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문제 정의
- 이들 연구에 이용되는 전반적인 카페인의 농도는 시중에서 해열 진통제로서 판매되고 있는 AAP tablet에 들어 있는 카페인 평균함량으로서(10), 식이 음료 중 광범위하게 함유되어있는 카페인 성분을 고려할 때 다양한 농도에 의한 여러 약물과의 빈번한 상호작용이 예상되나 이에 대한 연구는 아직 미비한 상태이다. 따라서 본 연구에서는 카페인이 AAP를 비롯한 Asp 및 Ibu의 일반의약품들과같이 섭취되었을 때 일어날 수 있는 상호작용 및 이로 인한 영향을 장관계 세포모델에서 조사하였으며, 정상 세포와 암 세포에서의 독성 및 세포증식에 대한 효과를 비교하였다.
- AAP를 비롯한 약물의 독성발현에 GSH 수준이 밀접하게 관련 되어 있는 것으로 알려졌는데, 특히 AAP과 카페인의 혼용할 경우 카페인이 간세포에서 GSH 수준을 저하시켜 AAP의 독성을 강화시키는 것이 보고되었다(18,19). 따라서 카페인과의 각 약물의 복합처리에 의한 세포 독성과 GSH 수준변화 간의 관계를 파악하기 위해 약물 및 카페인을 단독 또는 복합 처리한 세포 내의 GSH 수준을 mBBr을 이용하여 조사하였다. mBBr은 thiol group과 특이적으로 반응하여 형광을 나타내는데, 세포 내 대표적 thiol성인 물질 GSH의 검출에 널리 이용되는 물질이다(20).
- 이러한 현상이 암 세포와 정상 세포의 일반적 경향인지, 아니면 세포 특이적인 현상인지는 향후 계속적인 연구를 통한 확인이 필요할 것으로 사료된다. 본 연구는 식이 중 널리 포함되는 카페인과 일반의약품이 함께 섭취되었을 때 발생할 수 있는 상호작용에 대한 기초 자료를 제공하며, 그간 간세포 중심으로 연구되어왔던 약물의 세포 독성 평가와는 달리, 섭취한 성분들의 체내 흡수 및 각 조직으로의 분배 전에 고농도로 노출될 수 있으며 빈번한 직접적인 상호작용이 발생할 수 있는 장관계 세포를 타깃으로 진행되었다는 점에서 기존 연구와 차별을 둘 수 있을 것으로 사료된다.
가설 설정
- Structure of caffeine (A) and effects of caffeine and the OTC drugs on viability of the intestinal cells. (B) Concentrationdependent effects of caffeine on viability of INT 407 and HCT 116 cells after 24 h incubation. INT 407 and HCT 116 cells were incubated with different concentrations of caffeine and the OTC drugs.
제안 방법
- 모든 실험결과는 평균±표준편차로 나타내었고, 각 실험군별 유의차 분석은 One-way ANOVA와 Tukey’s HSD test를 실시하여 95와 99%의 유의수준에서 검정하였다. IC50값은 카페인 및 각 약물의 단독처리에 따른 농도별 세포의 사멸 결과로부터 직선부위에 대한 선형회귀식을 구하고 50% 사멸을 일으키는 농도를 계산하였다.
- , Seoul, Korea)에서 분양 받았으며, 인간 대장암 세포주 HCT 116는 American Type Culture Collection(Manassas, VA, USA)에서 구입하였다. INT 407 세포와 HCT 116 세포는 10% 우태아 혈청(fetal bovine serum, FBS)과 100 unit/mL penicillin, 0.1 mg/mL streptomycin이 포함된 MEM, RPMI 1640 배지에서 각각 배양하였고, INT 407 세포를 위한 MEM 배지에는 추가로 1% nonessential amino acid를 첨가하였다. 모든 세포주는 약 80% confluency에 도달하였을 때 계대배양하였고, 습도 95%, 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 배양하였다.
- INT 407과 HCT 116 세포를 96 well plate에서 위와 동일한 방법으로 배양한 후, 카페인과 일반의약품 성분 Ibu, Asp, AAP를 serum free 배지에 농도를 달리하여 200µL씩 단독 또는 복합처리 하였다.
