비교하기 위하여 용매별로 각각 통계처리(Duncan test)를 하여 유의적인 차이를 비교하였다. Table 3에 나타난 바와 같이 3시간 동안 -15℃에서 돈지와 acetone의 비율을 1:5과 1:10에서 분획을 한 결과, 분획을 통하여 얻어진 liquid층 분획물의 조성지방산 중에서 포화지방산인 C14:0와 C16:0은 2.
성능/효과
- 10℃에서 용매비율이 1:1 일 때, hexane을 사용하였을 경우 3시간 후에서 31.11 wt%, 6시간 후에서는 30.90 wt%, 그리고 24시간 후에서 4.11 wt%의 liquid층 분획물을 얻어 hexane을 사용할 경우 분별시간이 길어질수록 획득되는 liquid층 분획물의 wt%는 큰 차이를 보였다.
- PN=46의 범위에는 OOL(2.83 area%), LPO(1.52 area%), LPP(7.76 area%)가 존재하였으며 PN=48의 TAG 조성은 OPO(22.08 area%)와 SOL(0.31 area%)이 대부분을 차지하였다.
- Hexane을 이용하여 -15℃에서 6시간 동안 1:5와 1:10의 비율로 분획한 결과 ∑SFA은33.88～35.61%의 범위를 보였다.
- 반면, acetone 분별을 통해 얻어진 solid층분획물은 PN=50에서 가장 많은 TAG가 존재하였다. PN= 50의 범위에는 총 59.48 area%의 TAG가 존재하였는데 대부분 SOO(57.50 area%)와 SPO(1.98 area%)로 나타났다. PN=46의 범위에는 OOL(2.
- 돈지와 acetone이 1:5의 비율로 5℃에서 24시간 동안 분획을 통하여 얻은 liquid층 분획물의 TAG의 조성도 주로 PN=48에 위치하였다. PN=48의 범위 안에 있는 TAG는 총 54.43 area%를 보이면서, OPO가 50.80 area%로 가장 많이 존재하고 있었고 SOL은 3.63 area%로 OPO에 비해 비교적 적은 area%를 나타냈다. 한편, liquid층 분획물의 PN=46의 범위에서는 OOL이 4.
- 이때 분획된 solid층에는 가장 많은 포화지방산을 함유한 TAG들이 분별되었다. Reversed-phase HPLC를 이용하여 TAG 조성을 분석한 결과, 분별 전 돈지의 TAG 조성은 PN(partition number)=46, PN=48, PN=50의 범위로 주로 분리되는 경향을 나타내었다. TAG의 조성에서 포화도의 차이는 acetone을 이용한 경우, 돈지에서 획득된 liquid층 분획물의 TAG(PN=50)에서 hexane의 경우보다 큰 감소를 나타내는 경향을 보였다.
- Reversed-phase HPLC를 이용하여 TAG 조성을 분석한 결과, 분별 전 돈지의 TAG 조성은 PN(partition number)=46, PN=48, PN=50의 범위로 주로 분리되는 경향을 나타내었다. TAG의 조성에서 포화도의 차이는 acetone을 이용한 경우, 돈지에서 획득된 liquid층 분획물의 TAG(PN=50)에서 hexane의 경우보다 큰 감소를 나타내는 경향을 보였다. 이는 palmitic acid와 stearic acid 등과 같은 포화지방산의 분별은 hexane보다는 acetone을 이용하는 것이 보다 효과적임을 나타낸다.
- Table 3에 나타난 바와 같이 3시간 동안 -15℃에서 돈지와 acetone의 비율을 1:5과 1:10에서 분획을 한 결과, 분획을 통하여 얻어진 liquid층 분획물의 조성지방산 중에서 포화지방산인 C14:0와 C16:0은 2.10～2.29 및 24.04～25.23%의 범위를 보이면서 서로 유의적 차이를 보였으나(p<0.05), C18:0은 각각 8.54와 7.98%를 보이며 서로 유의적 차이를 보이지 않았다(p＞0.05).
- 돈지와 아세톤의 비율을 달리해 가면서 6시간 동안 분별온도를 -15℃에서 분획을 하였을 경우, 1:3의 비율에서의 C18:0은 분별 전 돈지에 비하여 약 2.59% 감소하였으며, 1:5 비율에서는 7.00% 감소, 그리고 1:10 비율에서는 5.76% 감소하여 각각 9.55%, 5.10%, 6.34%로 나타났으며, 이때 ∑SFA는 서로 유의적 차이를 나타내며 각각 34.11%, 27.81%, 그리고 29.42%이었다(p<0.05).
- 또한, acetone을 이용한 경우 hexane보다 liquid층 분획물의 ∑SFA가 더 감소되었음을 알 수있었다. 따라서 acetone이 hexane보다 palmitic acid와 stearic acid 등과 같은 포화지방산을 함유한 TAG를 효율적으로 분별할 수 있음을 확인하였다.
