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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 고전 화침요법과 가열식 화침요법 시술에 따른 화상의 정도와 온도 분포를 열화상카메라와 조직학적 실험을 통해 확인하고 동물세포를 이용하여 침 재료 안전성을 확인하여 화침 시술시 발생할 수 있는 부작용에 대해 고찰해 보고자 하였다.
- 화침의 부작용으로는 통증, 공포감, 화상, 피부발진 등이 있을 수 있으나 심리적인 요인을 제외하고 화상, 피부 발진, 재료 안전성에 대한 과학적 근거를 제시해야 화침 시술에 대한 신뢰성이 더 높아질 것이라 사료된다. 따라서, 본 연구에서는 화침 시술시 발생할 수 있는 부작용의 하나인 화상에 대한 과학적 검증과 화침 재료 안전성에 대한 고찰을 해보고자 하였다.
- 본 연구에서는 자입 전 가열하는 방식을 ‘고전화침’, 자입 후 가열하는 방식을 ‘가열식 화침’이라 명명하여 서술하겠다.
제안 방법
- After each of classic fire needle and warning fire needle therapy was applied using a lighter and a torch, the treated areas were observed using H&E stain and TUNEL assay.
- 가열식 화침 시술시 동물의 대퇴부에 가열 기구로 인한 화상을 방지하기 위해 MDF 재질의 방열판(두께 5mm, 가로 7cm, 세로 7cm, 구멍지름 3mm)을 대고자침 후 침대를 토치(Pocket Torch, Prince, Japan) 와 가스 라이타로 각각 10초간 가열하여 수행하였고, 화침은 침끝을 토치와 가스 라이타로 10초간 가열하여 시술부위에 빠르게 자입한 후 제거하는 방법으로 수행하였다. 라이타와 토치 두 가열기구를 사용하여, 침 가열시, 화침 시술시, 화침 시술 직후를 열화상 카메라(Ti55FT Thermal Imager, Fluke, USA)를 사용하여 온도를 측정하였으며 3번의 열화상 실험 결과를 토대로 온도 분석을 수행하였다.
- 화침 시술시 가열도구로 사용되는 토치와 가스 라이타는 침을 가열할 때 부산물이 생성될 가능성이 있으며 실제로 육안으로 관찰 시 검게 그을린 것이 확인되므로 가열도구에 의한 침재료 안전성에 대한 고찰이 필요할 것으로 사료되었다. 가열식 화침의 경우 가열 부분이 피부나 조직에 닿지 않는 처리 방법이지만 금속의 산화 환원 반응은 접촉된 금속 상호 간에도 발생하기 때문에 국소 부위의 산화 환원 반응이 자입부의 산화 환원 반응을 야기할 수 있으므로 혹여 있을 수 있는 안전성에 만전을 기하고자 고전화침과 함께 세포 독성 실험을 수행하였다.
- 가열식 화침의 부산물 시료는 STS 304를 complete DMEM media(10% FBS, 1% P/S) 3ml에 담그고 토치와 라이타를 사용하여 침병 부분에 10초간 열을 가하는 방법으로, 10개의 침을 사용하여 시료를 제작하였다. 침의 열처리가 끝난 media를 모아 세포 독성 실험에 사용하였다.
- 가열한 화침의 침재료 안전성 실험결과 세포독성이 나타나지 않아 침 재료 자체에 대한 안전성을 확인하였다.
- 근육 조직을 깊이에 따라 피부 바로 아래를 상층, 상층과 하층의 중간 부분을 중층, 침첨 부분을 하층으로 나누어 슬라이드를 선택하고 Hematoxylin & Eosin(H&E) 염색과 TUNEL assay(Apop Tag Peroxidase insitu Apoptosis Detection Kit, Chmicon, USA & Canada)를 수행하였다.
- 근육조직은 표층부와 침끝 부위, 표층부와 침끝의 중간 부분으로 나누어 화침에 의한 화상 정도를 확인하였다. 침이 들어간 부분을 중심으로 깊이별로 조직의 손상정도를 확인하였을 때 황두침을 라이타로 시술한 조직의 표층부에서만 TUNEL assay 양성 반응을 확인할 수 있었으며(Figure 6, circle), 자침 부위에 3도 화상 정도에 준하는 피부 경화가 발생하였음을 관찰할 수 있었다(Figure 5).
