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문제 정의
- 본 연구는 고창갯벌에 자생하고 있는 다양한 염생식물과 공생관계에 있을 것으로 생각되는 내생진균을 분리동정하여 균류들 간의 계통분석을 수행하였고, 염생식물 6개체에 따른 내생진균의 다양성 및 다양성지수를 확인하였다. 내생진균은 자낭균문에 속하는 Capnodiales, Eurotiales, Glomerellales, Hypocreales, Pleosporales, Sordariales, Xylariales에 속하는 다양한 목의 내생진균류들이 분포하는 것을 확인 할 수 있었고, 담자균문에 속하는 목의 분류 체계가 명확하지 않은 Pseudozyma속의 균주가 확인되었다.
- 본 연구는 우리나라 서해안의 고창갯벌에서 자생하고 있는 염생식물의 뿌리로부터 다양한 내생진균들을 분리동정하였다. 그리고 고창갯벌의 다양한 지역에 따른 염생식물의 내생진균의 분포와 다양성지수를 확인하여 내생균류의 계통관계를 확인하였다.
제안 방법
- 1 unit의 Ex-Taq DNA polymerase(Takara, Japan)를 사용하였다. PCR 반응조건은 (95℃, 2 min) predenaturation, (95℃, 30 sec) denaturation, (54.5℃, 1 min) annealing, (72℃, 1 min) extension, (35 cycles) total cycles, (72℃,7 min) final extension 으로 수행하였다. 추출된 genomic DNA는 universal primer ITS1 (5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3')과 ITS4 (5'-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3')를 사용하여 rDNA-ITS 영역을 증폭하여 polymerase chain reaction (PCR)을 수행하였다(You et al.
- 본 연구는 우리나라 서해안의 고창갯벌에서 자생하고 있는 염생식물의 뿌리로부터 다양한 내생진균들을 분리동정하였다. 그리고 고창갯벌의 다양한 지역에 따른 염생식물의 내생진균의 분포와 다양성지수를 확인하여 내생균류의 계통관계를 확인하였다.
- , 2007). 그리고 내생진균의 동정을 위하여 rDNA-ITS 영역의 염기서열을 blastn(NCBI)으로 확인하여 분석하였다. 그리고 내생진균의 다양성 분석을 확인하기 위하여 동정된 균주들의 목(Order)과 속(Genus)을 확인하였고, 다양성지수를 확인하기 위하여 Shannon’s diversity index (H’)를 적용하였으며(Pielou, 1975), 각 식물에 대한 내생진균의 다양성을 분석하였다.
- 1). 그리고 본 연구에서 분리 동정된 내생진균의 계통학적 유의성을 확인하기 위하여 계통수를 작성 하였다(Fig. 2). 그리고 염생식물에 따른 내생진균의 다양성 지수는 SJ(1.
- , 2011). 그리고 증폭된 PCR 산물은 1.5% agarose gel에서 전기영동 후, ethidium bromide (EtBr)을 사용하여 10분 염색 후, UV transilluminator로 전기영동 밴드를 확인 하였다(You et al., 2011). 전기영동 단편들은 QIAquick PCR purification kit (Qiagen Inc.
- , 2009). 내생진균의 순수분리와 배양을 위하여 스트렙토마이신(Streptomycin) 80 ppm이 함유된 최소배지(Hagem minimal medium)를 사용하여 전처리된 염생식물의 뿌리를 25℃ 배양기에서 배양하였다(Vazquez et al., 2000; Yamada et al., 2001). 그리고 배양된 염생식물 뿌리의 끝 단면에서 내생진균을 potato dextrose agar (PDA)에 계대배양하여 순수 분리하였다(Khan et al.
- 내생진균의 염기서열을 ClustalX program을 사용하여 다중정렬을 수행하였고, Lasergene 7 program과 BioEdit program을 사용하여 염기서열을 확인하였다. 내생진균의 계통분석은 MEGA 4.
