[논문]홍국쌀(Monascus purpureus) 추출물의 항산화 작용

권정숙

doi:10.3746/jkfn.2012.41.4.437

홍국쌀(Monascus purpureus) 추출물의 항산화 작용
Antioxidant Properties of Red Yeast Rice (Monascus purpureus) Extracts 원문보기

한국식품영양과학회지 = Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition, v.41 no.4, 2012년, pp.437 - 442

초록
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홍국쌀 추출물의 항산화 작용을 DPPH radical 및 hydroxyl radical 소거능, 간암 세포에서의 산화적 DNA 손상과 항산화 효소의 유전자 발현에 미치는 영향으로 분석하였다. 홍국쌀 추출물의 DPPH radical 소거능은 ethyl acetate 추출물, methanol 추출물, butanol 추출물 순이었으며, ethyl acetate 추출물의 DPPH radical 소거능은 0.2 mg/mL에서 85%, $IC_{50}$는 0.13 mg/mL로 나타났다. Ethyl acetate 추출물의 hydroxyl radical 소거능을 DCF fluorescence로 측정한 결과, cuvette에서는 2.5 ${\mu}g$/mL에서 44.2%, 5.0 ${\mu}g$/mL 74.1%, 10.0 ${\mu}g$/mL >100%로 나타났고, $HepG_2$ cell에서는 ethyl acetate 추출물로 전처리한 세포의 radical이 $H_2O_2$로만 처리한 세포에 비해 유의적으로 감소하였다. 홍국쌀 ethyl acetate로 전처리한 세포의 DNA 손상이 $H_2O_2$로만 처리한 세포에 비해 유의적으로 낮았으며, 추출물 대신 lovastatin을 처리한 세포는 DNA 손상이 증가하는 것으로 나타났다. 항산화 효소 유전자의 상대적 발현 정도를 측정한 결과, 산화 스트레스 없이 ethyl acetate 추출물로 전처리한 세포에서는 SOD와 GPx가 control에 비해 각각 3.25배, 2.67배 유의적으로 증가하였으며, 추출물로 전처리한 후 산화 스트레스에 노출시킨 세포에서는 CAT가 control에 비해 5 ${\mu}g$/mL에서 4.64배, 10 ${\mu}g$/mL에서 7.0배 유의적으로 증가하였다.

Abstract ▼ AI-Helper

Red yeast rice (RER) has been used in China for centuries for its medicinal properties and is an increasingly popular alternative lipid-lowering treatment. This study was carried out to estimate the antioxidant properties of RER extracts. The ethyl acetate extract exhibited the DPPH radical scavenging activity of 85% at 0.2 mg/mL and $IC_{50}$ 0.13 mg/mL. A significant proportion of hydroxyl radicals in a cuvette were scavenged: 44.2% at 2.5 ${\mu}g$/mL, 74.1% at 5.0 ${\mu}g$/mL, and >100% at 10 ${\mu}g$/mL. The $HepG_2$ cells pre-treated with RER ethyl acetate extract reduced the hydroxyl radicals significantly compared to the control cells. Oxidative DNA damage was measured using a Comet assay. The RER ethyl acetate extract did not induce any DNA damage per se, and appeared to enhance the resistance to DNA damage caused by an oxidant challenge with $H_2O_2$, whereas lovastatin increased the level of DNA damage in the cells in both the unstressed (no oxidant) and those stressed with $H_2O_2$. The relative gene expression of the antioxidant enzymes in $HepG_2$ cells were also affected by the RER ethyl acetate extract. The $HepG_2$ cells were pre-incubated with the RER ethyl acetate extract, and then stressed with $H_2O_2$ or left unstressed (no oxidant). In the unstressed cells, superoxide dismutase (Cu/Zn SOD) and glutathione peroxidase (GPx) were increased significantly 3.25-fold and 2.67-fold, respectively, whereas in the stressed cells, the catalase (CAT) level was increased by 4.64-fold and 7.0-fold at 5 ${\mu}g$/mL and 10 ${\mu}g$/mL, respectively, compared to those of the control. From these results, RER appears to be effective in suppressing oxidative stress.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

아울러 고지혈증 치료제인 statins의 장기간 복용으로 근육 장애, 간과 신장 기능 장애, 갑상선 기능 저하 및 당뇨병과 같은 부작용이 보고되면서 statins의 대체제로서 홍국의 사용에 대한 관심이 높아지고 있다(12). 이에 본 연구에서는 홍국쌀 추출물의 항산화 작용을 DPPH radical 및 hydroxyl radical 소거능, 간암 세포에서의 산화적 DNA 손상과 항산화 효소의 유전자 발현에 미치는 영향으로 분석하였다.