- 가열식 화침 시술시 동물의 대퇴부에 가열 기구로 인한 화상을 방지하기 위해 MDF 재질의 방열판(두께 5mm, 가로 7cm, 세로 7cm, 구멍지름 3mm)을 대고자침 후 침대를 토치(Pocket Torch, Prince, Japan) 와 가스 라이타로 각각 10초간 가열하여 수행하였고, 화침은 침끝을 토치와 가스 라이타로 10초간 가열하여 시술부위에 빠르게 자입한 후 제거하는 방법으로 수행하였다. 라이타와 토치 두 가열기구를 사용하여, 침 가열시, 화침 시술시, 화침 시술 직후를 열화상 카메라(Ti55FT Thermal Imager, Fluke, USA)를 사용하여 온도를 측정하였으며 3번의 열화상 실험 결과를 토대로 온도 분석을 수행하였다.
- 침의 열처리가 끝난 media를 모아 세포 독성 실험에 사용하였다. 세포에 처리하기 위한 모든 작업은 clean bench에서 수행하였다.
- 5mg/kg의 비율로 피하 주사하여 전신마취하였다. 실험동물의 대퇴부를 면도하고 치오글리콜산 성분의 제모제(비트 스피디 크림 자스민, Reckitt Benckiser, France.)를 사용하여 화침 시술 부위를 완전히 제모하였다. 제모 후 차가운 물로 씻고 2시간 동안 피부를 안정시킨 후 화침 시술을 하였다.
- 근육 조직을 깊이에 따라 피부 바로 아래를 상층, 상층과 하층의 중간 부분을 중층, 침첨 부분을 하층으로 나누어 슬라이드를 선택하고 Hematoxylin & Eosin(H&E) 염색과 TUNEL assay(Apop Tag Peroxidase insitu Apoptosis Detection Kit, Chmicon, USA & Canada)를 수행하였다. 염색한 조직은 광학현미경을 사용하여 조직의 형태와 손상 정도를 관찰하였다(Dp70, Olympus, Japan). 조직 시료에서 화상 여부의 판독은 권 등10)의 논문을 참고하였다.
- 우리는 화침 시술시 침과 시술부위의 온도분포를 확인하고 화침 시술에 따른 조직 손상 정도를 조직학적 실험을 통해 확인하였으며, 화침 시술에 따른 침재료 안전성을 확인하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 화침 시술시 사용하는 침과 자침 전 후의 피부 온도를 과학적으로 확인하기 위하여 열화상 카메라를 사용하여 실험하였다. 일회용 호침과 황두침 두가지 종류의 침을 사용하였으며, 가열도구로는 라이타와 토치를 이용하였다.
- 일회용 호침의 시술방법은 자침 후 침대를 가열하는 방법이므로 시술시 침대의 온도와 피부온도를 측정하였고 황두침의 경우 침끝을 10초 동안 가열하여 자침하는 방법이므로 가열시 침끝의 최고 온도와 자침후의 피부 온도를 3회 측정하였다.
- 가열식 화침은 주로 자입 후 열을 가해 시술하고 고전화침은 자입전 열을 가해 시술한다. 자입 전 가열 시 침이 빨갛게 될때까지 가열하고, 자입 후 가열 시 침대를 10초 이내로 가열하여 치료하므로 본 실험에서는 가열시간 최대치인 10초 가열로 확정하여 실험하였다. 가열식 화침과 고전화침을 토치로 가열했을 때 평균 최고 온도는 각각 324℃, 441℃로 나타났다.
- )를 사용하여 화침 시술 부위를 완전히 제모하였다. 제모 후 차가운 물로 씻고 2시간 동안 피부를 안정시킨 후 화침 시술을 하였다. 화침 시술은 두 가지 방법을 사용하였는데 화침요법에는 의료용으로 사용하는 30mm 길이의 황두침(행림, 한국)을 사용하였고, 가열식 화침용법에는 30X40mm 규격의 일회용 호침(동방침구사, 한국) 을 사용하였다.
- 침 부산물 시료를 complete DMEM media(10% FBS, 1% p/s)에 희석하여 시료가 100%, 50%, 25%, 0%가 들어가게 희석한 후 72시간 동안 세포에 처리한다. 72시간 후 5mg/ml MTT solution(Sigma, MO, USA) 10ul를 각 well에 처리한 후 37℃ incubator에서 3시간 놓아두고 formazan 결정체가 생성이 되면 media를 제거한 후 100% dimethylsulfoxide(Sigma) 100ul를 첨가하여 완전히 용해시켰다.
- 화침 시술시 사용하는 침과 자침 전 후의 피부 온도를 과학적으로 확인하기 위하여 열화상 카메라를 사용하여 실험하였다. 일회용 호침과 황두침 두가지 종류의 침을 사용하였으며, 가열도구로는 라이타와 토치를 이용하였다.