- 동결건조 수행된 내생진균의 균체는 DNeasy Plant mini kit(QIAgen)를 사용하여 genomic DNA를 추출하였다(Hamayun et al., 2009; Khan et al., 2009). 그리고 templete 조건은 10 mM Tris-HCl(pH 8.
- 염 습지에서 채취한 염생식물의 뿌리에 토양을 수세하여 제거하고, 계면활성제(Tween 80)를 10분간 처리 후, 멸균 증류수(sterile distilled water)로 세척하였으며, 과염소산 (Perchloric acid) 1%에 10분간 2회 처리 후, 멸균증류수로 세척하였다. 그리고 염생식물 뿌리는 전처리과정 후, 수술용가위(operating scissors)로 3~4 cm 길이로 절단하여 수분을 제거하였다(Seo et al.
- , 2011). 염생식물의 뿌리에서 순수 분리한 내생진균들을 배양하기 위하여 potato dextrose broth (PDB)에서 7~14일 동안 100 rpm으로 25℃조건하에서 진탕배양(Shake culture) 하였으며, 내생진균의 균체(Mycobiont)를 여과하여 균주의 동정을 위하여 5일 동안 동결건조하여 샘플로 사용하였다.
- , 2011). 전기영동 단편들은 QIAquick PCR purification kit (Qiagen Inc., Germany)를 사용하여 정제하였고, ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (PE Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용하였으며, DNA 단편들은 ABI 310 DNA sequencer (Perkin Elmer, Foster City, CA, USA)를 사용하여 염기서열들을 결정하였다.
- 추출된 genomic DNA는 universal primer ITS1 (5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3')과 ITS4 (5'-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3')를 사용하여 rDNA-ITS 영역을 증폭하여 polymerase chain reaction (PCR)을 수행하였다(You et al., 2011).
대상 데이터
- 고창갯벌에 자생하고 있는 6개체의 염생식물로부터 형태적으로 다른 내생진균 39점을 분리 및 선별하였다. 분리된 내생진균은 염생식물 SJ로부터 6점, PA로부터 9점, LT로부터 12점, SM으로부터 3점, SJ1으로부터 5점, PA1으로부터 4점으로 39점을 동정하였으며, NCBI의 GenBANK 로부터 모든 균주에 대하여 accession number [JX041061- JX041099]를 제공받았다(Table 2).
- , 2009). 그리고 templete 조건은 10 mM Tris-HCl(pH 8.5), 1.5 mM MgCl2, 200 nM dNTPs, 40 mM KCl, 10 spmol의 primer와 0.1 unit의 Ex-Taq DNA polymerase(Takara, Japan)를 사용하였다. PCR 반응조건은 (95℃, 2 min) predenaturation, (95℃, 30 sec) denaturation, (54.
- 본 연구에서 전라북도 고창군의 고창갯벌에 자생하고 있는 염생식물을 채취하여 실험재료로 사용하였다. 식물시료는 염생식물인 칠면초(Suaeda japonica), 갈대(Phragmites australis), 갯질경(Limonium tetragonum), 해홍나물(Suaeda maritima)을 다양한 지역에서 채취하였으며, 채취한 지역은 Table 1에 표기하였다.
- 본 연구에서 전라북도 고창군의 고창갯벌에 자생하고 있는 염생식물을 채취하여 실험재료로 사용하였다. 식물시료는 염생식물인 칠면초(Suaeda japonica), 갈대(Phragmites australis), 갯질경(Limonium tetragonum), 해홍나물(Suaeda maritima)을 다양한 지역에서 채취하였으며, 채취한 지역은 Table 1에 표기하였다. 그리고 채취한 염생식물은 지역에 따라 식물코드(plant code)로 분류하여 표기하였다.
