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문제 정의
- 저자는 선연구에서 오이풀 뿌리의 아세톤추출물로 부터 chloroform, ethyl acetate, n-butanol, water층의 항염증 실험을 진행하여 n-butanol층이 가장 우수하다는 것을 확인하였고 이에 n-butanol(SRA-B) 분획물을 chromatography 실시하여 분리한 용매분획물의 항염증 활성을 알아보고 유효성 물질을 O/W emulsion에 첨가, 안정화 시켜 화장품 소재로서의 개발과 응용가능성을 검토하였다.
제안 방법
- 2번 씻은 후에 1:1,000으로 1차 antibody를 붙인 후 2차 antibody를 1:1,000 으로 희석하여 반응시킨다. 2차 antibody를 붙인 후, PBS tween으로 수차례 세척한 후에 ECL kit(Amersham Pharmacia, England)를 사용하여 film에 옮긴 후, iNOS, COX-2 단백질 발현량을 확인하였다.
- E-SRA-B3의 pH 측정은 pH meter(Hanna Co., Romania)사의 pH meter를 이용하여 25℃에 보관한 SRA-B3 가 첨가된 O/W형 로션의 pH를 3회 반복 측정한 후 평균을 구하였다. 측정하기 전에 유리전극은 미리 염기성 완충액이나 증류수에 수시간 담가두고 pH meter는 전원에 연결하고 10분 이상 두었다가 사용하였다.
- E-SRA-B3의 입자를 관찰하기 위하여 현미경(Eclipse 80i/100X, Nicon, Japan)을 이용하여 내상의 입자의 분포를 확인하였고 입도분석을 위한 장비로 (N5, Beckman Coulter, USA)을 사용하여 평균 입자사이즈를 확인하였다.
- E-SRA-B3의 입자의 형태, 크기, 분포도를 관찰하기 위하여 현미경과 입도분석 실시하였다. emulsion은 25℃에 보관한 것을 사용하였고 현미경 400배 배율로 관찰한 결과 Fig.
- MTT assay를 이용하여 10~100µg/ml의 농도에서 SRA-B3의 세포독성실험을 수행하였다.
- Nano emulsion은 입자 크기가 작고 균일하여 침전이나 크리밍 현상에 대하여 우수한 안정성을 나타내기 때문에21,22) 화장품, 식품 및 의약품 등에 실질적으로 응용하고자 하는 시도가 계속되고 있다23,24). Nano emulsion의 안정성 평가 지표로 다양한 온도 조건과 태양광선의 노출 조건 하에 pH 및 점도의 변화를 측정하여 변화되는 조건에 대해 28일 동안 안정함을 나타내어 화장품 소재로서의 적합성을 확인하였다. 결론적으로 오이풀 아세톤 추출물의 분획물은 항산화, 항염증 활성이 높고 화장품 개발시 민감성피부, 아토피 등의 항염증 화장품소재로 사용이 가능함을 시사한다.
- Western blotting를 통해 SRA-B3가 Raw 264.7cell에서 iNOS와 COX-2 단백질의 발현에 미치는 영향을 확인하였다. iNOS는 평소에는 세포 내에 존재하지 않으나 일단 유도되면 장시간 동안 다량의 NO를 생성하며, 생성된 NO는 혈관 투과성, 부종 등의 염증반응을 촉진시킬 뿐만 아니라 염증 매개체의 생합성을 촉진하여 염증을 심화시키는 것으로 알려져 있다11-13).
- 그 결과 cell viability가 10, 25, 50, 100 농도에서 각각 86.8%, 87.8%, 83.2%, 61.8%로 100µg/ml 농도를 제외하고는 세포독성을 보이지 않아 Western blot 실험 최고 농도를 50µg/ml로 정하였다(Fig. 3).
- , USA)를 이용하여 측정하였다. 다양한 조건에 보관한 O/W형 로션을 스핀들(spindle) No.4으로 6rpm에서 1분간 측정하였으며, 기포의 영향을 줄이기 위해 제조 시 탈포를 하였고 3회 반복하여 평균값을 얻었으며, 1회 측정 후 3시간 뒤에 다시 측정하여 3주 동안 측정한 값을 나타내었다. 즉 점도 값에 영향을 줄 수 있는 요인을 최소화하여 측정하였다.
- 본 연구에서 SRA-B의 Electron donating abilities 항산화 실험결과 효능이 우수한 SRA-B3층의 Western blot 실험결과와 SRA-B3가 첨가된 emulsion의 안정성 평가를 분석한 결과 아래와 같은 결론을 얻었다.