- 다양한 식품 중에 널리 분포되어 있는 생리활성 성분 카페인과 일반의약품 성분 AAP, Asp 및 Ibu와의 혼용 시 상호작용에 의한 세포 독성 변화를 장관계 세포모델에서 조사하였다. 카페인은 정상 장관계 세포 INT 407 및 대장암 세포 HCT 116에 농도의존적인 독성을 나타내었고, IC50 수치는 각각 1.
- 49 mg으로 보고된 바 있다(16). 따라서 일반의약품 성분과의 혼용이 빈번하게 일어날 수 있으며, 이에 의한 독성발현 여부를 알아보기 위해 카페인과 약물을 INT 407 및 HCT 116 세포에 복합처리한 후 세포 독성의 변화를 평가하였다. 카페인 0.
- 식이 중의 생리활성 성분들이 약물과 동시에 섭취되어 상호작용도 발생할 수 있지만, 식이성분 섭취 전후에 따른 약물복용도 빈번히 발생할 수 있다. 따라서 카페인 처리 후 약물에 대한 반응 및 약물 처리 후 카페인에 대한 반응을 파악하기 위해 시간 차를 두고 세포에 처리한 후 세포 독성 변화를 조사하였다. 카페인(0.
- 1 mg/mL streptomycin이 포함된 MEM, RPMI 1640 배지에서 각각 배양하였고, INT 407 세포를 위한 MEM 배지에는 추가로 1% nonessential amino acid를 첨가하였다. 모든 세포주는 약 80% confluency에 도달하였을 때 계대배양하였고, 습도 95%, 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 배양하였다.
- 이 후, mBBr 용액을 제거하고 PBS를 50 µL씩 첨가하여 washing한 뒤, 다시 PBS를 well당 100 µL씩 넣어 excitation 360 nm와 emission 465 nm의 조건에서 형광값을 측정하였다(SpectraMax M3; Molecular Devices Inc., Sunnyvale, CA, USA).
- 카페인 및 약물에 의한 세포 독성은 이들을 형질전환 인간 정상장관계 INT 407 세포와 인간대장암 HCT 116 세포에 처리한 후 생존세포에 의한 MTT 환원능을 비교하여 평가하였다. INT 407 및 HCT 116 세포에 카페인 농도를 달리하여 24시간 처리한 후 세포생존율을 평가한 결과, INT 407 세포에서 더 강한 세포독성이 발현되었다(IC50 value, 1.
- 카페인 후처리구에서는 INT 407 및 HCT 116 세포에 위와 동일한 농도의 약물을 24시간 동안 처리한 후, 이어서 카페인으로 교체하여 24시간 더 처리하였다. 카페인 선처리구보다 후처리구에서 비교적 세포 독성이 더 강하게 발현되었으나, 전체적으로 선처리구와 유사한 양상을 나타내었다(Fig.
- 세포에 처리하기 전 카페인 및 Ibu와 Asp는 처리농도에서 10%이내의 미미한 DPPH 라디칼 소거활성을 나타낸 반면 10 mM AAP는 40% 정도의 현저한 소거활성을 나타내었으며, 카페인과 각 약물의 혼합에 의한 유의적인 소거활성의 변화는 나타나지 않았다(data not shown). 카페인과 약물의 처리에 의해 세포 내 GSH에 비교적 큰 변화를 보인 HCT 116 세포에 동일한 조건으로 2시간 처리한 후, 세포 배양액의 DPPH 라디칼 소거활성을 측정하였다. 카페인 단독처리군에서 약간의 활성감소가 나타났으나, 약물과의 복합처리에 의해 유의적인 변화는 나타나지 않았다(Fig.
- 카페인과 일반 의약품의 단독 또는 복합 처리 시 세포 내 GSH를 비롯한 thiol성 물질 함량의 변화는 monobromobimane(mBBr) 을 이용하여 측정하였다. INT 407과 HCT 116 세포를 96 well plate에서 위와 동일한 방법으로 배양한 후, 카페인과 일반의약품 성분 Ibu, Asp, AAP를 serum free 배지에 농도를 달리하여 200µL씩 단독 또는 복합처리 하였다.
- 한편 카페인과 약물의 처리 시 세포 배양액의 환원력 변화를 DPPH 라디칼 소거활성으로 측정하였다. 세포에 처리하기 전 카페인 및 Ibu와 Asp는 처리농도에서 10%이내의 미미한 DPPH 라디칼 소거활성을 나타낸 반면 10 mM AAP는 40% 정도의 현저한 소거활성을 나타내었으며, 카페인과 각 약물의 혼합에 의한 유의적인 소거활성의 변화는 나타나지 않았다(data not shown).