- 염생식물인 칠면초, 갈대, 갯질경, 해홍나물을 고창갯벌로부터 채집하였으며, 39점의 내생진균을 염습지에 자생하고 있는 염생식물의 뿌리로부터 분리하였다. 내생진균들은 ITS1, 5.
이론/모형
- 고창갯벌에서 자생하는 식물의 뿌리로부터 분리된 내생진균의 유전학적 다양성을 확인하기 위하여 Shannon’s diversity index를 확인 하였다.
- 그리고 내생진균의 다양성 분석을 확인하기 위하여 동정된 균주들의 목(Order)과 속(Genus)을 확인하였고, 다양성지수를 확인하기 위하여 Shannon’s diversity index (H’)를 적용하였으며(Pielou, 1975), 각 식물에 대한 내생진균의 다양성을 분석하였다.
- 내생진균의 염기서열을 ClustalX program을 사용하여 다중정렬을 수행하였고, Lasergene 7 program과 BioEdit program을 사용하여 염기서열을 확인하였다. 내생진균의 계통분석은 MEGA 4.1 program neighbor-joining(NJ) 방법을 이용하여 분석하였다(Tamura et al., 2007). 그리고 내생진균의 동정을 위하여 rDNA-ITS 영역의 염기서열을 blastn(NCBI)으로 확인하여 분석하였다.
성능/효과
- 다양한 내생진균은 Eurotiales (36%), Pleosporales (26%), Hypocreales (18%), Incertae sedis (8%), Glomerellales (5%), Sordariales (2%), Xylariales (2%), Capnodiales (3%)등 8종류 목에 속하는 것으로 확인되었다. 39점의 내생진균은 속(genus)단계에서 Alternaria, Aspergillus, Chaetomium, Cladosporium, Colletotrichum, Coniothyrium, Dothideomycete, Fusarium, Gibberella, Macrophoma, Penicillium, Pestalotiopsis, Phaeosphaeria, Phoma, Pleosporales, Pseudozyma, Talaromyces, 그리고 Termitomyces에 포함되는 것으로 분석되었다. 그리고 내생진균은 Eurotiales목의 Penicillium속이 가장 많이 분포하고 있는 것으로 분석되었다.
- Shannon’s 다양성 지수는 염생식물 중에서 SJ으로부터 분리된 내생진균의 다양성이 1.7918으로 가장 높은 지수로 확인 되었고, SM으로부터 분리된 내생진균의 다양성 지수가 1.0986으로 가장 낮은 지수로 확인되었다.
- 39점의 내생진균은 속(genus)단계에서 Alternaria, Aspergillus, Chaetomium, Cladosporium, Colletotrichum, Coniothyrium, Dothideomycete, Fusarium, Gibberella, Macrophoma, Penicillium, Pestalotiopsis, Phaeosphaeria, Phoma, Pleosporales, Pseudozyma, Talaromyces, 그리고 Termitomyces에 포함되는 것으로 분석되었다. 그리고 내생진균은 Eurotiales목의 Penicillium속이 가장 많이 분포하고 있는 것으로 분석되었다.
- 염생식물 SJ1에서는 Hypocreales목에 속하는 Gibberella속, Fusarium속이 확인 되었고, Eurotiales목의 Penicillium속이 확인 되었으며, Capnodiales목에 속하는 Cladosporium속이 확인되었다. 그리고 염생식물 PA1에서는 자낭균문 Eurotiales목의 Penicillium속, Termitomyces속이 확인되었고, Hypocreales목의 Gibberella속과 Pleosporales목의 Phoma속이 확인 되었다.
