칡한우 정액 동결에 있어서 희석액과 수소의 연령이 정자의 동결성, 체외수정란 발달 및 인공수정 임신율에 미치는 효과 Effect of Freezing Buffers and Age of Bulls on Freezability of Semen, $In$$Vitro$ Embryo Development and the Pregnancy Rate after Artificial Insemination of Korean Native Stripped Bull원문보기
The purpose of this study was to examine the effect of growing stages of the Korean Native Striped Bull (KNSB) on the freezability and fertility of frozen-thawed semen. First, we investigated the total motility (TM) and progressive motility (PM) according to the diluent used for semen freezing. Seco...
The purpose of this study was to examine the effect of growing stages of the Korean Native Striped Bull (KNSB) on the freezability and fertility of frozen-thawed semen. First, we investigated the total motility (TM) and progressive motility (PM) according to the diluent used for semen freezing. Second, we examined the effect of the age of KNSB on semen volume, TM and PM of fresh and frozen-thawed semen. Third, we examined the effect of frozen semen from the different age of KNSB on the $in-vitro$ fertilization rate, and the artificial insemination pregnancy rate. The diluents used in this experiment were Triladyl$^{(R)}$ and Tris-egg yolk extender (EYE). Semen was collected from 5 KNSB in the growing stage (15 months) and 5 adult KNSB (36 months). When Triladyl or Tris-EYE extender was used for semen freezing, there was no difference of the mean TM and the mean PM. However, the mean TM was significantly higher in Bull No. 1885 than Bull No. 4283 ($p$ <0.05). The mean volume of semen collected from the 15-month-old bulls (2.3 ml) was significantly lower ($p$ <0.05) than that from the 36-month-old bulls (5.0 ml). The mean semen concentration was similar for the 15-month-old ($2.1{\times}10^9$ spermatozoa/ml) and 36-month-old ($1.8{\times}10^9$ spermatozoa/ml) bulls. For the 15-month-old and 36-month-old bulls, the mean TM of fresh semen were 93.7% and 88.3%, respectively, and the mean PM were 97.0% and 88.3%, respectively; the 15-month-old bulls showed a particularly high PM ($p$ <0.05). For the 15-month-old and 36-month-old bulls, the mean TM (56.0% and 58.0%, respectively) and the mean PM (64.0% and 70.7%, respectively) of frozen-thawed semen did not differ. The development rates of embryos after $in-vitro$ fertilization and the pregnancy rate after artificial insemination using frozen-thawed semen did not differ according to the bull's age. In summary, semen volume differed according to the bull's age, but semen concentration and survival rate, the $in-vitro$ fertilization rate, and the pregnancy rate did not differ according to the stripe bull's age. Accordingly, semen from bulls in the growing stage can be collected and frozen for the preservation and multiplication of rare livestock.
The purpose of this study was to examine the effect of growing stages of the Korean Native Striped Bull (KNSB) on the freezability and fertility of frozen-thawed semen. First, we investigated the total motility (TM) and progressive motility (PM) according to the diluent used for semen freezing. Second, we examined the effect of the age of KNSB on semen volume, TM and PM of fresh and frozen-thawed semen. Third, we examined the effect of frozen semen from the different age of KNSB on the $in-vitro$ fertilization rate, and the artificial insemination pregnancy rate. The diluents used in this experiment were Triladyl$^{(R)}$ and Tris-egg yolk extender (EYE). Semen was collected from 5 KNSB in the growing stage (15 months) and 5 adult KNSB (36 months). When Triladyl or Tris-EYE extender was used for semen freezing, there was no difference of the mean TM and the mean PM. However, the mean TM was significantly higher in Bull No. 1885 than Bull No. 4283 ($p$ <0.05). The mean volume of semen collected from the 15-month-old bulls (2.3 ml) was significantly lower ($p$ <0.05) than that from the 36-month-old bulls (5.0 ml). The mean semen concentration was similar for the 15-month-old ($2.1{\times}10^9$ spermatozoa/ml) and 36-month-old ($1.8{\times}10^9$ spermatozoa/ml) bulls. For the 15-month-old and 36-month-old bulls, the mean TM of fresh semen were 93.7% and 88.3%, respectively, and the mean PM were 97.0% and 88.3%, respectively; the 15-month-old bulls showed a particularly high PM ($p$ <0.05). For the 15-month-old and 36-month-old bulls, the mean TM (56.0% and 58.0%, respectively) and the mean PM (64.0% and 70.7%, respectively) of frozen-thawed semen did not differ. The development rates of embryos after $in-vitro$ fertilization and the pregnancy rate after artificial insemination using frozen-thawed semen did not differ according to the bull's age. In summary, semen volume differed according to the bull's age, but semen concentration and survival rate, the $in-vitro$ fertilization rate, and the pregnancy rate did not differ according to the stripe bull's age. Accordingly, semen from bulls in the growing stage can be collected and frozen for the preservation and multiplication of rare livestock.