- 세포 생존율을 확인하기 위하여 적정 세포수 측정은 96 well plate에 5 × 105 cells/ml이 되게 0.2 mL 분주한 후 접종한 후 37℃, 5% CO2 incubator에서 24h 배양 후 무혈청 배지 0.1 8mL로 교체한 뒤 SRA-B3를 농도별로 처리하고 24h 배양하였다.
- 그 후 상등액은 제거한 후 PBS로 2 회 세척한 후에 scrapper로 cell을 수확한 후에 lysis buffer를 넣어서 세포를 용출시킨다. 수확된 protein은 BSA(bovine serum albumin)으로 작성한 standard curve에 OD값을 대입시켜서 protein량을 보정하였다. 그 후에 coomassie blue로 염색하여 재보정한 후에 western sample로 사용하였다.
- 또한 천연물에 대한 관심이 집중되면서 천연물이 함유하는 특정성분이나 2차 대사산물에서의 생리활성 물질이 현저한 활성을 나타내는 고부가가치의 물질로서 계속 발굴되고 있다15). 오이풀 뿌리의 항염증에 관한 활성 연구16) 및 항균효과17)에 관한 연구는 활발히 진행중이며 화장품 소재로서 활용한 바가 없어 본 연구에서는 오이풀 뿌리 분획물을 Electron donating abilities를 통하여 항산화활성을 확인하였고 Western blot을 통해 iNOS, COX-2 단백질의 발현량을 알아보았다. 본 실험에서 사용된 Raw 264.
- 오이풀 아세톤 추출물의 제조는 오이풀 3 ㎏에 70% acetone을 10배 양을 가하여 상온에서 3회 추출한 다음 filter paper로 여과하였고, 얻어진 여액은 감압농축하여 아세톤 추출물 423 g을 얻었다. 오이풀 아세톤 추출물을 분별깔대기에 넣고 chloroform을 첨가하여 chloroform 층과 water 층을 분획하였고, chloroform 층 5.4 g을 얻었다. 동일한 과정을 통해 ethyl acetate 분획물 127 g 및 n-butanol 분획물 116 g을 순차적으로 얻었고, 최종 남은 용액은 물 분획물 150 g이라 하였다.
- 7 세포로부터 SRA-B3의 항염증 활성을 Western blot을 통해 알아본 결과 LPS 단독 처리한 군에 비해 샘플을 함께 처리하였을 때 iNOS 단백질은 25, 50µg/ml에서, COX-2 단백질은 고농도인 50µg/ml에서 발현이 저해되는 것을 확인할 수 있었다. 이로써 항염증 효능이 우수한 SRA-B3를 첨가한 nano emulsion을 제조하고 입자분석, 입도분석 및 안정성 테스트를 진행하였다. Nano emulsion은 입자 크기가 작고 균일하여 침전이나 크리밍 현상에 대하여 우수한 안정성을 나타내기 때문에21,22) 화장품, 식품 및 의약품 등에 실질적으로 응용하고자 하는 시도가 계속되고 있다23,24).
- 4으로 6rpm에서 1분간 측정하였으며, 기포의 영향을 줄이기 위해 제조 시 탈포를 하였고 3회 반복하여 평균값을 얻었으며, 1회 측정 후 3시간 뒤에 다시 측정하여 3주 동안 측정한 값을 나타내었다. 즉 점도 값에 영향을 줄 수 있는 요인을 최소화하여 측정하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 오이풀뿌리 지유(地楡)는 경북 안동시 북후면에서 2009년 4월 채취한 것을 구입하여 뿌리를 건조하여 이물질을 제거하고 세척, 건조 후 실험재료로 사용하였다. 오이풀 아세톤 추출물의 제조는 오이풀 3 ㎏에 70% acetone을 10배 양을 가하여 상온에서 3회 추출한 다음 filter paper로 여과하였고, 얻어진 여액은 감압농축하여 아세톤 추출물 423 g을 얻었다.
- 분획물 중 n-butanol 분획물 40g을 Dianion HP-20 column chromatography를 H2O->MeOH(0:100%) 로 실시하여 5개의 시료를 획득하였다(Fig.1).
- 세포 생존율 측정에 사용된 세포주는 macrophage 세포인 Raw 264.7을 Korean Cell Line Bank(KCLB)에서 구입하여 사용하였다. 시약은 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium), fetal bovine serum(FBS), penicillin/streptomycin, trypsin 250, 0.
- 실험에 사용된 1차 항체인 iNOS BD Biosciense (Sanjose, CA, USA) COX-2 Cayman (Ann Arbor, MI, USA), β-actin (Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였고 2차 항체인 anti-rabbit Ig-G horseradish peroxidase(HRP)-conjugated antibody는 Santa Cruz에서 구입하여 사용하였다.
