선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 이에 저자는 위령선(Clematidis radix)을 사용하여 약침액을 제조하고, mouse를 대상으로 type Ⅱ collagen, Freund’s complete adjuvant, lipopolysaccharide (LPS) 및 phospholipase A2 유도 류마티스 관절염을 유발한 후 위령선약침액(Clematidis radix herbal-acupuncture solution, CRHS)을 투여하여 관절염에 미치는 영향과 기전을 탐색한 결과, 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
- 이에 저자는 위령선(Clematidis radix)을 사용하여 약침액을 제조하고, mouse를 대상으로 type Ⅱ collagen, Freund’s complete adjuvant, lipopolysaccharide(LPS) 및 phospholipase A2 유도 류마티스 관절염을 유발한 후 약침액(Clematidis radix herbal-acupuncture solution, CRHS)을 투여하여 관절염에 미치는 영향과 기전을 규명하고자 실험을 시행하였다.
제안 방법
- 감압농축하여 생성된 농축액에 생리식염수를 가하고 1N NaOH로 pH 7.0으로 조절하여 전량이 200㎖가 되게 한 다음 저온에서 24시간 방치한 후, membrane filter(0.22 ㎛, WhatmanⓇ, Germany)로 여과하여 위령선약침액의 원액(×1)으로 사용하였으며 필요에 따라 2배 희석 (×0.5) 및 10배 희석(×0.1)하여 사용하였다.
- 계대 보존중인 Raw 264.7 세포를 10% fetal bovine serum이 포함된 DMEM을 배양액으로 하여 CO2 배양기(5% CO2, 37℃)에서 배양하였고, 배양액은 2일 또는 3일간격으로 교환해 주었다. 세포는 액체 질소에 보관해 두었다가 같은 passage 번호를 가진 세포를 녹여서 사용하였으며, 세포의 생존은 trypan blue dye exclusion방법으로 확인하였다.
- 관절염의 중증도는 주 2회 육안으로 평가하였다19).
- )하였으며 처음 주사하고 제2주와 제4주 후에 각각 incomplete Freund’s adjuvant 를 사용하여 위와 동일한 방법으로 추가면역(booster) 하였다(총 3회). 대조약물로는 dexamethasone (1㎎/ ㎏)을 복강 내로 주 2회 투여하였다. 이들 그룹은 모 두 실험 시작 후 관절염의 발생과 중증도를 9주까지 관찰하였다.
- 실험 결과 반응시간이 길어질수록 두 효소의 활성이 점차로 증가하였으며, 특히 porcine pancreas의 경우에서는 반응 120분부터 plateau를 나타냄을 알 수 있었다. 따라서 본 실험에서는 각 효소에 의해 20～ 30%의 [14C] arachidonic acid 유리를 나타내는 30분으로 반응시간을 고정하고 이하의 실험을 진행하였다 (Fig. 2).
- 또한 류머티스성 관절염 치료효과를 검토하기 위해 위령선약침액의 투여는 중완(中脘, CV12) 혈을 선택하였으며 투여 용량은 각각의 농도(×0.05, ×0.1 및 ×0.5)를 100㎕씩 주 3회씩 주입하였다(Table 1).
- 먼저 group I 형 PLA2의 활성측정을 위해 100 mM Tris-HCl (pH 7.4), 6 mM CaCl2, 각 농도별 위령선약 침액 20 ㎕, 20 nmol의 기질 및 30 ng의 효소(porcine pancreas)를 함유한 최종 용적 0.2 ㎖를 반응액으로 조제하였다. 한편 group Ⅱ형 PLA2의 활성측정 시에 는 100 mM Tris-HCl (pH 7.
- 본 실험을 위하여 100 mM Tris-HCl (pH 7.4), 6 mM CaCl2, 기질 20 nmol 1-stearoyl-2-[1-14C]arachidonylsn-glycerophosphocholine 및 porcine pancreas (group I PLA2)의 경우에는 30ng, Crotalus atrox (group Ⅱ PLA2)의 경우에는 40 ng을 넣고 최종 용적을 0.2 ㎖ 로 한 다음, 37℃ shaking waterbath에서 0, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140분 및 180분 동안 반응시키고 Dole’s assay법20)으로 각각의 PLA2의 활성을 측정한 다음 반응시간을 결정하였다.
- 계속하여 horseradish peroxidase가 부착된 2차 항체와 반응시키고 재차 TTBS로 6회 세척하였다. 세척이 끝나면 증류수로 세척하고 enhanced chemiluninescence용액으로 2분간 반응하고 Kodac 필름에 감광하여 나타난 band의 두 께를 비교하고 단백질 발현 유무 및 그 차이를 확인 하였다.