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문제 정의
성성숙이 완료된 15개월령 수소에서 정액을 채취 · 동결 보존한 후 거세하여 비육 후 자신 또는 형제의 성장률과 육질판정 결과를 바탕으로 씨수소로 선발하는 방법이 칡한우와 같은 소수 재래가축의 개량에 효과적일 것으로 생각된다. 따라서 본 연구에서는 칡한우 정자의 동결성 비교를 위하여 Trisegg yolk와 TriladyⓇ(Minitube, Germany) 희석제를 비교하였으며, 15개월령 및 36개월령 수소의 정액량, 신선 및 동결융해 정자의 생존율과 직진 운동성, 체외수정란 발달율 및 인공 수정 임신율을 비교 검토하였다.
칡한우 정자의 동결에 효과적인 희석제를 선발하기 위하여 Tris-EYE 희석제 및 Triladyl 희석제로 제조된 동결-융해 정자의 TM과 PM을 조사하였다. 칡한우 36개월령 2두(1885번과 4283번)의 정액을 각각 3회 채취하여 실험에 활용하였다.
제안 방법
Glycerol 첨가된 Tris-EYE 희석제를 15분 간격으로 4회에 나누어 첨가하여 정자수 50×106/ml로 조정한 후 0.5 ml 스트로우에 충진하였다.
2 mg/ml pyruvate(Sigma, P3662), 1μg/ml FSH(Sigma, F8174), 10μg/ml LH(Sigma, L9773) 및 10% FBS (Sigma, F0643)가 첨가된 TCM-199(Gibco, 12340-030) 용액, 체외수정용은 6 mg/ml BSA와 10μg/ml heparin(Sigma, H3149)이 첨가된 TALP 용액, 체외 배양용은 3 mg/ml BSA 또는 10% FBS가 첨가된 CR1aa 용액을 각각 이용하였다. 그리고 실험에 제공되는 배양액의 미세소적은 mineral oil(Sigma, M8410)을 도포하여 39℃, 5% CO2 배양기에서 최소한 4시간 이상 평형을 하였다.
9% 생리식염수(30～33℃)가 들어있는 보온병에 담아 2～3시간에 실험실로 운반하였다. 난소는 penicillin G(Sigma, P3032)가 첨가된 생리식염수로 3～4회 세척하여, 18 G 주사침이 부착된 10 ml 주사기를 이용하여 직경 2～8 mm의 가시난포로부터 난포란을 회수하였다. 회수된 난포란은 실체현미경하에서 난구세포의 부착 상태가 치밀한 것만을 선별하여, 50μl의 체외성숙용 배지에 15개 난포란을 옮겨 22시간 동안 39℃, 5% CO2 배양기에 배양함으로써 체외성숙을 유도하였다.
냉장 또는 동결 정액을 37℃ 수조에서 1분간 담근 후 잘 혼합한 정액 10 ul를 counting chamber에 놓고 CASA system(Minitube, Germany)상에서 3회 측정하여 TM과 PM 비율을 측정하였다.
칡한우 수소의 연령에 따른 정자의 동결성을 조사하기 위하여 15개월 및 36개월령 칡한우 5두씩, 3회 정액을 채취하였다. 정액 채취 직후 정액량, 정자 농도, TM 및 PM 비율을 조사하였고, Triladyl 희석제로 생산된 동결-융해 정자의 TM과 PM 비율을 비교하였다.