제안 방법

2에 제시하였다. Cuvette에서 H₂O₂/FeSO₄의 Fenton 반응으로 hydroxyl radical을 생성하고 fluorescent probe인 DCFDA를 사용하여 hydroxyl radical로 인해 생성된 DCF fluorescence를 15분 동안 측정 하였다. 홍국쌀 ethyl acetate 및 butanol 추출물(0, 2.
Cuvette에서의 측정은 H2O2(1 μM), FeSO4(50 mM), fluorescent probe인 dichlorofluorescin diacetate(DCFDA, 20 μM)와 시료(butanol 및 ethyl acetate 추출물)를 각각 농도별(0, 2.5, 5.0 및 10.0 μg/mL)로 혼합한 다음 15분 동안 dichlorofluorescin(DCF) fluorescence 생성량을 Ex 365 nm, Em 435 nm에서 형광광도계(F-4500, Hitachi, Tokyo, Japan)로 측정하였다.
HepG2 cells를 여러 농도의 홍국쌀 ethyl acetate 추출물(0, 1, 5 및 10 μg/mL)로 12시간 동안 전처리한 후, PBS(no oxidant) 또는 H2O2(1 mM)에 1시간 동안 노출시켰다.
HepG2 cell에서의 측정은 세포를 여러 농도의 홍국쌀 ethyl acetate 추출물(0, 1, 5 및 10 μg/mL)로 1시간 동안 전 처리한 후, H2O2(1 mM)에 1시간 노출시키고, DCFDA(20 μM)를 첨가하여 30분간 incubation 하고 세포를 ice-cold PBS로 2회 세척하여 수집한 후 초음파로 파쇄하고 원심분리 하여 얻은 상등액에서 DCF fluorescence를 형광 광도계로 측정하였다.
Hydroxyl radical 소거능은 fluorescent probes를 사용하여 cuvette에서(14), 그리고 HepG₂ cell에서(15) 각각 측정하였다. Cuvette에서의 측정은 H₂O₂(1 μM), FeSO₄(50 mM), fluorescent probe인 dichlorofluorescin diacetate(DCFDA, 20 μM)와 시료(butanol 및 ethyl acetate 추출물)를 각각 농도별(0, 2.
세포를 3시간 동안 홍국쌀 ethyl acetate 추출물 농도별(0, 1, 5 및 10 μg/mL) 및 lovastatin(1 μg/mL)으로 각각 전처리한 후, phosphate buffer(no oxidant) 또는 25 μM H2O2에 각각 5분간 노출시켜 산화 스트레스를 가한 후 DNA 손상 정도를 Comet assay로 분석하였다.
HepG₂ cells를 여러 농도의 홍국쌀 ethyl acetate 추출물(0, 1, 5 및 10 μg/mL)로 12시간 동안 전처리한 후, PBS(no oxidant) 또는 H₂O₂(1 mM)에 1시간 동안 노출시켰다. 세포를 수거하여 RNA 추출용 kit(Quiagen, Valencia, CA, USA)로 RNA를 추출하고 SuperScript II reverse transcriptase(Life Technologies, Paisley, UK)를 사용하여 cDNA를 합성한 다음 mRNA 발현 정도를 Exicycler(Bioneer Co., Daejeon, Korea)로 분석하였다. 항산화 효소 primer는 Bioneer Co.
시료마다 2개씩의 slide, 한 slide에 50개씩의 cells에 대해 Komet image analysis system(Version 5.0, Kinetic Imaging, Nottingham, UK)을 사용하여 DNA 손상 정도를 측정하고, 결과는 Olive tail moment(OTM)[(Tailmean－Headmean)×Tail density(%)/100]로 나타내었다.
0 mg/mL)의 시료를 DMSO를 용매로 제조하여 DPPH 용액(200 μM)에 첨가한 후, 실온에 30분간 방치시켰다가 microplate reader(Sunrise, Tecan, Männedorf, Switzerland)로 515 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료의 DPPH radical 소거능은 control에 대한 radical 소거율(%)로 나타내었으며, 소거율 50%에서의 시료 농도(IC₅₀)를 산출하였다.
이상의 DPPH radical 소거능 측정 결과로부터 홍국쌀 추출물 시료 중 항산화능이 가장 우수한 ethyl acetate 추출물을 주 시료로 하여 다음 실험을 시행하였다.
Slide를 PBS(“no oxidant”) 또는 H₂O₂(25μM)에 5분 동안 담근 후 lysis buffer(4℃ for 1 hr)로 lysis시키고, unwinding buffer에 20분간 방치한 후 4℃에서 20분간 전기영동(25 V, 300 mA)한다. 전기영동이 끝나면 중화시킨 후 ethidium bromide로 염색하여 형광현미경(DMLB, Leica, Wetzlar, Germany)으로 DNA 손상 정도를 관찰한다. 시료마다 2개씩의 slide, 한 slide에 50개씩의 cells에 대해 Komet image analysis system(Version 5.
추출물과 H2O2 대신 용매와 PBS로 처리한 세포("no oxidant")를 대조로 하여 비교하였다.
홍국쌀 ethyl acetate 추출물이 HepG₂ cell에서 항산화 효소의 유전자 발현에 미치는 영향을 semi-quantitative real time PCR(RT-PCR)로 측정하였다. HepG₂ cells를 여러 농도의 홍국쌀 ethyl acetate 추출물(0, 1, 5 및 10 μg/mL)로 12시간 동안 전처리한 후, PBS(no oxidant) 또는 H₂O₂(1 mM)에 1시간 동안 노출시켰다.
아울러 고지혈증 치료제인 statins의 장기간 복용으로 근육 장애, 간과 신장 기능 장애, 갑상선 기능 저하 및 당뇨병과 같은 부작용이 보고되면서 statins의 대체제로서 홍국의 사용에 대한 관심이 높아지고 있다(12). 이에 본 연구에서는 홍국쌀 추출물의 항산화 작용을 DPPH radical 및 hydroxyl radical 소거능, 간암 세포에서의 산화적 DNA 손상과 항산화 효소의 유전자 발현에 미치는 영향으로 분석하였다.