- 화침 시술이 끝난 조직은 피부 표면의 화상 정도와 깊이에 따른 조직 손상을 확인하기 위해 피부와 근육을 나누어 자른 후 NBF에 고정하여 20㎛ 두께로 동결절편하였다. 근육 조직을 깊이에 따라 피부 바로 아래를 상층, 상층과 하층의 중간 부분을 중층, 침첨 부분을 하층으로 나누어 슬라이드를 선택하고 Hematoxylin & Eosin(H&E) 염색과 TUNEL assay(Apop Tag Peroxidase insitu Apoptosis Detection Kit, Chmicon, USA & Canada)를 수행하였다.
- 화침의 부산물 시료 획득은 황두침의 침첨부를 토치와 가스 라이터를 사용하여 10초 동안 달군 후 바로 complete DMEM media(10% FBS, 1% P/S)에 넣고 30초간 넣어둔 후 제거하는 방법으로 10개의 침을 사용하여 시료를 준비하였다.
- 화침의 부작용 중 하나인 화상에 대한 안전성을 확인하기 위하여 Rat의 대퇴부에 화침을 시술하여 화상의 정도를 확인하였다. 실험동물은 20% urethane(Sigma-Aldrich, USA)을 이용하여 1.
대상 데이터
- 화침의 부작용 중 하나인 화상에 대한 안전성을 확인하기 위하여 Rat의 대퇴부에 화침을 시술하여 화상의 정도를 확인하였다. 실험동물은 20% urethane(Sigma-Aldrich, USA)을 이용하여 1.5mg/kg의 비율로 피하 주사하여 전신마취하였다. 실험동물의 대퇴부를 면도하고 치오글리콜산 성분의 제모제(비트 스피디 크림 자스민, Reckitt Benckiser, France.
- 실험동물은 Sprague-Dawley계 250-320g, 8-9주령의 수컷 흰쥐(대한 바이오링크, 한국)을 사용하였다. 동물은 온도 22±1℃, 상대습도 55±10%의 조건에서 12시간 간격으로 주야 주기를 주어 사육되었다.
- 화침에 의한 세포 독성 실험을 위해 normal skeletal muscle 세포주인 L6 cell line(KCLB No. 21458)을 한국세포주은행으로부터 분양받아 배양하였다. L6 cell line은 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM ,Gibco, USA)에 10% FBS, 1% penicillin/streptomycin을 첨가하여 37℃, 5% CO2가 공급되는 incubator에서 배양하였다.
데이터처리
- MTT assay 결과 비교는 PASW Statistics 18(Polar Engineering and Counsulting, USA)를 사용하여 Tukey's HSD Posthoc 검정에 따라 ANOVA를 시행하여 p<0.05 수준에서 유의성을 검증하였다.
- plate는 Dymatech MRX ELISA microplate reader (Dynatech laboratories, Chantilly, VA, USA)를 사용하여 570 nm 파장에서 흡광도를 측정한다. 각 실험은 3번씩 수행하였으며 결과 분석에는 3번 실험의 평균을 사용하였다.
이론/모형
- 염색한 조직은 광학현미경을 사용하여 조직의 형태와 손상 정도를 관찰하였다(Dp70, Olympus, Japan). 조직 시료에서 화상 여부의 판독은 권 등10)의 논문을 참고하였다.
- 제모 후 차가운 물로 씻고 2시간 동안 피부를 안정시킨 후 화침 시술을 하였다. 화침 시술은 두 가지 방법을 사용하였는데 화침요법에는 의료용으로 사용하는 30mm 길이의 황두침(행림, 한국)을 사용하였고, 가열식 화침용법에는 30X40mm 규격의 일회용 호침(동방침구사, 한국) 을 사용하였다.
성능/효과
- H&E 염색과 TUNEL assay 분석 결과, 일회용 호 침의 경우 화침 시술 부위의 피부에 침을 자입한 흔적만 남아있을 뿐 열에 의한 조직 손상은 확인되지 않았다.
- MTT assay를 통한 세포 독성 실험 결과 부산물 시료를 100% 넣은 실험군에서 오히려 세포 생장률이 더 증가한 것으로 확인되었으며 부산물 시료 50% 이하부터는 부산물 시료를 넣지 않은 대조군에 비해 세포 생장률이 미세한 감소 경향을 보이거나 증가하는 경우도 있는 것으로 나타났다. 또한 일회용 호침과 황두침 시료 모두 라이타로 시료를 만들었을 때 더 높은 생장률을 나타냈다.