- 에 의해 위령선 약침액을 제조하였다. 위령선 60g을 수직으로 환류냉각관이 부착된 원저 flask에 넣고, 증류수 400 ㎖를 가한 후, 3시간 전탕하여 추출하고 여과하였다. 그 후 여과액 중에 남아 있는 미량의 침전물을 제거하기 위해 4℃에서 2,500 rpm으로 10분간 원심분리하여, 그 상층액을 취하였다.
- 위령선약침액을 조제하여 mouse를 대상으로 하여 collagen 및 Freund’s complete adjuvent 유도 류머티스성 관절염에 미치는 영향을 살펴본 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 22 ㎛, WhatmanⓇ, Germany)로 여과하였다. 위의 방법으로 제조한 위령선 추출액 50 ㎖ 에 ethanol을 가하여 교반하고 저온에서 방치하여 생성된 침전물을 여별하였다. 이때 ethanol은 99.
- 대조약물로는 dexamethasone (1㎎/ ㎏)을 복강 내로 주 2회 투여하였다. 이들 그룹은 모 두 실험 시작 후 관절염의 발생과 중증도를 9주까지 관찰하였다. 또한 류머티스성 관절염 치료효과를 검토하기 위해 위령선약침액의 투여는 중완(中脘, CV12) 혈을 선택하였으며 투여 용량은 각각의 농도(×0.
- 위의 방법으로 제조한 위령선 추출액 50 ㎖ 에 ethanol을 가하여 교반하고 저온에서 방치하여 생성된 침전물을 여별하였다. 이때 ethanol은 99.9% ethanol을 사용하였으며, 첨가량은 위령선 추출액이 단계별로 75, 85 및 95% ethanol 용액이 되게 하면서 침전물을 제거한 다음, 감압농축하였다. 감압농축하여 생성된 농축액에 생리식염수를 가하고 1N NaOH로 pH 7.
- 이를 0.2㎖씩 mouse에 피하주사(subcutaneous injection, s.c.)하였으며 처음 주사하고 제2주와 제4주 후에 각각 incomplete Freund’s adjuvant 를 사용하여 위와 동일한 방법으로 추가면역(booster) 하였다(총 3회).
- 이 때 양성대조군으로는 NS-398 (5μM)을 사용하였다. 이를 12시간 동안 배양한 후 세포의 lysate를 준비하여 western blot분석에 사용하였고, 배양상층액은 회수하여 PGE2 Biotrak kit (Amersham Biosciences)을 이용하여 COX-2 활성측정에 사용하였다. 즉 PGE2 Biotrak kit (Amersham Biosciences)의 96 well plate에 이들 상층액 50 ㎕씩 가한 뒤, 희석한 mouse anti-PGE2 antibody를 50 ㎕씩 넣었다.
- 즉 Freund’s complete adjuvant(mycobacterium tuberculosis) 50 ㎕/mouse를 mouse의 오른쪽 뒷 발바닥에 주사하고 18일째 이후부터 28일째 되는 날까지 검체를 투여하였으며, 약물투여 시작일부터 3일간격으로 10일 간 plethysmometer로 족부종을 측정하였다.
대상 데이터
- Louis, MO, USA)제품을 사용하였다. Fetal bovine serum (FBS)은 제일생명공학서비스(Daegu, Korea)에서 그리고 그 외의 모든 시약들은 모두 특급제품을 사용하였다. 또한 1-stearoyl-2-[1-14C]arachidonyl-snglycerophosphocholine과 prostaglandin E2 (PGE2) 측정에 사용한 enzyme immunoassay kit는 Amersham Pharmacia Biosciences (Arlington Heights, IL, USA) 의 제품을 사용하였으며, 1,4-bis [2-(phenyloxazolyl)] benzene (POPOP) 및 2,5-diphenyloxazole (DPO)는 Dojin사(Dojin Chem.
- 즉 Freund’s complete adjuvant(mycobacterium tuberculosis) 50 ㎕/mouse를 mouse의 오른쪽 뒷 발바닥에 주사하고 18일째 이후부터 28일째 되는 날까지 검체를 투여하였으며, 약물투여 시작일부터 3일간격으로 10일 간 plethysmometer로 족부종을 측정하였다. 대조약물로는 ibuprofen 200 ㎎/㎏을 사용하였다. Paw volume 의 측정에는 plethysmometer(Mitutoyo Co.