- 실험에 사용된 기기는 ELISA reader(Biotek Co., USA), Viscometer(Brookfield Co., USA), pH meter(Hanna Co., Romania), Homomixer(Tokushu Kika Kogyo Co., Japan), Agimixer (Young hanna Tech., Korea), Hotplate(Young hanna Tech., Korea)를 사용하였다.
이론/모형
- 전자공여능 (EDA: electron donating abilities)은 Blois9)으로 다음과 같이 측정하였다. 각 시료용액 100 µL에 0.
성능/효과
- 1. SRA-B의 Electron donating abilities 결과 SRA-B3 fraction이 가장 높은 항산화능을 보였으며 SRA-B3와 대조군 BHA가 50µg/ml 농도에서 각각 85.2%, 88.2%의 항산화능을 나타내었다.
- 2. SRA-B3의 세포독성 실험결과 최고 50µg/ml에서 독성이 나타나지 않았다.
- 3. Raw 264.7 cell을 이용한 SRA-B3의 iNOS, COX-2 단백질 발현은 LPS 군에 대비해 50µg/ml에서 iNOS, COX-2 단백질 발현이 현저히 줄어드는 것을 확인하였다.
- 4. SRA-B3를 함유한 emulsion의 현미경 관찰 결과 평균 입자 크기는 5~6µm로 나타났으며 입도분석 결과 평균입도는 6.7 ㎛로 나타났다.
- 7) 같이 나타내었다. 40℃에 보관한 L-SRA-B3의 pH가 다른 조건에 비해 pH값이 조금 낮게 나타났으나 전체적으로 SRA-B3를 함유한 로션은 관찰기간 및 보관온도에 대한 특별한 변화가 없었다.
- 5. SRA-B3를 함유한 emulsion은 관찰기간 및 보관온도에 대해 pH, 점도에 특별한 변화가 없었다.
- SRA-B의 fraction 5층 모두 100µg/ml에서 80%이상의 활성을 나타냈으며 그 중 SRA-B3층은 50µg/ml 농도에서 85.2%, 대조군 BHA가 동일농도에서 88.2%로 대조군에 대비하여 유사한 높은 활성을 나타내어 항산화 효능이 높음을 알수 있었다.
- E-SRA-B3의 입자의 형태, 크기, 분포도를 관찰하기 위하여 현미경과 입도분석 실시하였다. emulsion은 25℃에 보관한 것을 사용하였고 현미경 400배 배율로 관찰한 결과 Fig. 5 에서 보듯이 입자 형태가 다양하며, 불균일한 분포를 가지며 입자의 분산 또는 분리가 없음을 확인하였다. 최소 입자 크기는 3μm, 최대 입자 크기는 9μm, 평균 입자 크기는 5~6μm로 나타났다.
- Nano emulsion의 안정성 평가 지표로 다양한 온도 조건과 태양광선의 노출 조건 하에 pH 및 점도의 변화를 측정하여 변화되는 조건에 대해 28일 동안 안정함을 나타내어 화장품 소재로서의 적합성을 확인하였다. 결론적으로 오이풀 아세톤 추출물의 분획물은 항산화, 항염증 활성이 높고 화장품 개발시 민감성피부, 아토피 등의 항염증 화장품소재로 사용이 가능함을 시사한다.
- 본 실험에서 LPS에 의해 Raw 264.7 세포로부터 SRA-B3의 항염증 활성을 Western blot을 통해 알아본 결과 LPS 단독 처리한 군에 비해 샘플을 함께 처리하였을 때 iNOS 단백질은 25, 50µg/ml에서, COX-2 단백질은 고농도인 50µg/ml에서 발현이 저해되는 것을 확인할 수 있었다.
- 실험결과 세포내 LPS 자극은 iNOS, COX-2 단백질 발현을 증가시켰으며 SRA-B3를 10, 25, 50µg/ml처리하였을 때 iNOS 단백질은 25, 50µg/ml에서, COX-2 단백질은 고농도인 50µg/ml에서 발현이 저해되는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 4).
- 최소 입자 크기는 3μm, 최대 입자 크기는 9μm, 평균 입자 크기는 5~6μm로 나타났다.
- 8) 같이 나타내었다. 측정결과 각 온도별 조건에서 28일 동안 큰 변화없이 점도가 안정한 상태를 유지함을 나타내었다.
후속연구
- 이러한 실험결과로 보아 오이풀 아세톤추출물의 butanol층의 iNOS, COX-2 단백질 발현억제는 emulsion에 첨가되어 항염증에 효능이 우수한 한방화장품 제품의 천연물 소재로 적용가능함을 제시한다.
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