- MTT assay를 통한 세포독성 실험결과는 ANOVA를 시행하여 실험 방법 별 희석 배율에 따른 실험군간 유의성을 검증한 결과 유의적인 차이를 확인할 수 없었다 (p<0.05).
- 가열식 화침은 조직에 화상을 유발하지 않았으나 고전화침은 근육층과 피부층에 국소의 3도 화상이 관찰되어 화침 시술로 인한 화상의 정도는 크지 않다는 것을 확인하였다.
- 가열식 화침의 조직학적 실험 결과 모든 부위에서 자입 흔적만 있을 뿐 화상은 관찰되지 않았다. 따라서 가열식 화침은 피부 표층에만 열자극이 전달되는 것으로 추측할 수 있다.
- Hayes14)와 Tepperman15), Wadsworth16) 등은 40℃ 이상에서 유효한 치료효과를 보인다고 하였으며, Riadh 등17)은 47∼50℃의 온도에서 10분 이상의 온열자극은 조직 괴사와 단백질 변성이 일어날 수 있음을 경고하였다. 고전화침 시술 후 Rat의 피부 온도는 Riadh 등이 언급한 조직 괴사가 일어날 수 있는 온도 범위에 포함되나 순간적으로 자입하는 방법이기 때문에 열 지속 시간이 짧고 접촉 부위가 좁아 피하의 근육층과 피부층의 화상이 위험하지 않다는 것을 확인할 수 있었다.
- 또한 일회용 호침과 황두침 시료 모두 라이타로 시료를 만들었을 때 더 높은 생장률을 나타냈다. 따라서 재료 안전성 측면에서 일회용 호침과 황두침은 전혀 유해하지 않음을 확인할 수 있었다(Figure 7).
- 따라서 화침시술 시 열화상 카메라를 이용하여 확인한 온도 분포와 H&E 염색과 TUNEL assay 결과가 일치하는 양상을 보였으며 고전화침과 가열식 화침으로 인한 화상은 반흔을 남기지 않는 정도의 경미한 화상이라고 할 수 있다.
- MTT assay를 통한 세포 독성 실험 결과 부산물 시료를 100% 넣은 실험군에서 오히려 세포 생장률이 더 증가한 것으로 확인되었으며 부산물 시료 50% 이하부터는 부산물 시료를 넣지 않은 대조군에 비해 세포 생장률이 미세한 감소 경향을 보이거나 증가하는 경우도 있는 것으로 나타났다. 또한 일회용 호침과 황두침 시료 모두 라이타로 시료를 만들었을 때 더 높은 생장률을 나타냈다. 따라서 재료 안전성 측면에서 일회용 호침과 황두침은 전혀 유해하지 않음을 확인할 수 있었다(Figure 7).
- 일회용 호침의 침체를 가스 라이타로 가열했을 때 평균 최고 온도는 286℃, 황두침의 침끝을 가스 라이타로 가열했을 경우 264℃로 토치로 가열시 보다는 낮은 온도로 측정되었다. 시술시 열화상 카메라를 통해 확인한 침체의 열 분포도를 보면 열을 가한 부분 즉, 일회용 호침의 침체부분은 300℃ 정도의 열분포를 보이나 침끝으로 갈수록 급격히 낮아지는 온도를 나타냈고 황두침 시술 후의 경우 침끝 만이 40℃ 이상의 온도를 보였을 뿐 다른 부분은 35℃ 미만의 열분포를 보였다(Figure 1). 그러나 시술시 Rat의 피부 표면의 온도는 일회용 호침의 경우 가열도구와 상관없이 평균적으로 30℃를 나타냈고 황두침의 경우 46∼51℃를 나타냈다(Table 1).
- 일회용 호침과 황두침을 시술한 후 Rat의 피부 표면을 관찰해보면 일회용 호침은 피부표면에 자입 흔적이 거의 나타나지 않지만 황두침은 자입부의 피부경화와 선명한 구멍이 나타나는 것을 확인할 수 있었다(Figure 2).
- 가열식 화침과 고전화침을 토치로 가열했을 때 평균 최고 온도는 각각 324℃, 441℃로 나타났다. 일회용 호침의 침체를 가스 라이타로 가열했을 때 평균 최고 온도는 286℃, 황두침의 침끝을 가스 라이타로 가열했을 경우 264℃로 토치로 가열시 보다는 낮은 온도로 측정되었다. 시술시 열화상 카메라를 통해 확인한 침체의 열 분포도를 보면 열을 가한 부분 즉, 일회용 호침의 침체부분은 300℃ 정도의 열분포를 보이나 침끝으로 갈수록 급격히 낮아지는 온도를 나타냈고 황두침 시술 후의 경우 침끝 만이 40℃ 이상의 온도를 보였을 뿐 다른 부분은 35℃ 미만의 열분포를 보였다(Figure 1).