정액 동결에 이용되는 희석제는 정자의 생존율에 중대한 영향을 미치므로, 이의 잘못된 선택은 인공수정이나 수정란이식 시 수태율과 수정란 생산성 저하의 원인이 되기도 하므로, 동결융해 정액에 대한 수정능 평가가 필요하다(Sansone 등, 2000; 조 등, 2009). 정액의 품질 분석을 위한 현미경적 평가나 화학적 진단만으로 정액의 수정능을 예지하기에는 다소 부족하므로 본 연구에서는 각 실험실에서 많은 연구를 하고 있는 체외수정을 이용하여 동결융해 정액의 수정 능력을 평가하였다. 체외수정란의 발달에는 난소의 운반(Yang 등, 1990), 체외성숙 조건(Ward 등, 2002), 체세포와 공동 배양(Eyestone과 First, 1985), 에너지원(Rosenkrans 등, 1993), 혈청(Nagai, 2001; Wright와 Bondioli, 1981), 성장인자(Abe 등, 2002; Hoshi, 2003), 산소 농도(Lim 등, 1996), 배양액의 종류(Gandhi 등, 2000; Gardner, 1996) 등이 영향을 미치고, 특히 난자를 제공하는 도축 암소의 품질도 수정란의 발달에 영향을 미치는 것으로 보고되고 있다(Kim과 Park, 2011).
정자 농도를 25×106 sperms/ml가 되도록 조절하여, 15개씩의 난포란이 함유되어 있는 46μl의 체외수정용액에 heparin 2μl와 정자 2μl를 각각 첨가하여(최종 정자 농도 1×106 sperms/ml) 39℃, 5% CO2 배양기에 20시간 동안 배양함으로써 체외수정을 유도하였다.
채취된 정액은 실험실에서 Tris-EYE 희석제를 이용하여 정자수 100×106이 되도록 하였다.
칡한우 15개월령 및 36개월령 수소로부터 생산된 동결정액과 한우 미성숙 난자를 이용하여 체외수정란 발달율을 조사하였고, 칡한우 암소에 인공수정하여 임신율을 비교하였다.
칡한우 수소의 연령에 따른 정자의 동결성을 조사하기 위하여 15개월 및 36개월령 칡한우 5두씩, 3회 정액을 채취하였다. 정액 채취 직후 정액량, 정자 농도, TM 및 PM 비율을 조사하였고, Triladyl 희석제로 생산된 동결-융해 정자의 TM과 PM 비율을 비교하였다.
칡한우 암소의 발정발견은 오전(6시) 및 오후(6시)에 20분씩 실시하였고, 인공수정은 발정발견 후 10～12시간에 동결정액 1스트로우를 주입하였다. 임신 진단은 인공수정 후 40일 경에 초음파(Honda, Japan)로 하였다.
칡한우 육성축과 성축 정액의 동결성과 수태능을 검토하기 위하여 첫째, 동결 희석제(Tris-egg yolk extender(Tris-EYE) 및 Triladyl)에 따른 칡한우 정자의 total motility(TM)과 progressive motility(PM) 비율을 조사하였고, 둘째, 15개월령 및 36개월령인 칡한우 수소의 정액량, 신선 및 동결융해 정자의 TM과 PM 비율을 비교하였고, 셋째, 칡한우 연령에 따라 생산된 동결정액의 체외수정란 발달율 및 인공수정 임신율을 검토하였다. 칡한우 정액 동결에 사용하는 희석액에 따른 동결-융해 정액의 TM과 PM 비율은 차이가 없었으나, 칡한우 개체에 따른 TM 비율의 차이는 인정되었다.
대상 데이터
도축 한우에서 난소를 적출하여 25 μg/ml gentamycin(Sigma, G1264)이 첨가된 0.9% 생리식염수(30～33℃)가 들어있는 보온병에 담아 2～3시간에 실험실로 운반하였다.
본 실험에 이용된 정액 동결용 희석제는 Tris-based egg yolk extender(Tris-EYE; Shiva Shankar Reddy 등, 2010) 또는 시판용 Triladyl 희석제를 이용하였다. Tris-EYE 희석제의 조성은 Tris 33.