대상 데이터

홍국쌀은 한스바이오(주)(경북 영양군, 한국)로부터 제공받은 제품을 사용하였다. 홍국쌀 100 g을 먼저 메탄올로 3회 환류 추출한 후 90℃에서 진공 농축시켜 methanol 추출물을 얻고(5.

데이터처리

결과는 평균±표준편차로 나타내었으며, 각 변수에 대해 일원배치분산분석(one-way ANOVA)을 실시하였고, 사후검정으로는 Duncan's multiple range test를 적용하였으며 α=0.05수준에서 유의성을 검정하였다.
두 그룹 간에는 Student's t-test로 유의성을 검정하였다.

이론/모형

1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) radical 소거능은 Hatano 등(13)의 방법으로 측정하였다. 추출물별로 여러 농도(0～1.
DNA 손상 정도는 Singh 등(16)의 방법에 따라 Comet assay로 분석하였다. HepG₂ cells를 여러 농도(1, 5 및 10μg/mL)의 홍국쌀 ethyl acetate 추출물 또는 lovastatin(1μg/mL)으로 3시간 동안 전처리하고 수집하여 PBS에 현탁시킨다.
유전자 발현 정도는 측정된 Ct(threshold cycle) 값을 사용하여 the comparative CT(2-ΔΔCT) method(17)로 계산하였고 control에 대한 상대적 발현비로 나타내었다.