- 내생진균의 계통분석은 SJ에서 자낭균문(Ascomycota) 인 Pleosporales목에 속하는 Pleosporales속, Coniothyrium 속, Phoma속과 Capnodiales목에 속하는 Cladosporium속, Eurotiales목의 Talaromyces속이 확인 되었으며, 담자균문(Basidiomycota)에서는 목의 분류체계가 명확하지 않은 Pseudozyma속이 확인 되었다. 그리고 염생식물 PA에서는 자낭균문에 속하는 Hypocreales목의 Fusarium속이 확인 되었고, Pleosporales목 Phoma속, Phaeosphaeria속, Eurotiales목인 Aspergillus속, Glomerellales목에 속하는 Colletotrichum속, 목의 분류체계가 명확하지 않은 Macrophoma 속이 확인 되었다. 염생식물 LT는 Eurotiales목에 속하는 Penicillium속이 확인 되었고, Hypocreales목에 속하는 Fusarium속, Pleosporales목의 Alternaria속, Sordariales목에 속하는 Chaetomium속, Glomerellales목에 속하는 Colletotrichum속, Xylariales목에 속하는 Pestalotiopsis 속, 그리고 목의 분류체계가 명확하지 않은 Dothideomycete속이 확이 되었다.
- 2). 그리고 염생식물에 따른 내생진균의 다양성 지수는 SJ(1.7918), PA(1.6770), LT(1.5890), SM(1.0986), SJ1(1.3322), 그리고 PA1(1.3863)으로 확인 되었다(Table 3).
- 본 연구는 고창갯벌에 자생하고 있는 다양한 염생식물과 공생관계에 있을 것으로 생각되는 내생진균을 분리동정하여 균류들 간의 계통분석을 수행하였고, 염생식물 6개체에 따른 내생진균의 다양성 및 다양성지수를 확인하였다. 내생진균은 자낭균문에 속하는 Capnodiales, Eurotiales, Glomerellales, Hypocreales, Pleosporales, Sordariales, Xylariales에 속하는 다양한 목의 내생진균류들이 분포하는 것을 확인 할 수 있었고, 담자균문에 속하는 목의 분류 체계가 명확하지 않은 Pseudozyma속의 균주가 확인되었다.
- 내생진균의 계통분석은 SJ에서 자낭균문(Ascomycota) 인 Pleosporales목에 속하는 Pleosporales속, Coniothyrium 속, Phoma속과 Capnodiales목에 속하는 Cladosporium속, Eurotiales목의 Talaromyces속이 확인 되었으며, 담자균문(Basidiomycota)에서는 목의 분류체계가 명확하지 않은 Pseudozyma속이 확인 되었다. 그리고 염생식물 PA에서는 자낭균문에 속하는 Hypocreales목의 Fusarium속이 확인 되었고, Pleosporales목 Phoma속, Phaeosphaeria속, Eurotiales목인 Aspergillus속, Glomerellales목에 속하는 Colletotrichum속, 목의 분류체계가 명확하지 않은 Macrophoma 속이 확인 되었다.
- 8s와 ITS2를 포함하는 ITS-rDNA 영역에 의해 분석되었다. 다양한 내생진균은 Eurotiales (36%), Pleosporales (26%), Hypocreales (18%), Incertae sedis (8%), Glomerellales (5%), Sordariales (2%), Xylariales (2%), Capnodiales (3%)등 8종류 목에 속하는 것으로 확인되었다. 39점의 내생진균은 속(genus)단계에서 Alternaria, Aspergillus, Chaetomium, Cladosporium, Colletotrichum, Coniothyrium, Dothideomycete, Fusarium, Gibberella, Macrophoma, Penicillium, Pestalotiopsis, Phaeosphaeria, Phoma, Pleosporales, Pseudozyma, Talaromyces, 그리고 Termitomyces에 포함되는 것으로 분석되었다.
- 고창갯벌에서 자생하는 식물의 뿌리로부터 분리된 내생진균의 유전학적 다양성을 확인하기 위하여 Shannon’s diversity index를 확인 하였다. 모든 내생진균은 SJ에서 6속, PA에서 6속, LT에서는 7속, SM에서는 3속, SJ1에서는 4속, PA1에서는 4속의 내생진균류가 확인 되었으며, 분리된 내생진균을 목과 속으로 분류하여 각 구성비(%)를 나타내었다(Fig. 1). 그리고 본 연구에서 분리 동정된 내생진균의 계통학적 유의성을 확인하기 위하여 계통수를 작성 하였다(Fig.