대상 데이터
- AAP는 Fluka chemical Co.(Buchs, Swizerland)에서 구입하였다. 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) 시약은 Amresco Inc.
- 카페인, Ibu, Asp, 그리고 AAP는 dimethyl sulfoxide(DMSO)에 용해시키고 1회 분량씩 나누어 −80℃ 초저온 냉동고(Ilshin Bio Base, Bucheon, Korea)에서 보관하여 사용하였다. 인간 형질전환 정상 장관계 세포주 INT 407는 고려대학교 김태성 교수 실험실(Korea Univ., Seoul, Korea)에서 분양 받았으며, 인간 대장암 세포주 HCT 116는 American Type Culture Collection(Manassas, VA, USA)에서 구입하였다. INT 407 세포와 HCT 116 세포는 10% 우태아 혈청(fetal bovine serum, FBS)과 100 unit/mL penicillin, 0.
데이터처리
- Different letters indicate a significant difference (p<0.05) among relative toxicities of the drug under conditions of caffeine treatment based on one-way ANOVA and the Tukey’s HSD test.
- Different letters indicate a significant difference (p<0.05) based on one-way ANOVA and the Tukey’s HSD test (in B).
- Different letters indicate a significant difference (p<0.05) based on one-way ANOVA and the Tukey’s HSD test.
- Significantly different each other according to Student’s t-test (**, p<0.01).
- 모든 실험결과는 평균±표준편차로 나타내었고, 각 실험군별 유의차 분석은 One-way ANOVA와 Tukey’s HSD test를 실시하여 95와 99%의 유의수준에서 검정하였다.
성능/효과
-
3A). HCT 116 세포에 2 mM Ibu, 10 mM Asp와 AAP를 처리한 결과, 각각 24, 54 및 87%의 세포생존율을 나타내어 Ibu의 독성이 INT 407에서 보다 강하게 발현된 반면 AAP는 약한 독성을 나타낸
Fig. 1C의 결과와 일치하였다. 각 약물의 처리상태를 기준으로 하여 카페인의 상대독성을 계산한 결과 0. - 카페인 및 약물에 의한 세포 독성은 이들을 형질전환 인간 정상장관계 INT 407 세포와 인간대장암 HCT 116 세포에 처리한 후 생존세포에 의한 MTT 환원능을 비교하여 평가하였다. INT 407 및 HCT 116 세포에 카페인 농도를 달리하여 24시간 처리한 후 세포생존율을 평가한 결과, INT 407 세포에서 더 강한 세포독성이 발현되었다(IC50 value, 1.91 vs. 2.45 mM) (Fig. 1B and C).
- 5A and B). INT 407에서 카페인 처리상태를 기준으로 한 상대적 독성을 평가하였을 때(Fig. 5의 통계처리는 상대독성 결과에 근거 하여 나타냄), Ibu와 Asp의 독성이 유의적으로 증가하였고 AAP의 독성은 감소하는 것으로 나타났으나(Fig. 5A) 그 증가와 감소폭은 최대 6.7%이내였다(data not shown). 한편 카페인을 선처리 한 HCT 116 세포에서 모든 약물의 상대적 독성이 유의적으로 증가하는 것으로 나타났으며(Fig.
- 3C). INT 407와 HCT 116 세포의 전체적인 양상을 비교 하였을 때, 카페인과 약물의 복합처리에 의한 상대적인 독성강화 현상이 정상 세포주인 INT 407에서 주로 나타났으나, HCT 116세포에서는 AAP를 제외한 약물들의 독성이 약화되었다. 이러한 현상은 일반적으로 암 세포에 발달된 약물내성 기작 때문으로 사료되나(17), 개별 세포의 특성에 의한 현상일 수도 있으며 관련 기작 연구가 더 진행되어야 할 것으로 보인다.
- mBBr은 thiol group과 특이적으로 반응하여 형광을 나타내는데, 세포 내 대표적 thiol성인 물질 GSH의 검출에 널리 이용되는 물질이다(20). 각 세포에 카페인을 2시간 동안 단독처리한 결과, INT 407 세포에서는 GSH를 비롯한 thiol성 물질의 세포 내 수준에 차이가 없었 으며, 1 mM 카페인을 처리한 HCT 116 세포에서 약 12%정도의 유의적인 감소현상이 나타났다. 약물의 단독처리 시에 INT 407세포에서는 Ibu와 AAP 처리군에서 유의적인 GSH의 감소현상을보였으며, HCT 116 세포에서는 2 mM Ibu와 10 mM Asp 및 AAP 존재 시 각각 37, 25 및 13% 정도 GSH 수준이 현저하게 감소하였다(Fig.