성능/효과

5 mg/mL에서 ethyl acetate 추출물은 100% 소거율을 나타내었으며, methanol, butanol 및 hexane 추출물은 각각 54%, 42% 및 25% 소거하는 것으로 나타났다. DPPH radical 소거율 50%에 해당하는 추출물의 농도(IC₅₀)를 계산한 결과(Table 2), ethyl acetate 추출물이 0.13 mg/mL로 항산화력이 가장 높았고, methanol 추출물(0.43 mg/mL), butanol 추출물(0.62 mg/mL) 순으로 나타났다. 한편, vitamin C의 DPPH 소거능은 0.
Ethyl acetate 추출물의 hydroxyl radical 소거능을 DCF fluorescence로 측정한 결과, cuvette에서는 2.5 μg/mL에서 44.2%, 5.0 μg/mL 74.1%, 10.0 μg/mL >100%로 나타났고, HepG2 cell에서는 ethyl acetate 추출물로 전처리한 세포의 radical이 H2O2로만 처리한 세포에 비해 유의적으로 감소하였다.
HepG2 cell을 1 mM H2O2에 1시간 동안 노출시킨 세포(0 μg/mL)의 DCF fluorescence가 H2O2에 노출시키지 않은 세포(no oxidant)에 비해 34.5% 유의적으로 증가하였다.
Lovastatin을 적용한 세포(0.50±0.10)는 추출물로 전처리한 세포들보다 DNA 손상이 유의적으로 증가한 것으로 나타났다.
세포를 3시간 동안 홍국쌀 ethyl acetate 추출물 농도별(0, 1, 5 및 10 μg/mL) 및 lovastatin(1 μg/mL)으로 각각 전처리한 후, phosphate buffer(no oxidant) 또는 25 μM H₂O₂에 각각 5분간 노출시켜 산화 스트레스를 가한 후 DNA 손상 정도를 Comet assay로 분석하였다. No oxidant 세포에서 보듯이, 홍국쌀 ethyl acetate 추출물 자체로 인한 DNA 손상은 관찰 되지 않았으며 오히려 추출물 농도가 증가할수록 DNA 손상이 감소하는 경향을 보였으나 유의성은 없었다. 하지만 추출물 대신에 lovastatin을 처리한 세포는 추출물(10 μg/mL)로 전처리한 세포(0.
추출물 5 μg/mL로 전처리하고 H2O2로 산화 스트레스를 가한 세포(0.20±0.07)와 산화 스트레스를 가하지 않은(no oxidant) 세포(0.22±0.08)의 DNA 손상에서 유의적인 차이가 없는 것으로 보아 H2O2로 인한 DNA 손상으로부터 세포가 보호된 것으로 보인다.
추출물로 12시간 전처리하고 H2O2(1 mM)에 1시간 처리하여 산화 스트레스를 가한 세포의 경우, control에 비해 CAT는 5 μg/ mL에서 4.64배, 10 μg/mL에서 7.0배 유의적으로 증가하였으며, Cu/Zn SOD는 5 μg/mL에서 증가하는 경향을 보였으나 유의성이 없었고 GPx는 변화가 없었다.
하지만 추출물 대신에 lovastatin을 처리한 세포는 추출물(10 μg/mL)로 전처리한 세포(0.18±0.07)에 비해 DNA 손상이 211%(0.38±0.09) 유의적으로 증가하였다.
항산화 효소 유전자의 상대적 발현 정도를 측정한 결과, 산화 스트레스 없이 ethyl acetate 추출물로 전처리한 세포에서는 SOD와 GPx가 control에 비해 각각 3.25배, 2.67배 유의적으로 증가하였으며, 추출물로 전처리한 후 산화 스트레스에 노출시킨 세포에서는 CAT가 control에 비해 5 μg/mL에서 4.64배, 10 μg/mL에서 7.0배 유의적으로 증가하였다.
홍국쌀은 한스바이오(주)(경북 영양군, 한국)로부터 제공받은 제품을 사용하였다. 홍국쌀 100 g을 먼저 메탄올로 3회 환류 추출한 후 90℃에서 진공 농축시켜 methanol 추출물을 얻고(5.2 g), methanol 추출물로부터 hexane, butanol, water 및 ethyl acetate 추출물을 각각 연속적으로 분획하여 제조하였으며, 분획물의 수율은 각각 6.4%, 11.0%, 71.5% 및 6.7%로 나타났다.
홍국쌀 ethyl acetate 및 butanol 추출물(0, 2.5, 5 및 10 μg/mL)의 DCF fluorescence 생성 저해율을 측정한 결과, 2.5 μg/mL에서 control에 비해 각각 44.2%와 17.7%, 5.0 μg/ mL에서 각각 74.1%와 25.5%, 10 μg/mL에서 각각 >100%와 60.4%의 생성저해율을 나타내었다.
홍국쌀 ethyl acetate 추출물(0. 1, 5 및 10 μg/mL)로 1시간 동안 전처리하고 H2O2에 노출시킨 세포의 DCF fluorescence가 추출물로 전처리하지 않고 H2O2에 노출시킨 세포(0 μg/mL)에 비해 유의적으로 감소하였고, 추출물의 농도가 높을수록 더 많이 감소하는 경향을 보였으나 농도 간에는 유의적인 차이가 없었다.
DPPH radical은 안정한 분자로부터 전자 또는 수소를 취하는 유리기로 작용하므로 DPPH radical 소거능이 큰 물질일수록 항산화력이 크다고 할 수 있다. 홍국쌀 ethyl acetate 추출물은 0.2 mg/mL에서 DPPH radical을 85% 소거하였고, 0.5 mg/mL에서 ethyl acetate 추출물은 100% 소거율을 나타내었으며, methanol, butanol 및 hexane 추출물은 각각 54%, 42% 및 25% 소거하는 것으로 나타났다. DPPH radical 소거율 50%에 해당하는 추출물의 농도(IC₅₀)를 계산한 결과(Table 2), ethyl acetate 추출물이 0.
0 μg/mL >100%로 나타났고, HepG₂ cell에서는 ethyl acetate 추출물로 전처리한 세포의 radical이 H₂O₂로만 처리한 세포에 비해 유의적으로 감소하였다. 홍국쌀 ethyl acetate로 전처리한 세포의 DNA 손상이 H₂O₂로만 처리한 세포에 비해 유의적으로 낮았으며, 추출물 대신 lovastatin 을 처리한 세포는 DNA 손상이 증가하는 것으로 나타났다. 항산화 효소 유전자의 상대적 발현 정도를 측정한 결과, 산화 스트레스 없이 ethyl acetate 추출물로 전처리한 세포에서는 SOD와 GPx가 control에 비해 각각 3.
홍국쌀 추출물의 항산화 작용을 DPPH radical 및 hydroxyl radical 소거능, 간암 세포에서의 산화적 DNA 손상과 항산화 효소의 유전자 발현에 미치는 영향으로 분석하였다. 홍국쌀 추출물의 DPPH radical 소거능은 ethyl acetate 추출물, methanol 추출물, butanol 추출물 순이었으며, ethyl acetate 추출물의 DPPH radical 소거능은 0.2 mg/mL에서 85%, IC₅₀는 0.13 mg/mL로 나타났다. Ethyl acetate 추출물의 hydroxyl radical 소거능을 DCF fluorescence로 측정한 결과, cuvette에서는 2.

