[논문]Cellular system에서의 깻잎의 ONOO-에 의한 산화적 스트레스 개선 및 항노화 효과

김현영; 황보라; 조은주

doi:10.7744/cnujas.2012.39.4.467

[국내논문] Cellular system에서의 깻잎의 ONOO-에 의한 산화적 스트레스 개선 및 항노화 효과
The protective effect of Perilla frutescens from ONOO--induced oxidative stress and antiaging effect under cellular system 원문보기

농업과학연구 = CNU Journal of agricultural science, v.39 no.4, 2012년, pp.467 - 471

김현영 (경남과학기술대학교 식품과학부) , 황보라 (부산대학교 식품영양학과 및 노인생활환경연구) , (부산대학교 식품영양학과 및 노인생활환경연구) , 조은주 (부산대학교 식품영양학과 및 노인생활환경연구)

Abstract ▼ AI-Helper

In this study, we investigated the antioxidative and antiaging activity of Perilla frutescens using LLC-$PK_1$ porcine renal epithelial cell and WI-38 human diploid fibroblast cell. The extract from Perilla frutescens showed strong protective effect against nitric oxide (NO) and superoxide ($O_2{^-}$)-induced oxidative stress generated by sodium nitroprusside (SNP) and pyrogallol, respectively. The result showed that P. frutescens increased the cell viability and showed scavenging activity of NO and $O_2{^-}$. In addition, the extract of P. frutescens exerted the protective effect against peroxynitrite ($ONOO^-$) induced by 3-morpholinosydnonimine. It suggests that P. frutescens would have the protective role against $ONOO^-$ itself and its precursors, NO and $O_2{^-}$. Furthermore, the aging model of hydrogen peroxide ($H_2O_2$)-treated WI-38 human diploid fibroblast was employed to investigate the anti-aging effect of P. frutescens. $H_2O_2$-treated WI-38 cells showed the loss of cell viability, however before-treatment with P. frutescens to WI-38 cells under premature senescence could delay the cellular aging process. The present study suggests the antioxidative and antiaging potential against free radical-induced oxidative damage of P. frutescens.

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문제 정의

, 2001) 등이 있으나, ONOO^-에 의한 산화적 스트레스 개선 및 항노화 효과에 대한 연구는 전무한 실정이다. 따라서, 본 연구에서는 깻잎의 ONOO^- 및 이의 전구체에 의한 산화적스트레스 개선효과 및 항노화 효과를 세포 모델을 이용하여 검토하였다.
또한 SNP는 말초 혈관확장제로 임상에서 고혈압성 응급상태의 치료제로도 사용된다. 본 연구에서는 활성 질소에 의한 산화적 스트레스 개선 효과를 살펴보기 위하여 LLC-PK₁ cell에 SNP 처리로 NO를 유발시켜서 산화적 스트레스를 가한 후 이에 대한 깻잎의 보호 효과를 세포 생존율로 확인하였다. SNP 를 처리한 대조군은 정상군에 비해 세포 생존율이 30% 정도 감소하여 산화적 스트레스에 의한 세포 손상을 확인할 수 있었다.
본 연구에서는 깻잎의 MeOH 추출물을 LLC-PK₁ cell과 WI-38 cell을 이용하여 ONOO^- 및 이의 전구체인 NO와 O₂^-에 의한 산화적 스트레스 개선 및 항노화 효과를 살펴보 았다. 깻잎추출물은 LLC-PK1 cell을 이용한 세포 실험 모델에서 ONOO^-에 의한 산화적 스트레스에 대한 보호 효과는 물론 이의 전구체인 NO와 O₂^-에 의해 유발된 산화적 스트레스에 대해서도 우수한 보호효과를 보여 세포 생존율을 유의적으로 증가시켰다.