- 1C의 결과와 일치하였다. 각 약물의 처리상태를 기준으로 하여 카페인의 상대독성을 계산한 결과 0.5와 1 mM의 카페인농도에서 일관된 독성의 증가나 감소현상은 나타나지 않았다(Fig. 3B). 한편 카페인 처리 상태에서 각 약물의 상대적 독성을 비교하였을 때 Ibu와 Asp의 독성이 오히려 감소하는 것으로 나타났으며, 카페인과 같이 처리한 AAP의 상대독성은 유의적으로 증가하였다(Fig.
- 카페인과 각각의 약물을 세포에 24시간 동시 처리한 결과 전체적으로 현저한 독성의 변화현상은 발생하지 않았으나, 약물처리 시를 기준으로 한 카페인의 상대적 독성 및 카페인 처리 시를 기준으로 한 약물의 독성이 INT 407 세포에서 유의적으로 증가하였다. 동시 처리 시 약물에 의해 감소된 GSH를 비롯한 thiol성 물질의 세포내 수준이 카페인 존재 시에 유의적으로 증가하였다. 한편 카페인과 약물을 각각 순서를 달리하여 전후로 처리하였을 때, 특히 HCT 116 세포에서의 약물의 상대적인 독성이 강화되는 현상을 보였다.
- 1C). 반면, AAP의 경우 암 세포주인 HCT 116보다 정상 세포주인 INT 407에서 높은 독성을 나타내었으며, IC50값은 각각 12.5와 7.6 mM 로써 정상세포에서 유의적으로 낮았다(Fig. 1C). Asp은 두 종류의 세포에 유사한 효과를 나타내었는데, Asp가 HCT 116 세포에 더 강한 독성을 보인 현상을 제외하고 선행보고와 대체적으로 유사한 경향을 나타내었다(15).
- 한편 카페인과 약물의 처리 시 세포 배양액의 환원력 변화를 DPPH 라디칼 소거활성으로 측정하였다. 세포에 처리하기 전 카페인 및 Ibu와 Asp는 처리농도에서 10%이내의 미미한 DPPH 라디칼 소거활성을 나타낸 반면 10 mM AAP는 40% 정도의 현저한 소거활성을 나타내었으며, 카페인과 각 약물의 혼합에 의한 유의적인 소거활성의 변화는 나타나지 않았다(data not shown). 카페인과 약물의 처리에 의해 세포 내 GSH에 비교적 큰 변화를 보인 HCT 116 세포에 동일한 조건으로 2시간 처리한 후, 세포 배양액의 DPPH 라디칼 소거활성을 측정하였다.
- 5D). 시간차를 두고 처리하였을 때 HCT 116 세포에서 주로 약물의 독성이 강화되는 현상을 나타내었으며, INT 407 세포에서 약물의 상대독성이 일관되게 증가하였던 동시 처리 시의 현상과는 다소 상이한 결과였다. 이러한 현상은 특히 카페인 전처리에 의해 HCT 116 세포의 약물에 대한 감수성이 증가하였거나, 카페인에 의해 야기된 HCT 116 세포 손상의 빠른 회복 등이 원인으로 사료되며 보다 면밀한 기작 검토가 필요할 것으로 보인다.
- 각 세포에 카페인을 2시간 동안 단독처리한 결과, INT 407 세포에서는 GSH를 비롯한 thiol성 물질의 세포 내 수준에 차이가 없었 으며, 1 mM 카페인을 처리한 HCT 116 세포에서 약 12%정도의 유의적인 감소현상이 나타났다. 약물의 단독처리 시에 INT 407세포에서는 Ibu와 AAP 처리군에서 유의적인 GSH의 감소현상을보였으며, HCT 116 세포에서는 2 mM Ibu와 10 mM Asp 및 AAP 존재 시 각각 37, 25 및 13% 정도 GSH 수준이 현저하게 감소하였다(Fig. 4A and B). 흥미롭게도 약물과 카페인을 동시 처리에 의해 대부분의 경우 GSH 수준이 유의적으로 증가하는 것으로 나타났으며, 특히 AAP와 카페인의 복합처리에 의한 GSH 수준의 증가가 두드러졌다(Fig.