- Fetal bovine serum (FBS)은 제일생명공학서비스(Daegu, Korea)에서 그리고 그 외의 모든 시약들은 모두 특급제품을 사용하였다. 또한 1-stearoyl-2-[1-14C]arachidonyl-snglycerophosphocholine과 prostaglandin E2 (PGE2) 측정에 사용한 enzyme immunoassay kit는 Amersham Pharmacia Biosciences (Arlington Heights, IL, USA) 의 제품을 사용하였으며, 1,4-bis [2-(phenyloxazolyl)] benzene (POPOP) 및 2,5-diphenyloxazole (DPO)는 Dojin사(Dojin Chem. Co., Tokyo, Japan)의 제품을 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 시약 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM), chicken typeⅡ collagen, ibuprofen, porcine pancreas phospholipase A2, Crotalus atrox phospholipase A2, lipopolysaccharide(E. Coli), NS398, bicinchoninic acid protein kit들과 adjuvant의 주성분인 열-약화시킨 Mycobacterium tuberculosis는 Sigma사(St. Louis, MO, USA)제품을 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 위령선(Clematidis radix)은 동국대학교 부속한방병원에서 구입한 후 精選하여 사용하였으며 추출에 사용한 물은 3차 증류수를 사용하였다. Voucher specimen은 동국대학교 일산한방병원 침구과에 보관되어 있다.
- 본 실험에서는 水製-alcohol 沈法17)에 의해 위령선 약침액을 제조하였다. 위령선 60g을 수직으로 환류냉각관이 부착된 원저 flask에 넣고, 증류수 400 ㎖를 가한 후, 3시간 전탕하여 추출하고 여과하였다.
- 이 때 양성대조군으로는 NS-398 (5μM)을 사용하였다.
- 태령 5주령의 체중 20～25g의 DBA/1JCrj (H-2q) 암컷 mouse (Charles Liver, 일본)를 사용하였으며, 동국대학교 의과대학(경주시, 경북) 동물사육실에서 일정한 조건(온도 22±2℃, 습도 40～60%)하에서 2주일 적응시켜 사용하였다.
- 한편 사용기기로서 rotary evaporator는 BUCHI사(BUCHI RE121, Switzerland), CO2 배양기는 Vison사(Vision Biotec, VS-9180, Korea), UV spectrophotometer는 Gilford사(Gilford, ResponseTM. USA), ELISA reader는 Molecular Devices사(VERSA max, USA)의 제품을 각각 사용하였다.
데이터처리
- 본 실험에서 얻은 실험군 간의 결과에 대하여 student’s t-test를 실시하여 유의성을 검정하였으며, p값이 0.05이하인 경우에 유의성을 인정하였다.
이론/모형
- Durie 등의 방법18)으로 위령선약침액의 collagen induced arthritis에 대한 억제효과를 실험하였다. Chicken type Ⅱ collagen을 0.
- 7 세포를 10% fetal bovine serum이 포함된 DMEM을 배양액으로 하여 CO2 배양기(5% CO2, 37℃)에서 배양하였고, 배양액은 2일 또는 3일간격으로 교환해 주었다. 세포는 액체 질소에 보관해 두었다가 같은 passage 번호를 가진 세포를 녹여서 사용하였으며, 세포의 생존은 trypan blue dye exclusion방법으로 확인하였다.
- 체중 30g 내외의 자성 ICR mouse 7마리를 한 군으로 하여 Claude 등의 방법15)에 따라 실시하였다. 즉 Freund’s complete adjuvant(mycobacterium tuberculosis) 50 ㎕/mouse를 mouse의 오른쪽 뒷 발바닥에 주사하고 18일째 이후부터 28일째 되는 날까지 검체를 투여하였으며, 약물투여 시작일부터 3일간격으로 10일 간 plethysmometer로 족부종을 측정하였다.
성능/효과
- ×0.1의 농도에서 6일째와 10일째 되는 날에 20.8% 및 20.2%의 억제효과가 나타났으며, 또한 ×0.5의 농도에서는 6일째와 10일째 되는 날에 25.4% 및 21.4% 의 억제효과가 나타났으며, 양성대조약물인 ibuprofen 200 ㎎/㎏에 버금가는 효능을 나타내었다(Table 2).
- 1. Mouse의 collagen 유도 류머티스성 관절염에서 위령선약침 처치는 6～8주째에는 유의성 있게 관절염지수의 감소를 나타내었다.
- 2. Freund’s complete adjuvant 유발 관절염에서 위령선약침 처치는 ×0.1의 농도에서 6일째와 10일째 되는 날에 20.8% 및 20.2%의 억제효과가 나타났으며, 또한 ×0.5의 농도에서는 6일째와 10일째 되는 날에 25.4% 및 21.4%의 억제 효과를 각각 나타내었다.
- 3. 위령선약침이 porcine pancreas 유래의 Ⅰ형 및 Crotalus atrox 유래의 Ⅱ형 phospholipase (PL) A2 활성에 미치는 영향을 검토한 결과, 농도의 존적으로 Ⅰ형과 Ⅱ형 PLA2 활성 억제효과를 보였다. Ⅱ형 PLA2에 대해서 보다 Ⅰ형 PLA2에 대한 억제활성 효능이 더 강하게 나타났다.
