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문제 정의
- 따라서 DNA손상에 대한 1-세포기 수정란의 반응 기작에 대한 이해는 배아 발달 과정을 심도 있게 이해하는데 중요한 정보를 제공할 것이다. 따라서 본 연구에서는 DNA손상에 따른 1-세포기 수정란의 DNA 손상 인식 차이, 배아 발달의 차이를 연구하였다.
- -H2AX의 발현을 확인하였다. 또한, 수정란이 손상된 DNA를 인식할 수 있는지와 부계 DNA손상이 향후 배아 발달에 미치는 영향을 연구하였다.
가설 설정
- Pronuclei were also stained with DAPI (blue) and then visualized by confocal microscopy. F: female pronuclei, M: male pronuclei.
제안 방법
- 1-세포기 수정란에서 γH2AX 발현을 확인함으로써 1-세포기 수정란이 손상된 부계 전핵을 인식하는지 확인하였다.
- 1-세포기 수정란에서 γH2AX 발현 확인은 ICSI 후 각각 5, 9시간째에 이를 확인하였다.
- C, 습도 50 ± 1% 내외, 그리고 12시간 명암 주기(light 8:00-20:00, dark 20:00-8:00)로 유지되는 동물 사육실에서 사육하였다. 1주간의 적응 기간 동안 실험 동물에게 음식과 물을 자유로이 공급하였다. 모든 실험 계획은 전남대학교 동물윤리위원회의 규정에 의거해서 실험하였다.
- Epididymal sperm과 vas deferens sperm을 이용하여 SCF와 SCF-religated가 체외 배발달률에 미치는 영향을 알아보았다(Fig. 5, Table 5 및 Table 6). Epi-Con, Epi-SCF 및 EpiSCF-religated 그룹의 난할률은 각각 97.
- 따라서 본 연구에서는 마우스의 epididymal sperm과 vas deferens sperm에 실험적 조작을 가하여 SCF와 SCF-religated를 유도한 후, 세포질 내 정자미세주입(Intracytoplasmic sperm injection, ICSI)을 이용하여 1세포기 수정란을 만들어 1-세포기 수정란의 전핵에서 γ-H2AX의 발현을 확인하였다.
- 그 후, 실온에서 1시간 동안 BSA로 blocking후 4℃에서 하룻밤 동안 1:300으로 희석시킨 1차 항체에 배양하였다. 배양 후 1세포기 수정란을 0.5% BSA가 함유된 PBST로 10분씩 2회 세척하고 1시간 동안 실온에서 1:1000으로 희석된 형광물질이 붙어있는 2차 항체가 부착되도록 배양하였다. 형광표지 후, 1-세포기 수정란을 PBST로 10분씩, 3회 세척하였다.
- 본 연구에서는 γH2AX가 부분적으로만 관찰된 경우를 partial expression, 전핵 전체에 걸쳐 관찰된 경우를 full expression으로 구분하였다.
- 형광표지 후, 1-세포기 수정란을 PBST로 10분씩, 3회 세척하였다. 슬라이드글라스에 ProLong Gold antifade reagent with DAPI (Invitrogen, USA)를 떨어뜨려 소적을 만들고 수정란을 투여한 후, 커버글라스로 덮고 형광현미경으로 관찰하였다. 1차 항체로 anti-phospho Histone H2AX (Ser139) (Milliopore, USA)를 이용하였다.
- 8-12주령의 마우스의 epididymis 및 vas deferens의 내강 내용물을 분리 추출하여 HCZB (Hepes-CZB) 배양액(Kimura와 Yanagimachi, 1995)에 넣는다. 정자를 HCZB배양액에 넣은 후 피펫팅으로 고르게 섞어준 후 control, SCF 및 SCF-religated 그룹으로 각각 나누었다. Control 그룹의 정자는 실온(room temperature)에서 1시간 30분 동안 배양하였다.
대상 데이터
- 슬라이드글라스에 ProLong Gold antifade reagent with DAPI (Invitrogen, USA)를 떨어뜨려 소적을 만들고 수정란을 투여한 후, 커버글라스로 덮고 형광현미경으로 관찰하였다. 1차 항체로 anti-phospho Histone H2AX (Ser139) (Milliopore, USA)를 이용하였다. 2차 항체는 Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 546 (Invitrogen, USA)을 이용하였다.
- 1차 항체로 anti-phospho Histone H2AX (Ser139) (Milliopore, USA)를 이용하였다. 2차 항체는 Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 546 (Invitrogen, USA)을 이용하였다.