- 2A), 동시 처리에 의한 독성발현 양상이 부가적 또는 상승적 현상인지를 파악하기 위해 각 조건을 기준으로 한 상대독성을 산출하였다. 우선 각 약물의 처리상태를 기준으로 하여 카페인의 상대적 독성을 평가한 결과, 0.5 mM 카페인의 독성에는 유의적 차이가 없었으나, 1 mM 카페인의 독성이 유의적으로 증가하였고 특히, Ibu와 함께 처리 시 독성의 증가가 가장 현저하게 나타났다(Fig. 2B). 한편 카페인 처리 시를 기준으로 하여 각 약물독성을 평가한 결과, 1 mM 카페인 존재 하에 공통적으로 약물 독성이 강화되는 현상을 나타내었다(Fig.
- 4A and B). 이상의 결과는 GSH 고갈에 의해 약물독성이 강화되었을 것이라는 예상과는 달리, 세포 독성 유발 시 세포의 방어기작으로서 GSH 수준의 증가가 일어난다는 선행보고(21,22)와 관련된 현상으로 파악된다.
- 이상의 결과를 종합해 보면 카페인과 일반의약품 AAP, Asp 및 Ibu를 장관계 세포에 다양한 방법으로 처리하였을 때 약물의 상대독성이 일부 증가하는 것으로 나타났으며, INT 407 정상 장관계 세포에서는 동시 처리 시에, HCT 116 대장암 세포에서는 시간차를 둔 처리 시에 약물의 독성이 증가하는 경향을 보였다. 이러한 현상이 암 세포와 정상 세포의 일반적 경향인지, 아니면 세포 특이적인 현상인지는 향후 계속적인 연구를 통한 확인이 필요할 것으로 사료된다.
- 일반의약품 성분 Ibu, Asp, AAP는 INT 407과 HCT 116 세포에서 농도 의존적으로 세포 독성효과를 나타내었고, 특히 Ibu가 다른 약물에 비하여 강한 세포 독성을 보였는데, 대장암 세포 HCT 116과 정상 세포 INT 407에 각각 1.0과 1.8 mM의 IC50값을 나타내어 암세포에 유의적으로 높은 독성을 발현하였다(Fig. 1C). 반면, AAP의 경우 암 세포주인 HCT 116보다 정상 세포주인 INT 407에서 높은 독성을 나타내었으며, IC50값은 각각 12.
- 따라서 일반의약품 성분과의 혼용이 빈번하게 일어날 수 있으며, 이에 의한 독성발현 여부를 알아보기 위해 카페인과 약물을 INT 407 및 HCT 116 세포에 복합처리한 후 세포 독성의 변화를 평가하였다. 카페인 0.5, 1 mM을 정상 장관계 세포주인 INT 407에 단독으로 처리하였을 때 각각 17과 29%가 저하된 세포생존율을 나타내었으며, 2 mM Ibu, 10 mM Asp와 AAP를 단독으로 처리한 세포에서는 40-50% 사이의 생존율을 보였다. 카페인과 약물을 동시에 처리하였을 경우 카페인 농도 증가에 따른 약물의 독성 증가도 현저하게 나타났는데(Fig.
- 카페인 후처리구에서는 INT 407 및 HCT 116 세포에 위와 동일한 농도의 약물을 24시간 동안 처리한 후, 이어서 카페인으로 교체하여 24시간 더 처리하였다. 카페인 선처리구보다 후처리구에서 비교적 세포 독성이 더 강하게 발현되었으나, 전체적으로 선처리구와 유사한 양상을 나타내었다(Fig. 5C and D). INT 407세포에서 카페인 처리상태를 기준으로 하여 약물의 상대적인 독성을 계산하였을 때, 단지 Ibu의 독성이 유의적으로 증가하였고 그 증가폭도 4%이내였다(Fig.
- 따라서 카페인 처리 후 약물에 대한 반응 및 약물 처리 후 카페인에 대한 반응을 파악하기 위해 시간 차를 두고 세포에 처리한 후 세포 독성 변화를 조사하였다. 카페인(0.5 or 1 mM)을 24시간 선처리한 후, 2 mM Ibu, 5 mM Asp 또는 10 mM AAP로 교체하고 24시간 더 처리하여 세포사멸 정도를 측정하였을 때, HCT 116보다 INT 407에서 카페인의 단독 독성이 다소 강하게 나타났고, 카페인과 약물의 전후 처리에 의한 세포 독성의 현저한 증가나 감소는 관찰되지 않았다(Fig. 5A and B). INT 407에서 카페인 처리상태를 기준으로 한 상대적 독성을 평가하였을 때(Fig.