- 따라서 돈지와 acetone의 비율을 1:5 비율로 24시간 동안 5℃에서 분획하여 얻어진 liquid와 solid 층 분획물의 TAG의 조성 변화의 경우, liquid층 분획물에서 PN=46은 돈지에 비하여 9.80 area%가 증가하였고, solid층 분획물은 12.24 area% 감소하였다.
- 또한 1:1 및 1:3의 비율에서 분획이 이루어지지 않았던 -15℃에서 hexane의 비율을 높여 1:5 비율로 3시간 분획 시에는 25.92 wt%의 liquid층 분획물이 획득되었고, 분획 온도가 높아짐에 따라 획득되는 liquid층 분획물도 증가하였다.
- 또한 5에서 15℃의 범위에서 분획된 liquid층 분획물의 ∑SFA는 36.14～41.8%의 범위를 보이면서 분별온도가 높아질수록 획득되는 liquid층 분획물의 ∑SFA가 전반적으로 많아지는 추세를 보였다.
- 35 area%로 나타났다. 또한 PN=50의 범위에서는 주로 SOO와 SPO의 TAG 조성을 보였으며 SOO는 1.84, 그리고 SPO는 18.10 area%로써 총 19.94 area% 나타내었다. 돈지와 acetone이 1:5의 비율로 5℃에서 24시간 동안 분획을 통하여 얻은 liquid층 분획물의 TAG의 조성도 주로 PN=48에 위치하였다.
- 이는 melting point가 높은palmitic 및 stearic acid 등의 포화지방산들로 주로 구성된 SPO와 같은 TAG들이 주로 solid층 분획물에 존재하고 있기 때문이다. 또한 acetone을 분별에 이용하였을 때가 hexane을 이용하였을 경우보다 더욱 효과적으로 PN= 50에 위치한 포화도가 높은 TAG들을 분별하였음을 알 수 있었다.
- 31 area%)이 대부분을 차지하였다. 또한 hexane 분별을 이용하여 얻어진 solid층 분획물의 PN=50에서 SOO(29.11 area%)와 SPO(28.92 area%)를 나타내었고 PN=46에 위치한 OOL은 0.85%, LPO은 7.09%, 그리고 LPP은 1.61 area%를 나타내었다. PN=48의 TAG는 총 31.
- 이는 온도가 점차적으로 낮아짐에 따라 melting point가 높은 지방산으로 구성된 triacylglycerol들이 더욱 분별되어 solid층 분획물 양이 증가된 것으로 사료된다. 또한, -15℃에서 acetone과 hexane을 이용하고 각각 1:3, 1:5 및 1:10의 비율을 이용하여 분획하였을 때, 용매의 비율이 증가함에 따라 liquid층 분획물의 양은 증가하지만, 총 포화지방산의 함량 변화는 유의적인 차이가 없는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 lard를 가지고 -38℃에서 용매(아세톤)비율을 각각 1:5, 1:10, 1:20으로 수행하여, 포화도는 유의적 차이가 없었지만, liquid의 함량은 용매의 비율이 증가함에 따라 증가한다는 보고와 유사하였다(Lee et al.
- 또한, 분별온도가 낮을수록 ∑SFA의감소가 높아지는 경향을 나타내었다.
- 반면, 1:5의 비율로 acetone의 사용량을 증가시켰을 경우 3시간 동안 -15℃에서 분획을 한 liquid층 분획물의 wt%는 1:3의 비율로 분별하였을 때보다 약 5.83 wt% 증가하였으며, 5℃의 경우에는 4.89 wt%, 10℃에서는 10.66 wt% 각각 증가하였다.
- 11 wt%의 liquid층 분획물을 얻어 hexane을 사용할 경우 분별시간이 길어질수록 획득되는 liquid층 분획물의 wt%는 큰 차이를 보였다. 반면, acetone을 사용하였을 때 solid층 분획물은 분별을 수행하는 시간이 짧을수록 많은 양이 회수되었는데, 3시간 후 86.66 wt%, 6시간 후에는 79.47 wt%, 그리고 24시간 후에는 79.40 wt%로 점차 회수량이 감소하는 경향을 보였다. 한편, hexane을 이용하여 분획된 solid층 분획물 무게는 3, 6, 24시간 후에 각각 68.
- 90 area%를 차지하였다. 반면, 돈지와 hexane을 1:5의 비율로 5℃에서 분획하여 얻어진 liquid층 분획물의 TAG 조성은 OOL(2.85 area%), LPO(18.91 area%), 그리고 LPP(4.28 area%)가 PN=46 범위에 존재하면서 총 26.04 area%를 보였으며, PN=50에 위치한 TAG의 경우 SOO(2.38 area%)와 SPO(16.63 area%)가 주로 존재하며 총 19.01 area%를 나타내었다. PN=48에서는 acetone으로 분별한 결과와 유사하게 OPO(41.