- 8-12주령의 마우스의 epididymis 및 vas deferens의 내강 내용물을 분리 추출하여 HCZB (Hepes-CZB) 배양액(Kimura와 Yanagimachi, 1995)에 넣는다. 정자를 HCZB배양액에 넣은 후 피펫팅으로 고르게 섞어준 후 control, SCF 및 SCF-religated 그룹으로 각각 나누었다.
- 8-12주령의 성숙한 암컷 마우스에 5 IU eCG를 복강 주사하고, 48시간 후 5 IU hCG를 주입하여 과배란을 유도하였다. hCG 주입 후 14-15시간에 난관(oviduct)을 절개하여 배란된 난구세포난자 복합체(cumulus-oocyte complexes)를 방출시켜 0.
- 본 연구에 사용된 마우스는 B6D2F1 (C57BL/6N X DBA/2)으로 온도 23 ± 1oC, 습도 50 ± 1% 내외, 그리고 12시간 명암 주기(light 8:00-20:00, dark 20:00-8:00)로 유지되는 동물 사육실에서 사육하였다.
데이터처리
- 본 연구에서는 각 실험군에 대하여 4회 이상 반복 실험을 실시하였고, 얻어진 모든 실험 결과의 통계 처리는 SPSS software(Version 13.0)를 이용한 일원분산분석법(One-way ANOVA)으로 처리구간 유의성을 검정하였으며, p < 0.05의 유의성 만을 통계학적 차이가 있는 것으로 인정하였다.
이론/모형
- 그 후, 준비된 난자 1개당 1개의 정자 머리를 주입하였다. 난자에 정자 머리(head)의 주입 과정은 Eppendorf Micromanipulators (Micromanipulator Transferman, Eppendorf, Germany)와 Piezo-electric actuator (PMM Controller, model PMAS-CT150, Prime Tech, Tsukuba, Japan)을 이용하여 실시하였다. 제일 먼저 하나의 정자를 주입용 피펫(injection pipette)으로 꼬리(tail)를 우선 흡인한 후 압전 전류(piezo pulse)를 흘려 중편과 꼬리를 떼어 내었다.
성능/효과
- 5, Table 5 및 Table 6). Epi-Con, Epi-SCF 및 EpiSCF-religated 그룹의 난할률은 각각 97.5%, 94.1% 및 92.6%였다. DNA손상이 일어난 Epi-SCF와 Epi-SCF-religated 그룹의 난할률을 비교해봤을 때, 유의적인 차이가 없었다(Table 5).
- Epi-Con, EpiSCF 및 Epi-SCF-religated그룹의 부계와 모계 전핵에서 γH2AX가 full로 발현된 경우는 각각 93.8%, 93.6% 및 100%였다.
- Epididymal sperm과 vas deferens sperm을 이용하여 SCF와 SCF-religated가 γH2AX 발현에 미치는 영향을 알아본 결과, DNA복제 전 Epi-Con그룹 보다 Epi-SCF와 Epi-SCF-religated 그룹의 부계 전핵에서 γH2AX가 관찰된 비율이 유의적으로 높았다.
- Epididymal sperm과 vas deferens sperm을 이용하여 SCF와 SCF-religated가 체외배아발달에 미치는 영향을 알아보기 위해 조사한 난할률은 Epi-Con, Epi-SCF 및 Epi-SCF-religated 그룹 간에 유의적인 차이가 없었다. 이는 epididymal sperm의 DNA에 일정수준의 손상은 정상적인 배아 발달에 부정적인 영향을 미치지 않음을 나타냈다.
- Vas-Con 그룹보다 Vas-SCF와 Vas-SCF-religated 그룹의 난할률이 유의적으로 낮았다(p < 0.05) (Table 6).
- DNA손상이 일어난 Epi-SCF와 Epi-SCF-religated 그룹의 난할률을 비교해봤을 때, 유의적인 차이가 없었다(Table 5). Vas-Con, Vas-SCF 및 Vas-SCF-religated 그룹의 난할률은 각각 94.1%, 37.0% 및 35.0%였다. Vas-Con 그룹보다 Vas-SCF와 Vas-SCF-religated 그룹의 난할률이 유의적으로 낮았다(p < 0.
- Vas-SCF 그룹이 Vas-Con과 Vas-SCF-religated 그룹보다 유의적으로 높았다(p < 0.05).