- 45 mM로써 정상세포에 유의적으로 높은 독성을 나타내었다. 카페인과 각각의 약물을 세포에 24시간 동시 처리한 결과 전체적으로 현저한 독성의 변화현상은 발생하지 않았으나, 약물처리 시를 기준으로 한 카페인의 상대적 독성 및 카페인 처리 시를 기준으로 한 약물의 독성이 INT 407 세포에서 유의적으로 증가하였다. 동시 처리 시 약물에 의해 감소된 GSH를 비롯한 thiol성 물질의 세포내 수준이 카페인 존재 시에 유의적으로 증가하였다.
-
2C). 카페인은 대장암 세포주 HCT 116에서 INT 407 세포에 비해 다소 감소된 독성을 나타내었는데 0.5, 1 mM을 처리하였을 때 각각 15 및 27%정도의 세포 성장이 감소되었다(Fig. 3A). HCT 116 세포에 2 mM Ibu, 10 mM Asp와 AAP를 처리한 결과, 각각 24, 54 및 87%의 세포생존율을 나타내어 Ibu의 독성이 INT 407에서 보다 강하게 발현된 반면 AAP는 약한 독성을 나타낸
- 다양한 식품 중에 널리 분포되어 있는 생리활성 성분 카페인과 일반의약품 성분 AAP, Asp 및 Ibu와의 혼용 시 상호작용에 의한 세포 독성 변화를 장관계 세포모델에서 조사하였다. 카페인은 정상 장관계 세포 INT 407 및 대장암 세포 HCT 116에 농도의존적인 독성을 나타내었고, IC50 수치는 각각 1.91과 2.45 mM로써 정상세포에 유의적으로 높은 독성을 나타내었다. 카페인과 각각의 약물을 세포에 24시간 동시 처리한 결과 전체적으로 현저한 독성의 변화현상은 발생하지 않았으나, 약물처리 시를 기준으로 한 카페인의 상대적 독성 및 카페인 처리 시를 기준으로 한 약물의 독성이 INT 407 세포에서 유의적으로 증가하였다.
- 4C). 특히 AAP를 처리한 배양액에서는 40%이상의 DPPH 라디칼 소거활성을 나타내었으나, 카페인과의 복합처리에 의한 변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과에 근거하여 세포 외액의 항산화 활성이 특히 AAP를 처리한 세포의 GSH 재생에 일부 영향을 주었을 것으로 사료되며 자세한 기작에 대한 연구가 진행되어야 할 것으로 보인다.
- 5C). 하지만 HCT 116에서는 모든 약물의 상대적 독성이 유의적으로 증가하였으며 Asp의 증가 폭이 가장 큰 것으로 나타났다(Fig. 5D). 시간차를 두고 처리하였을 때 HCT 116 세포에서 주로 약물의 독성이 강화되는 현상을 나타내었으며, INT 407 세포에서 약물의 상대독성이 일관되게 증가하였던 동시 처리 시의 현상과는 다소 상이한 결과였다.
- 3B). 한편 카페인 처리 상태에서 각 약물의 상대적 독성을 비교하였을 때 Ibu와 Asp의 독성이 오히려 감소하는 것으로 나타났으며, 카페인과 같이 처리한 AAP의 상대독성은 유의적으로 증가하였다(Fig. 3C). INT 407와 HCT 116 세포의 전체적인 양상을 비교 하였을 때, 카페인과 약물의 복합처리에 의한 상대적인 독성강화 현상이 정상 세포주인 INT 407에서 주로 나타났으나, HCT 116세포에서는 AAP를 제외한 약물들의 독성이 약화되었다.
- 2B). 한편 카페인 처리 시를 기준으로 하여 각 약물독성을 평가한 결과, 1 mM 카페인 존재 하에 공통적으로 약물 독성이 강화되는 현상을 나타내었다(Fig. 2C). 카페인은 대장암 세포주 HCT 116에서 INT 407 세포에 비해 다소 감소된 독성을 나타내었는데 0.