- 4. Western blot 및 prostaglandin E2 측정 결과 위령선약침액은 cyclooxygenase-2의 활성을 저해시키는 것으로 나타났다.
- 위령선약침이 porcine pancreas 유래의 Ⅰ형 및 Crotalus atrox 유래의 Ⅱ형 phospholipase (PL) A2 활성에 미치는 영향을 검토한 결과, 농도의 존적으로 Ⅰ형과 Ⅱ형 PLA2 활성 억제효과를 보였다. Ⅱ형 PLA2에 대해서 보다 Ⅰ형 PLA2에 대한 억제활성 효능이 더 강하게 나타났다.
- 4). 따라서 본 실험의 결과, 위령선약침액은 Crotalus atrox 유래의 Ⅱ형 PLA2에 대해서 보다 porcine pancreas 유래의 I형 PLA2에 대한 활성억제 효능이 농도의존적으로 강함을 알 수 있었다(Fig. 4).
- 본 실험 에서는 porcine pancreas 유래의 Ⅰ형 및 crotalus atrox 유래 Ⅱ형의 2가지 형태로 PLA2의 활성을 실험하였고 두 물질 모두 ×0.5 CRHS투여군에서 최고의 PLA2 활성억제를 보였으며, porcine pancreas 유래의 Ⅰ형에서 보다 활성억제 효능이 강함을 알 수 있었다.
- 본 실험에서 음성대조군, CRHS투여군(×0.05, ×0.1, ×0.5), 양성대조군(ibuprofen)으로 설정하여 mouse의 족부종 정도를 측정해본 결과, 음성대조군에서는 측정일마다 최고치로 나왔으며, ×0.5 CRHS투여군에서는 6일째와 10일째 각각 25.4% 및 21.4%의 억제효과가 나타났으며, 특히 6일째에는 양성대조군의 족부종 수치보다 낮게 관찰되었다.
- 본 실험에서도 양성·음성대조군 및 세 종류의 농도(×0.05, ×0.1, ×0.5)로 구분된 위령선 약침액 투여군를 비교해본 결과 음성대조군에서 관절염 지수가 최고로 높았으며, 이에 반해 ×0.5 농도의 CRHS투여군에서 양성대조군 다음으로 적은 관절염 지수를 보였다.
- 실험 결과 반응시간이 길어질수록 두 효소의 활성이 점차로 증가하였으며, 특히 porcine pancreas의 경우에서는 반응 120분부터 plateau를 나타냄을 알 수 있었다. 따라서 본 실험에서는 각 효소에 의해 20～ 30%의 [14C] arachidonic acid 유리를 나타내는 30분으로 반응시간을 고정하고 이하의 실험을 진행하였다 (Fig.
- 실험에서는 LPS가 유도하는 COX-2 활성에 미치는 영향을 PGE2의 생성량을 통해 확인해보았으며, 역시나 음성 대조군에서 가장 높은 수치가 나왔으며, ×0.5의 농도에서 40.3%의 COX-2에 의한 PGE2의 감소현상을 관찰할 수 있었다.
- 위령선 약침액을 각 농도별로 동시첨가로 인해 COX-2의 활성에 유의성 있는 저해효과가 나타났으며, 특히 0.5×의 농도에서는 LPS를 단독처리에서 보다 40.3% 의 COX-2에 의한 PGE2의 감소현상을 관찰할 수 있 었다(Fig. 5).
- 이와 같은 결과를 종합해 볼 때 위령선 약침액은 mouse에서 collagen, adjuvant, LPS 및 PLA2 유도 류머티스성 관절염의 발현을 억제하는 것으로 나타났으며, 작용기전 중 COX-2 및 PGA2의 활성를 억제시키는 것으로 보아 항염증 및 진통에 효능이 있어 충분히 류마티스 관절염을 비롯한 염증반응의 치료에 널리 응용될 수 있음을 시사하고 있다. 그러나 위령선약 침액은 저용량에서 효능이 있기 때문에 약침액(×1)으로 사용 시 인체에 미치는 독성 및 안전성에 대해 고려할 필요가 있다고 생각되며, 앞으로 IL-1β, IL-4, tumor necrosis factor-β 등 염증성 cytokine에 대한 국소 관절 및 혈액에서의 변화 등 더 많은 연구가 진행되어져야 할 것으로 생각된다.
후속연구
- 그러나 위령선약 침액은 저용량에서 효능이 있기 때문에 약침액(×1)으로 사용 시 인체에 미치는 독성 및 안전성에 대해 고려할 필요가 있다고 생각되며, 앞으로 IL-1β, IL-4, tumor necrosis factor-β 등 염증성 cytokine에 대한 국소 관절 및 혈액에서의 변화 등 더 많은 연구가 진행되어져야 할 것으로 생각된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.