- Vas-SCF와 Vas-SCF-religated 그룹은 Vas-Con 그룹에 비해 난할률이 유의적으로 낮았다. 이 역시 핵산분해효소에 의한 일정 규모 이상의 광범위한 DNA손상으로 1-세포기 수정란이 이를 손쉽게 인지하고, 이러한 손상된 DNA의 복제를 방지하기 위해 부계 전핵에서 DNA degradation이 일어남으로써 정상적인 배아 발달이 이루어지지 않아 난할률이 저하된 것으로 판단된다.
- 결론적으로, 본 연구에서 DNA복제 전 2가 양이온이 처리되어 SCF를 유도한 정자를 주입하여 만들어진 1-세포기 수정란은 손상된 DNA를 인지하였다. 또한, 1-세포기 수정란이 DNA손상을 인지하고 이러한 DNA 복제를 방지하기 위해 부계 전핵에서 전형적인 세포자살경로와는 다른 기작이 존재하는 것으로 판단되며, 이에 대한 구체적인 경로 파악을 위한 추가 연구가 필요한 것으로 판단된다.
- 그리고, DNA복제 전 Epi-SCF-religated 그룹과 Vas-SCF-religated 그룹 간에 부계 전핵에서 γH2AX가 발현된 1-세포기 수정란의 비율을 비교했을 때, Vas-SCFreligated 그룹이 Epi-SCF-religated 그룹보다 유의적으로 높았다.
- 더불어 Epi-SCF와 VasSCF 그룹 간에 부계 전핵에서 γH2AX가 발현된 1세포기 수정란의 비율을 비교했을 때, Vas-SCF 그룹이 Epi-SCF그룹보다 유의적으로 높았다.
- 따라서, DNA복제 진행 중에 모계 전핵에서도 γH2AX가 발현된 것은 1-세포기 수정란에서 DNA복제 과정 중에 H2AX의 인산화과정이 정상적인 일부로 추정할 수 있었다.
- 4, Table 4). 또한 정자 주입 후 9시간째(DNA합성 진행 중) Vas-SCF와 VasSCF-religated 그룹의 DAPI염색을 보면 DNA degradation이 되어 부계 전핵이 관찰되지 않았다(Fig. 4)
- 또한, Epi-Con, Epi-SCF 및 Epi-SCF-religated 그룹 모두 γH2AX가 부계와 모계 전핵에서 발현된 1-세포기 수정란의 비율이 유의적 차이 없이 높은 비율이었다(Table 3).
- 또한, Vas-Con그룹 보다 Vas-SCF와 Vas-SCF-religated 그룹의 부계 전핵에서 γH2AX가 관찰된 비율이 유의적으로 높았다.
- 정자 주입 후 5시간 째(DNA복제 전) epididymal spermControl (Epi-Con), epididymal sperm-SCF (Epi-SCF) 및 epididymal sperm-SCF-religated (Epi-SCF-religated) 그룹의 전핵에서 γH2AX가 발현되지 않은 경우는 각각 81.0%, 30.7% 및 28.3%였다.
- 정자 주입 후 5시간 째(DNA복제 전) vas deferens spermControl (Vas-Con), vas deferens sperm-SCF (Vas-SCF) 및 vas deferens sperm-SCF-religated (Vas-SCF-religated) 그룹의 전핵에서 γH2AX가 발현되지 않은 경우는 각각 46.6%, 5.8% 및 7.1%였다.
- 정자 주입 후 9시간째(DNA복제 진행 중) Epi-Con, Epi-SCF 및 Epi-SCF-religated그룹의 전핵에서 γH2AX가 발현되지 않은 경우와 부계 전핵에서만 partial로 발현된 경우는 없었다.
- 정자 주입 후 9시간째(DNA복제 진행 중) Vas-Con, Vas-SCF 및 Vas-SCF-religated 그룹의 전핵에서 γH2AX가 모두 발현되었다.
후속연구
- 따라서, DNA복제 진행 중에 모계 전핵에서도 γH2AX가 발현된 것은 1-세포기 수정란에서 DNA복제 과정 중에 H2AX의 인산화과정이 정상적인 일부로 추정할 수 있었다. 다만 정상적인 H2AX 인산화에 대해서는 향후 추가 연구가 필요하다고 생각된다.
- 결론적으로, 본 연구에서 DNA복제 전 2가 양이온이 처리되어 SCF를 유도한 정자를 주입하여 만들어진 1-세포기 수정란은 손상된 DNA를 인지하였다. 또한, 1-세포기 수정란이 DNA손상을 인지하고 이러한 DNA 복제를 방지하기 위해 부계 전핵에서 전형적인 세포자살경로와는 다른 기작이 존재하는 것으로 판단되며, 이에 대한 구체적인 경로 파악을 위한 추가 연구가 필요한 것으로 판단된다.
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