- 동시 처리 시 약물에 의해 감소된 GSH를 비롯한 thiol성 물질의 세포내 수준이 카페인 존재 시에 유의적으로 증가하였다. 한편 카페인과 약물을 각각 순서를 달리하여 전후로 처리하였을 때, 특히 HCT 116 세포에서의 약물의 상대적인 독성이 강화되는 현상을 보였다. 일반의약품 AAP, Asp 및 Ibu과 카페인을 다양한 조합에 의해 장관계 세포에 처리하였을 때 일부 상대적인 독성의 강화 또는 약화 현상이 나타났으나 전체적으로 두드러진 독성발현 빛 활성변화는 발견되지 않았다.
- 7%이내였다(data not shown). 한편 카페인을 선처리 한 HCT 116 세포에서 모든 약물의 상대적 독성이 유의적으로 증가하는 것으로 나타났으며(Fig. 5B), 특히 Ibu와 Asp의 상대독성이 15-20%정도 증가하였다(data not shown).
- 4A and B). 흥미롭게도 약물과 카페인을 동시 처리에 의해 대부분의 경우 GSH 수준이 유의적으로 증가하는 것으로 나타났으며, 특히 AAP와 카페인의 복합처리에 의한 GSH 수준의 증가가 두드러졌다(Fig. 4A and B). 이상의 결과는 GSH 고갈에 의해 약물독성이 강화되었을 것이라는 예상과는 달리, 세포 독성 유발 시 세포의 방어기작으로서 GSH 수준의 증가가 일어난다는 선행보고(21,22)와 관련된 현상으로 파악된다.
후속연구
- INT 407와 HCT 116 세포의 전체적인 양상을 비교 하였을 때, 카페인과 약물의 복합처리에 의한 상대적인 독성강화 현상이 정상 세포주인 INT 407에서 주로 나타났으나, HCT 116세포에서는 AAP를 제외한 약물들의 독성이 약화되었다. 이러한 현상은 일반적으로 암 세포에 발달된 약물내성 기작 때문으로 사료되나(17), 개별 세포의 특성에 의한 현상일 수도 있으며 관련 기작 연구가 더 진행되어야 할 것으로 보인다.
- 시간차를 두고 처리하였을 때 HCT 116 세포에서 주로 약물의 독성이 강화되는 현상을 나타내었으며, INT 407 세포에서 약물의 상대독성이 일관되게 증가하였던 동시 처리 시의 현상과는 다소 상이한 결과였다. 이러한 현상은 특히 카페인 전처리에 의해 HCT 116 세포의 약물에 대한 감수성이 증가하였거나, 카페인에 의해 야기된 HCT 116 세포 손상의 빠른 회복 등이 원인으로 사료되며 보다 면밀한 기작 검토가 필요할 것으로 보인다.
- 이상의 결과를 종합해 보면 카페인과 일반의약품 AAP, Asp 및 Ibu를 장관계 세포에 다양한 방법으로 처리하였을 때 약물의 상대독성이 일부 증가하는 것으로 나타났으며, INT 407 정상 장관계 세포에서는 동시 처리 시에, HCT 116 대장암 세포에서는 시간차를 둔 처리 시에 약물의 독성이 증가하는 경향을 보였다. 이러한 현상이 암 세포와 정상 세포의 일반적 경향인지, 아니면 세포 특이적인 현상인지는 향후 계속적인 연구를 통한 확인이 필요할 것으로 사료된다. 본 연구는 식이 중 널리 포함되는 카페인과 일반의약품이 함께 섭취되었을 때 발생할 수 있는 상호작용에 대한 기초 자료를 제공하며, 그간 간세포 중심으로 연구되어왔던 약물의 세포 독성 평가와는 달리, 섭취한 성분들의 체내 흡수 및 각 조직으로의 분배 전에 고농도로 노출될 수 있으며 빈번한 직접적인 상호작용이 발생할 수 있는 장관계 세포를 타깃으로 진행되었다는 점에서 기존 연구와 차별을 둘 수 있을 것으로 사료된다.
- 특히 AAP를 처리한 배양액에서는 40%이상의 DPPH 라디칼 소거활성을 나타내었으나, 카페인과의 복합처리에 의한 변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과에 근거하여 세포 외액의 항산화 활성이 특히 AAP를 처리한 세포의 GSH 재생에 일부 영향을 주었을 것으로 사료되며 자세한 기작에 대한 연구가 진행되어야 할 것으로 보인다.
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