정액 채취에 사용된 칡한우는 경상북도 축산기술연구소와 울릉군에서 사육 중인 칡한우 수소 15개월령 5두와 36개월령 5두를 공시하였고, 매주 1회 정액을 채취하였다. 정액 채취는 인공질(FHK, Japan)을 이용하였다. 인공질은 온수로 38℃를 유지하였으며, 내부에는 non-spermicidal gel(Continental, USA)를 도포하였다.
정액 채취에 사용된 칡한우는 경상북도 축산기술연구소와 울릉군에서 사육 중인 칡한우 수소 15개월령 5두와 36개월령 5두를 공시하였고, 매주 1회 정액을 채취하였다. 정액 채취는 인공질(FHK, Japan)을 이용하였다.
칡한우 정자의 동결에 효과적인 희석제를 선발하기 위하여 Tris-EYE 희석제 및 Triladyl 희석제로 제조된 동결-융해 정자의 TM과 PM을 조사하였다. 칡한우 36개월령 2두(1885번과 4283번)의 정액을 각각 3회 채취하여 실험에 활용하였다.
인공질은 온수로 38℃를 유지하였으며, 내부에는 non-spermicidal gel(Continental, USA)를 도포하였다. 칡한우 수소의 승가를 유도하기 위하여 발정징후를 보이는 한우 암컷을 보정틀에 고정시킨 후, 수컷의 음경을 인공질에 삽입하여 정액을 채취하였다.
데이터처리
정액량, 정자 농도, 생존율과 직진운동성은 Mean±SE로 나타냈으며, 각각의 평균에 대한 통계학적 분석은 SAS package를 이용하여 분산 분석 후 Duncan's 다중 검정을, 수정란 발달율과 임신율은 χ2-test를 실시하였다.
성능/효과
1과 같다. 15개월령 동결-융해 정자의 TM 비율이 평균 56.0%, PM 비율이 평균 64.0% 그리고 36개월령 동결-융해 정자는 각각 평균 58.0%, 평균 70.7%로서 차이가 없었다.
정액 동결에 사용하는 희석제에 따른 동결-융해 칡한우 정자의 TM과 PM 비율을 조사한 결과는 Table 1과 같다. Triladyl 희석제에서는 칡한우 1885번의 TM 비율이 평균 79%, PM 비율은 평균 68%, 칡한우 4283번은 각각 평균 68% 및 73%였고, Tris-EYE 희석액에서는 칡한우 1885번이 각각 평균 72% 및 70%, 칡한우 4283번은 각각 60% 및 63%로서 차이가 없었다. 한편, 수소 개체간에는 희석제와 관계없이 칡한우 1885번의 TM 비율이 평균 72～79%로서 칡한우 4283번의 평균 60～68%에 비하여 유의하게 높았으나(p<0.
05). 동결-융해 정자의 TM 비율은 평균 56.0～58.0%, PM 비율은 평균 64.0～70.7%로서 차이가 없었다. 칡소 연령에 따라 생산된 동결정액을 이용한 체외수정란 발달율을 조사한 결과 연령에 따른 차이는 인정되지 않았으며, 인공수정 후 임신율도 비슷한 경향이었다.
본 연구에서 칡한우 수소의 정액량은 15개월령이 평균 2.3 ml, 36개월령은 평균 5.0 ml로서 연령이 높아질수록 정액량이 증가하여(p<0.05) 이전의 연구 결과와 일치하였다.
흑우에서 AndroMed 희석제를 이용한 동결융해 정자의 생존율이 평균 43%, 활력은 평균 66%였다 (조 등, 2009). 본 연구에서는 채정 직후 정자의 생존율과 직진운동성이 개체간의 차이는 인정되었으나, 희석제에 따른 차이는 없었다(Table 1). 이상의 결과에서 각 희석제의 동결 과정을 고려한다면 상온에서 충진과 봉입이 가능한 Triladyl 희석제의 활용도가 높을 것으로 생각된다.
본 연구의 결과를 종합하면 칡한우 수소의 연령에 따른 정액량 차이는 인정되나, 신선 정액의 농도 및 TM 비율, 동결융해 정액의 TM과 PM 비율 및 체외 배반포 발달율과 인공수정 임신율의 차이는 없었다. 따라서 육성 단계 수소의 동결정액을 활용한다면 칡한우 등의 재래희소가축의 보존과 증식에 기여할 것으로 기대된다.