제안 방법

시료는 동결건조 한 다음 분말화하여, 시료 중량의 20배 MeOH로 12시간 동안 추출하였고 동일한 과정을 3번 반복 하여 얻어진 추출물을 모은 후 회전식 진공 농축기를 이용 하여 농축하였다. 깻잎의 MeOH 추출물의 수율은 23.
incubator에서 배양하였다. 배양된 세포는 일주일에 2~3회 배지를 교환하고 배양 6~7일 경 phosphate buffered saline(PBS)으로 1차 세척한 후 0.05% trypsin-0.02% EDTA로 부착된 세포를 분리하여 원심 분리해서 집적된 세포를 배지에 넣고 피펫으로 세포가 골고루 분산되도록 잘 혼합하여 4~5일마다 계대 배양하면서 실험에 사용하였다. 계대 배양 시 각각의 계대수를 기록하여 계대수가 10회 이상일 때는 새로운 세포를 배양하여 실험하였다.
incubator에서 배양하였다. 배양된 세포는 1~2일에 한번 배지를 교환하고 flask 내부에 세포가 가득 찬 상태가 되었을 때 PBS로 1차 세척한 후 0.05% trypsin-0.02% EDTA 용액으로 부착된 세포를 분리하여 원심분리해서 집적된 세포를 피펫으로 세포가 골고루 분산되도록 잘 혼합하여 6~7일 마다 계대 배양하면서 실험에 사용하였다.
LLC-PK1 세포가 flask 내부에 가득 찬 상태가 되면 96-well plate에 well당 1×104 cells/mL로 분주하여 2시간 배양한 후 산화적 스트레스를 유발하기 위하여 NO, O2-와 ONOO- generator인 SNP(0.6 mM), pyrogallol(0.5 mM), SIN-1(1 mM)을 각각 첨가하여 24시간 배양하였다.
먼저 시료를 농도별로 24시간 처리한 후 산화적 스트레스에 의한 세포 노화를 유도하기 위해 H2O2(300 μM)를 1시간 처리한 후, 세포 생존율을 MTT assay로 측정하였다(Mosmann, 1983).
어린아이의 폐에서 유래한 WI-38 cell에 깻잎 추출물 및 분획물을 전 처리한 후 H2O2 300 μM로 급성 산화적 스트레스에 대한 조기노화를 유도하여 세포 생존율을 측정함으로써 깻잎 추출물 및 분획물이 노화 예방 효과를 가지는 지에 대해 검토하였다.
, 1993). 본 연구에서는 LLC-PK₁ cell에 SIN-1을 처리하여 ONOO에 의한 산화적 스트레스를 유발시킨 후 이에 대한 깻잎의 보호 효과를 세포 생존율을 통해 살펴보았다(Fig. 3). SIN-1만을 처리한 대조군은 세포 손상으로 생존율이 49.

대상 데이터

본 실험에 사용한 들깨(Perilla Frutescens var. japonica Herba)의 잎은 밀양지역에서 생산된 남천 들깻잎을 사용하였다. LLC-PK₁(porcine renal epithelial cell)과 WI-38 cell(human normal fibroblast cell, population doubling level(PDL) 23, PDL = last PDL + log2(collected cell number/seeded cell number))은 ATCC(Solon, Ohio, USA) 에서, 배양을 위한 Dulbecco's modified eagal medium (DMEM)과 fetal bovine serum(FBS)은 Invitrogen Co.
시료는 동결건조 한 다음 분말화하여, 시료 중량의 20배 MeOH로 12시간 동안 추출하였고 동일한 과정을 3번 반복 하여 얻어진 추출물을 모은 후 회전식 진공 농축기를 이용 하여 농축하였다. 깻잎의 MeOH 추출물의 수율은 23.43%이고, -80℃ 냉동고에 보관하며 실험에 사용하였다.

데이터처리

실험 결과는 평균 ± 표준편차로 나타내었고, 대조군과 실험군의 실험 결과는 one way ANOVA로 검증한 후 Duncan's multiple range test로 유의수준 0.05에서 유의성을 검증하였다.
a-eMeans with the different letters on the bar graph are significantly different (p<0.05) by Duncan’s multiple range test.
a-cMeans with the different letters on the bar graph are significantly different (p<0.05) by Duncan’s multiple range test.
a-dMeans with the different letters on the bar graph are significantly different (p<0.05) by Duncan’s multiple range test.