후속연구

본 실험에서 홍국쌀 ethyl acetate 추출물은 간암 세포인 HepG2의 산화적 DNA 손상에 대해 5 μg/mL에서는 억제뿐 아니라 예방 효과도 있었으나, 더 높은 농도인 10 μg/mL에서는 억제 효과가 나타나지 않았으며 이에 대해서는 추후 연구가 필요한 것으로 생각된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	홍국쌀 추출물의 항산화 작용과 관련되어 보고된 성분은?	홍국에는 콜레스테롤 합성 저해제인 monacolin K(lovastatin)가 함유되어 있어서 혈액 콜레스테롤 저하 작용이 있는 것으로 알려져 있으며(3-5), 최근에는 홍국의 발효과정에서 생성되는 이차 대사산물들의 다양한 기능성이 보고되고 있다. 홍국쌀에 함유되어 있는 azaphilone 색소들(monascin, ankaflavin, rubropunctatin, monascorburin, rubropunctamine 및 monascorburamine)의 항염증 작용, γ-aminobutyric acid의 신경전달 및 혈압 강하 효과, dimerumic acid, tannin, phenol 및 unsaturated fatty acids의 항산화 작용이 보고되어 있으며(6-9), 알코올성 간손상에 대한 간보호작용(10), 그리고 Alzheimer's disease 발생과 관련 있는 amyloid β-peptide의 신경세포에 대한 독성 억제 효과(11) 등도 홍국쌀의 항산화 작용에 기인한 것으로 보고되고 있다. 아울러 고지혈증 치료제인 statins의 장기간 복용으로 근육 장애, 간과 신장 기능 장애, 갑상선 기능 저하 및 당뇨병과 같은 부작용이 보고되면서 statins의 대체제로서 홍국의 사용에 대한 관심이 높아지고 있다(12).
	reactive oxygen species에는 어떤 것들이 있는가?	생체에서는 superoxide, hydroxyl radical 및 과산화수소와 같은 reactive oxygen species(ROS)들이 계속해서 생성되며 ROS의 생성에 반응하여 이들을 제거하는 항산화 시스템도 함께 조절되고 있다. 따라서 ROS의 생성과 항산화 방어계는 어느 정도 균형 상태를 유지하고 있는 것이 사실이다.
	홍국쌀의 이명은?	찐 백미에 홍국(Monascus purpureus)을 접종하고 배양하여 만든 홍국쌀은 ‘red Koji’ 또는 ‘Hong Qu’로도 불리며, 중국에서는 수세기 동안 식품으로서뿐 아니라 술을 비롯한 발효식품 제조에 향미 증진제, 또는 착색제로 사용되고 있으며, 민간에서는 소화 촉진과 혈액 순환 개선에 효과가 있는 것으로 널리 알려져 왔다(2). 홍국에는 콜레스테롤 합성 저해제인 monacolin K(lovastatin)가 함유되어 있어서 혈액 콜레스테롤 저하 작용이 있는 것으로 알려져 있으며(3-5), 최근에는 홍국의 발효과정에서 생성되는 이차 대사산물들의 다양한 기능성이 보고되고 있다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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