칡소 연령에 따라 생산된 동결정액을 이용한 체외수정란 발달율을 조사한 결과 연령에 따른 차이는 인정되지 않았으며, 인공수정 후 임신율도 비슷한 경향이었다. 이상의 결과를 종합하면 칡한우 수소의 연령에 따른 정액량 차이는 인정되나, 신선 정액의 농도 및 TM 비율, 동결융해 정액의 TM과 PM 비율 및 체외 배반포 발달율과 인공수정 임신율의 차이는 없었다. 따라서 육성 단계 수소의 동결정액을 활용한다면 칡한우 등의 희소재래가축의 보존과 증식에 기여할 것으로 기대된다.
본 연구에서는 칡한우 수소의 연령에 따른 배반포 발달율(Table 3)과 인공수정 임신율(Table 4)의 차이는 없었다. 이상의 결과에서 체외수정란의 발달에는 정액 동결에 사용하는 희석제뿐만 아니라 체외수정란의 배양 조건 등이 종합적으로 영향을 미치지만 수소의 연령에 따른 효과는 없는 것으로 판단된다.
채정 직후 신선정자의 TM 비율은 15개월령 및 36개월령이 각각 평균 93.7% 및 88.3%, PM 비율은 각각 97.0% 및 88.3%로서, 특히 PM 비율이 15개월령에서 유의하게 높았다(p<0.05).
8×109/ml 로서 연령에 따른 차이는 없었다. 채정 직후 정자의 생존율과 활력은 흑우가 각각 평균 80%(조 등, 2009), 칡한우는 생존율 56.4%, 활력 89.0%였고(박 등, 2007; 조 등, 2011), 본 연구에서도 TM 비율이 88.3～93.7%, PM 비율은 88.3～97.0%로서 연령에 따른 차이가 인정되지 않았다(Table 2).
7%로서 차이가 없었다. 칡소 연령에 따라 생산된 동결정액을 이용한 체외수정란 발달율을 조사한 결과 연령에 따른 차이는 인정되지 않았으며, 인공수정 후 임신율도 비슷한 경향이었다. 이상의 결과를 종합하면 칡한우 수소의 연령에 따른 정액량 차이는 인정되나, 신선 정액의 농도 및 TM 비율, 동결융해 정액의 TM과 PM 비율 및 체외 배반포 발달율과 인공수정 임신율의 차이는 없었다.
칡한우 육성축과 성축 정액의 동결성과 수태능을 검토하기 위하여 첫째, 동결 희석제(Tris-egg yolk extender(Tris-EYE) 및 Triladyl)에 따른 칡한우 정자의 total motility(TM)과 progressive motility(PM) 비율을 조사하였고, 둘째, 15개월령 및 36개월령인 칡한우 수소의 정액량, 신선 및 동결융해 정자의 TM과 PM 비율을 비교하였고, 셋째, 칡한우 연령에 따라 생산된 동결정액의 체외수정란 발달율 및 인공수정 임신율을 검토하였다. 칡한우 정액 동결에 사용하는 희석액에 따른 동결-융해 정액의 TM과 PM 비율은 차이가 없었으나, 칡한우 개체에 따른 TM 비율의 차이는 인정되었다. 칡한우 정액량은 15개월령 수소가 평균 2.
한편, 채정 직후의 신선정자의 TM 비율이 15개월령 및 36개월령이 각각 평균 93.7% 및 88.3%, PM 비율이 각각 97.0% 및 88.3%로서, 특히 PM 비율이 15개월령에서 유의하게 높았다(p<0.05).
후속연구
본 연구의 결과를 종합하면 칡한우 수소의 연령에 따른 정액량 차이는 인정되나, 신선 정액의 농도 및 TM 비율, 동결융해 정액의 TM과 PM 비율 및 체외 배반포 발달율과 인공수정 임신율의 차이는 없었다. 따라서 육성 단계 수소의 동결정액을 활용한다면 칡한우 등의 재래희소가축의 보존과 증식에 기여할 것으로 기대된다.