성능/효과

본 연구에서는 활성 질소에 의한 산화적 스트레스 개선 효과를 살펴보기 위하여 LLC-PK₁ cell에 SNP 처리로 NO를 유발시켜서 산화적 스트레스를 가한 후 이에 대한 깻잎의 보호 효과를 세포 생존율로 확인하였다. SNP 를 처리한 대조군은 정상군에 비해 세포 생존율이 30% 정도 감소하여 산화적 스트레스에 의한 세포 손상을 확인할 수 있었다. 반면 깻잎을 처리한 군에 있어서는 세포 생존율이 농도 의존적으로 상승하였고 최종농도에서는 75% 이상의 세포생존율을 확인하였다(Fig.
SNP 를 처리한 대조군은 정상군에 비해 세포 생존율이 30% 정도 감소하여 산화적 스트레스에 의한 세포 손상을 확인할 수 있었다. 반면 깻잎을 처리한 군에 있어서는 세포 생존율이 농도 의존적으로 상승하였고 최종농도에서는 75% 이상의 세포생존율을 확인하였다(Fig. 1). 이는 깻잎이 NO 소거를 통해 산화적 스트레스 개선 효과를 가지는 것을 알 수 있다.
반면 깻잎추출물을 전 처리한 군에서 농도 의존적으로 세포 생존율이 상승한 것을 확인할 수 있었으며, 특히 깻잎의 최종농도인 100 μg/mL에서는 85%의 세포 생존율을 보였다(Fig. 4).
SIN-1만을 처리한 대조군은 세포 손상으로 생존율이 49.2%로 감소한 반면 깻잎을 농도별로 처리한 후 생존율이 농도 의존적으로 증가하여 100 μg/mL 처리 시 68.9%로 나타나 ONOO-에 대한 직접적인 소거능을 통해 산화적 스트레스 개선 효과를 보이는 것으로 사료된다.
깻잎추출물의 효과를 살펴보면 WI-38 cell에 H₂O₂만을 처리한 대조군의 경우 세포 생존율이 60%로 정상군에 비해 세포노화가 유도되었음을 확인 할 수 있었다. 반면 깻잎추출물을 전 처리한 군에서 농도 의존적으로 세포 생존율이 상승한 것을 확인할 수 있었으며, 특히 깻잎의 최종농도인 100 μg/mL에서는 85%의 세포 생존율을 보였다(Fig.
에 의한 산화적 스트레스 개선 및 항노화 효과를 살펴보 았다. 깻잎추출물은 LLC-PK1 cell을 이용한 세포 실험 모델에서 ONOO^-에 의한 산화적 스트레스에 대한 보호 효과는 물론 이의 전구체인 NO와 O₂^-에 의해 유발된 산화적 스트레스에 대해서도 우수한 보호효과를 보여 세포 생존율을 유의적으로 증가시켰다. 또한 WI-38 cell을 이용하여 H₂O₂로 유도된 조기노화에 의한 항노화 효과를 살펴본 결과에서도, 깻잎의 추출물은 감소된 세포생존율을 유의적으로 증가시켜 노화를 지연시키는 항노화 효과가 있음을 확인하였다.
깻잎추출물은 LLC-PK1 cell을 이용한 세포 실험 모델에서 ONOO^-에 의한 산화적 스트레스에 대한 보호 효과는 물론 이의 전구체인 NO와 O₂^-에 의해 유발된 산화적 스트레스에 대해서도 우수한 보호효과를 보여 세포 생존율을 유의적으로 증가시켰다. 또한 WI-38 cell을 이용하여 H₂O₂로 유도된 조기노화에 의한 항노화 효과를 살펴본 결과에서도, 깻잎의 추출물은 감소된 세포생존율을 유의적으로 증가시켜 노화를 지연시키는 항노화 효과가 있음을 확인하였다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	ROS와 RNS에 의한 손상을 개선시키기 위한 항산화 방어 시스템에는 무엇이 있는가?	ROS와 RNS에 의한 손상을 개선시키기 위한 항산화 방어 시스템에는 superoxide dismutase, glutathione peroxidase, catalase 같은 생체 내의 활성산소 제거 효소에 의해 조절 되는 항산화시스템(Andersen et al., 1997)과 주로 음식을 통해 섭취하는 β-carotene, 비타민 C, 비타민 E 등의 비효소적인 항산화 시스템이 존재한다(Nuttall et al., 1999; Peng et al.
	ONOO-가 초래하는 문제점은 무엇인가?	ONOO-는 특히 염증 시에 많이 생성되며 주로 마크로파지, 호중구, 내피세포에서 생성된다. 이는 지질과산화 또는 thiol등의 아미노산을 변형시키며, 에너지 대사, DNA손상 등의 손상을 초래한다(Patel et al., 1999; Rubbo et al.
	reactive nitrogen species에는 무엇이 포함되는가?	Superoxide(O2-), hydrogen peroxide(H2O2) 및 lipid peroxyl radical(LOO-) 등을 포함한 reactive oxygen species(ROS)와 nitric oxide(NO), nitrogen dioxide(NOO-), peroxynitrite(ONOO-), alkyl peroxynitrites(LOONO)등을 포함한 reactive nitrogen species(RNS)의 과잉 생성과 항산화 방어 시스템 간의 불균형으로 산화적 스트레스가 유발되며(Lim, 2004), 이는 염증성질환 및 알츠하이머와 같은 만성 질환의 병리학적 진행과 노화과정에 있어 중요한 원인으로 생각되어지고 있다(Bokov et al., 2004; Gibson and Huang, 2005; Rath and Haller, 2011).

참고문헌 (23)

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