- 고창갯벌에 자생하고 있는 6개체의 염생식물로부터 형태적으로 다른 내생진균 39점을 분리 및 선별하였다. 분리된 내생진균은 염생식물 SJ로부터 6점, PA로부터 9점, LT로부터 12점, SM으로부터 3점, SJ1으로부터 5점, PA1으로부터 4점으로 39점을 동정하였으며, NCBI의 GenBANK 로부터 모든 균주에 대하여 accession number [JX041061- JX041099]를 제공받았다(Table 2).
- 그리고 염생식물 PA에서는 자낭균문에 속하는 Hypocreales목의 Fusarium속이 확인 되었고, Pleosporales목 Phoma속, Phaeosphaeria속, Eurotiales목인 Aspergillus속, Glomerellales목에 속하는 Colletotrichum속, 목의 분류체계가 명확하지 않은 Macrophoma 속이 확인 되었다. 염생식물 LT는 Eurotiales목에 속하는 Penicillium속이 확인 되었고, Hypocreales목에 속하는 Fusarium속, Pleosporales목의 Alternaria속, Sordariales목에 속하는 Chaetomium속, Glomerellales목에 속하는 Colletotrichum속, Xylariales목에 속하는 Pestalotiopsis 속, 그리고 목의 분류체계가 명확하지 않은 Dothideomycete속이 확이 되었다. 염생식물 SM에서는 자낭균문 Pleosporales목에 속하는 Alternaria속, Pleosporales 속이 확인 되었고, Eurotiales목의 Penicillium속이 확인되었다.
- 염생식물 SM에서는 자낭균문 Pleosporales목에 속하는 Alternaria속, Pleosporales 속이 확인 되었고, Eurotiales목의 Penicillium속이 확인되었다. 염생식물 SJ1에서는 Hypocreales목에 속하는 Gibberella속, Fusarium속이 확인 되었고, Eurotiales목의 Penicillium속이 확인 되었으며, Capnodiales목에 속하는 Cladosporium속이 확인되었다. 그리고 염생식물 PA1에서는 자낭균문 Eurotiales목의 Penicillium속, Termitomyces속이 확인되었고, Hypocreales목의 Gibberella속과 Pleosporales목의 Phoma속이 확인 되었다.
- 염생식물 LT는 Eurotiales목에 속하는 Penicillium속이 확인 되었고, Hypocreales목에 속하는 Fusarium속, Pleosporales목의 Alternaria속, Sordariales목에 속하는 Chaetomium속, Glomerellales목에 속하는 Colletotrichum속, Xylariales목에 속하는 Pestalotiopsis 속, 그리고 목의 분류체계가 명확하지 않은 Dothideomycete속이 확이 되었다. 염생식물 SM에서는 자낭균문 Pleosporales목에 속하는 Alternaria속, Pleosporales 속이 확인 되었고, Eurotiales목의 Penicillium속이 확인되었다. 염생식물 SJ1에서는 Hypocreales목에 속하는 Gibberella속, Fusarium속이 확인 되었고, Eurotiales목의 Penicillium속이 확인 되었으며, Capnodiales목에 속하는 Cladosporium속이 확인되었다.
후속연구
- 0986으로 가장 낮은 지수로 확인되었다. 본 연구에서는 우리나라의 다양한 염습지 중에서 고창갯벌에 자생하는 염생식물의 뿌리로부터 내생진균류의 분포 및 다양성을 확인하였고, 본 연구를 기반으로 다른 응용 연구 및 분류체계가 명확하지 않은 균류의 연구가 필요할 것이며, 염 농도 및 특수한 조건을 가지는 환경에서 균류 자원연구에 기초자료가 될 것이라 생각된다.
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