이상의 결과를 종합하면 칡한우 수소의 연령에 따른 정액량 차이는 인정되나, 신선 정액의 농도 및 TM 비율, 동결융해 정액의 TM과 PM 비율 및 체외 배반포 발달율과 인공수정 임신율의 차이는 없었다. 따라서 육성 단계 수소의 동결정액을 활용한다면 칡한우 등의 희소재래가축의 보존과 증식에 기여할 것으로 기대된다.
성성숙이 완료된 15개월령 수소에서 정액을 채취 · 동결 보존한 후 거세하여 비육 후 자신 또는 형제의 성장률과 육질판정 결과를 바탕으로 씨수소로 선발하는 방법이 칡한우와 같은 소수 재래가축의 개량에 효과적일 것으로 생각된다.
본 연구에서는 채정 직후 정자의 생존율과 직진운동성이 개체간의 차이는 인정되었으나, 희석제에 따른 차이는 없었다(Table 1). 이상의 결과에서 각 희석제의 동결 과정을 고려한다면 상온에서 충진과 봉입이 가능한 Triladyl 희석제의 활용도가 높을 것으로 생각된다. 한편, Triladyl 희석제를 이용하였을 때 칡한우 연령(15 개월령 및 36 개월령)에 따른 동결-융해 정자의 TM과 PM 비율은 차이가 없었다(Fig.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
칡한우를 사육할 때 발생할 수 있는 문제점은?
한우의 털 빛깔은 노란빛을 띤 갈색으로 정의하고 있으나, 현존하고 있는 한우는 모색에 따라 황색을 띄는 한우(Korean Cattle, Bos taurus coreanae), 칡한우(Korean Native Striped Cattle), 흑우(Korean Jeju Black Cattle)로 분류하고, FAO에 등록되어 있다. 칡한우는 전국적으로 1,700여 두가 사육되고 있는 것으로 추정하고 있으나, 번식 가능한 수소의 숫자가 매우 적고, 인공수정보다는 자연 종부를 위주로 하고 있어 근친의 위험에 노출되어 있으며, 털색의 유전 양식이 복잡하여 칡한우 간의 교배로도 칡한우의 특징인 세로줄무늬(호피무늬)가 나타나지 않는 등의 문제점을 가지고 있다. 칡한우에 대한 연구는 유전적 특성(이 등, 2002; 김 등 2011), 정액동결(박 등, 2007; 조 등, 2011), 모색 분포(박 등, 2007; 이 등, 2011) 등 아주 제한적으로 보고되고 있어서 증식과 보존을 위해서는 많은 연구가 필요하다.
한우를 분류하는 방법과 종류는?
한우의 털 빛깔은 노란빛을 띤 갈색으로 정의하고 있으나, 현존하고 있는 한우는 모색에 따라 황색을 띄는 한우(Korean Cattle, Bos taurus coreanae), 칡한우(Korean Native Striped Cattle), 흑우(Korean Jeju Black Cattle)로 분류하고, FAO에 등록되어 있다. 칡한우는 전국적으로 1,700여 두가 사육되고 있는 것으로 추정하고 있으나, 번식 가능한 수소의 숫자가 매우 적고, 인공수정보다는 자연 종부를 위주로 하고 있어 근친의 위험에 노출되어 있으며, 털색의 유전 양식이 복잡하여 칡한우 간의 교배로도 칡한우의 특징인 세로줄무늬(호피무늬)가 나타나지 않는 등의 문제점을 가지고 있다.
육성 단계 수소의 동결정액을 활용한다면 칡한우 등의 재래 희소가축의 보존과 증식에 기여할 것으로 기대되는 본 연구의 결과는?
본 연구의 결과를 종합하면 칡한우 수소의 연령에 따른 정액량 차이는 인정되나, 신선 정액의 농도 및 TM 비율, 동결융해 정액의 TM과 PM 비율 및 체외 배반포 발달율과 인공수정 임신율의 차이는 없었다. 따라서 육성 단계 수소의 동결정액을 활용한다면 칡한우 등의 재래희소가축의 보존과 증식에 기여할 것으로 기대된다.
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