- 분별된 돈지 시료들의 triacylglycerol(TAG) 조성을 reversed-phase HPLC를 이용하여 분석하여 Figure 1에 나타내었다. 분별 전 돈지의 TAG 조성은 PN(partition number)= 46(OOL, LPO, LPP), PN 48(OPO, SOL), PN=50(SOO, SPO)의 범위에서 대부분 분리되는 경향을 나타내었다. Table 2에서 보여주는 바와 같이 돈지의 주요 TAG 조성은 1: OOL, 2: LPO, 3: LPP, 4: OPO, 5: SOL, 6: SOO, 7: SPO(O=oleic acid, P=palmitic acid, S=stearic acid, L=linoleic acid) 등으로 이루어져 있었다(Marikkar et al.
- 사용된 용매의 비율을 높여 1:10으로 분별하였을 경우, acetone을 이용한 3시간 동안의 분획 시에 -15와 15℃ 사이에 얻어진 liquid층 분획물은 각각 51.81 wt%와 92.52 wt%로써 획득된 liquid층 분획물이 증가하였으며, 6시간과 24시간 동안의 분획과정에서도 분별온도가 -15℃에서 15℃로 높아질 경우 모든 용매의 비율에서 얻어지는 liquid층 분획물의 양은 증가하는 경향을 보이면서 solid층 분획물의 무게는 감소하였다.
- 61%의 범위를 보였다. 전반적으로 acetone을이용한 15℃에서의 분획과 hexane을 이용한 10℃와 15℃에서의 분획은 사용되는 용매의 비율에 관계없이 포화도를 저 감화하는데 큰 영향을 주지 못하는 것으로 나타났다. Acetone과 hexane을 이용하여 24시간 동안 분획하여 얻어진 liquid층 분획물의 지방산 조성을 Table 5에 나타내었는데 3시간과 6시간 분획 결과 유사하였고, ∑SFA은 아세톤을 1:3 비율을 가지고 -15℃에서 분획을 했을 경우 27.
- 84%의 ∑SFA을 보였다. 전체적으로 낮은 온도인 -15℃에서 분획하였을때에 다른 온도에서보다 포화도 저 감화에 효과적이었고, 이때 사용용매의 비율과 분별시간은 분별온도보다는 큰 영향을 미치지 않았다. 또한, 분별온도가 낮을수록 ∑SFA의감소가 높아지는 경향을 나타내었다.
- 70 area%이었고, 따라서 PN=48에 가장 많은 TAG들이 위치하였다. 한편, PN=46의 범위에서는 OOL이 2.65, SPO이 17.73, 그리고 LPP가 3.97 area%로 각각 나타났고, 이들은 총 24.35 area%로 나타났다. 또한 PN=50의 범위에서는 주로 SOO와 SPO의 TAG 조성을 보였으며 SOO는 1.
- 24 area% 감소하였다. 한편, acetone을 이용한 분획 후 liquid층 분획물을 구성하는 PN=50의 SPO는 돈지에 비하여 15.17 area% 감소하였으며, hexane 분획 후에는 SPO가 1.47 area %가 감소하였다. 이는 melting point가 높은palmitic 및 stearic acid 등의 포화지방산들로 주로 구성된 SPO와 같은 TAG들이 주로 solid층 분획물에 존재하고 있기 때문이다.
- 40 wt%로 점차 회수량이 감소하는 경향을 보였다. 한편, hexane을 이용하여 분획된 solid층 분획물 무게는 3, 6, 24시간 후에 각각 68.89, 69.10 및 95.89 wt%를 나타내며 acetone보다는 비교적 높은 경향을 나타내었다.
- 한편, hexane을 이용하여 분획한 결과 5℃에서 1:1 비율로 분획 시에 liquid층 분획물에서 C18:0이 9.39%를 보이면서 가장 낮은 함량을 보였으며, 1:10 비율로 분획할 경우 liquid층 분획물에 10.64%의 C18:0을 보였다.
- 63 area%로 OPO에 비해 비교적 적은 area%를 나타냈다. 한편, liquid층 분획물의 PN=46의 범위에서는 OOL이 4.26, LPO은 22.93, 그리고 LPP은 6.96 area%로써 총 34.15 area%를 나타내었으며, PN=50의 TAG 조성은 SOO(3.97 area%)와 SPO(2.93 area%)로써 총 6.90 area%를 차지하였다. 반면, 돈지와 hexane을 1:5의 비율로 5℃에서 분획하여 얻어진 liquid층 분획물의 TAG 조성은 OOL(2.
후속연구
- 이로서 심혈관질환과 밀접한 관련이 있는 포화지방산의 함량을 줄인 lard는 다양한 식용유지 및 식품의 유지첨가제로 사용될 수 있으며, 또는 이를 이용한 바이오디젤을 생성할 경우, 동물성 바이오디젤의 문제점인 저온필터막힘점을 개선할 수 있을 것으로 사료된다.
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