- 화침 부산물에 의한 세포 독성 실험을 위해 normal skeletal muscle 세포주인 L6 cell line을 사용하여 MTT assay를 통해 안전성을 확인하였으며 화침 부산물이 세포의 성장을 억제하기 보다는 오히려 세포 성장에 도움이 되는 것으로 확인되었다. 이는 전침에서의 MTT assay 결과와 비슷한 양상을 보이는 것으로18) 침 부산물이 세포의 성장을 증가시키는 요인이 있을 것으로 사료되나 정확한 이유에 대해서는 다양한 관점의 연구가 필요할 것으로 생각된다.
후속연구
- 따라서 일회용 호침을 이용한 화침 시술은 재료의 안정성 측면에서 전혀 유해하지 않으며 다만 화침 시술시 발생할 수 있는 화상은 환자 개개인의 피부 특성에 따른 시술자의 주의만 요구된다면 안전하다 할 수 있겠다. 그러나 현재의 화침 재료에 대한 안정성 실험은 일회용 호침과 황두침 만을 사용하여 실험하였기에 대침이나 특제의 굵은 침에 대한 재료 안정성 실험이 추가 되어야할 것으로 판단된다.
- 그러나 화침 시술시 가장 큰 주의를 요하는 화상에 대한 보고뿐 아니라 침을 토치와 라이타 등의 가열도구로 가열하였을 때 생성되는 부산물에 대한 생체내 안전성에 대한 연구 보고가 부족한 실정이다. 또한 가열시침의 최고 온도 측정 및 주위의 온도 상승에 대한 환경적 보고가 없어 화상으로 인한 부작용을 고려하기 위해 과학적 측면에서 검증할 필요가 있을 것으로 생각된다.
- 위의 결과를 통해 화침 시술에 대한 안전성을 확인할 수 있었고, 임상연구에 있어서 화상의 부작용을 예방할 수 있는 화침 시술의 기준으로 활용되기를 기대한다.
- 이 연구결과를 통해 한의학에서 매우 중요한 치료법 중 하나인 화침이 안전성에 대한 검증을 통해 보다 많은 사람들에게 신뢰성 있는 치료법으로서 인식되기를 바라며 많은 임상연구 결과에 밑거름이 되기를 바라는 바이다.
- 화침 부산물에 의한 세포 독성 실험을 위해 normal skeletal muscle 세포주인 L6 cell line을 사용하여 MTT assay를 통해 안전성을 확인하였으며 화침 부산물이 세포의 성장을 억제하기 보다는 오히려 세포 성장에 도움이 되는 것으로 확인되었다. 이는 전침에서의 MTT assay 결과와 비슷한 양상을 보이는 것으로18) 침 부산물이 세포의 성장을 증가시키는 요인이 있을 것으로 사료되나 정확한 이유에 대해서는 다양한 관점의 연구가 필요할 것으로 생각된다.
- 화침 시술시 가열도구로 사용되는 토치와 가스 라이타는 침을 가열할 때 부산물이 생성될 가능성이 있으며 실제로 육안으로 관찰 시 검게 그을린 것이 확인되므로 가열도구에 의한 침재료 안전성에 대한 고찰이 필요할 것으로 사료되었다. 가열식 화침의 경우 가열 부분이 피부나 조직에 닿지 않는 처리 방법이지만 금속의 산화 환원 반응은 접촉된 금속 상호 간에도 발생하기 때문에 국소 부위의 산화 환원 반응이 자입부의 산화 환원 반응을 야기할 수 있으므로 혹여 있을 수 있는 안전성에 만전을 기하고자 고전화침과 함께 세포 독성 실험을 수행하였다.
- 화침의 다양한 임상 연구 결과에도 불구하고 화침에 대한 안전성 연구 보고가 결여됨에 따라 화침 임상연구 전에 화침에 대한 안전성 실험이 선행되어야할 것이라 생각한다. 화침의 부작용으로는 통증, 공포감, 화상, 피부발진 등이 있을 수 있으나 심리적인 요인을 제외하고 화상, 피부 발진, 재료 안전성에 대한 과학적 근거를 제시해야 화침 시술에 대한 신뢰성이 더 높아질 것이라 사료된다. 따라서, 본 연구에서는 화침 시술시 발생할 수 있는 부작용의 하나인 화상에 대한 과학적 검증과 화침 재료 안전성에 대한 고찰을 해보고자 하였다.
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