[논문]고삼의 인체 대장암세포에 미치는 효과

김민철; 이희정; 임보라; 김형우; 김병주

[국내논문] 고삼의 인체 대장암세포에 미치는 효과
Effects of Sophorae Radix on Human Colorectal Adenocarcinoma Cells 원문보기

동의생리병리학회지 = Journal of physiology & pathology in Korean Medicine, v.26 no.2, 2012년, pp.155 - 159

김민철 (부산대학교 한의학전문대학원 양생기능의학부) , 이희정 (부산대학교 한의학전문대학원 양생기능의학부) , 임보라 (부산대학교 한의학전문대학원 양생기능의학부) , 김형우 (부산대학교 한의학전문대학원 약물의학부) , 김병주 (부산대학교 한의학전문대학원 양생기능의학부)

Abstract ▼ AI-Helper

The purpose of this study was to investigate the anti-cancer effects of Sophorae Radix and the effects of 5-Fluorouracil (5-FU) in human colorectal adenocarcinoma cells (HT-29). We used human colorectal adenocarcinoma cell line, HT-29 cells. We examined cell death by MTT assay and caspase 3 assay with Sophorae Radix. To examine the inhibitory effects of Sophorae Radix, cell cycle (sub G1) analysis was done the HT-29 cells after three days with Sophorae Radix. The reversibility of Sophorae Radix was examined on one day to five days treatment with $150{\mu}g$ Sophorae Radix. Sophorae Radix inhibited the growth of HT-29 cells in a dose-dependent fashion. Also we showed that Sophorae Radix induced apoptosis in HT-29 cells by MTT assay, caspase 3 assay and sub-G1 analysis. Sophorae Radix combined with 5-FU markedly inhibited the growth of HT-29 cells compared to Sophorae Radix or 5-FU alone. After 3 days treatment of HT-29 cells with Sophorae Radix, the fraction of cells in sub-G1 phase was much higher than that of the control group. Our findings provide insight into unraveling the effects of Sophorae Radix in human colorectal adenocarcinoma cells and developing therapeutic agents against colorectal cancer.

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AI 본문요약
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문제 정의

이에 본 연구에서는 고삼추출물을 이용하여 현재 발생비율이 꾸준히 증가하고 있어 사회적인 문제가 되고 있는 대장암세포에서의 항암효과를 알아보고 항암제에 대한 병용투여로 항암의 효과를 증진시키는 효과를 관찰하고자 한다.
따라서 대장암의 치료 및 예방에 많은 연구가 진행중에 있으며 본 연구에서도 고삼에 의한 대장암 세포에서의 효과를 알아 보았다.
본 연구에서는 고삼추출물에 의한 대장암 세포인 HT-29세포에서의 항암작용을 조사해 보았다. 2일과 4일후에 농도에 의존적으로 고삼추출물에 의해 HT-29세포가 사멸되는 효과를 보았고, caspase 3과 sub-G1 analysis를 통해서 세포 사멸에 apoptosis가 관여함을 알 수 있었다.
또한 그 외 다양한 한약제제에 의한 항암제와의 병용효과는 많이 연구되고 있는데 Mitomycin C를 이용하여 백혈구병 세포인 MOLT-4에 9가지 보익제들의 효과를 본 연구도 있고²⁸⁾, 생약복합제제와 항암제의 병용투여로 효과를 본 연구²⁹⁾도 있다. 본 논문은 고삼에 항암제의 효과를 본 논문으로 많이 사용되는 항암제중에 고삼과 함께 투여시 좋은 병용효과를 보이는 것을 확인했고, 암세포중에서도 현재 급증하고 있는 대장암에서의 효과를 본 점에 의의가 있다고 사료된다.

제안 방법

세척되고 세절된 상태로 구입된 苦蔘 50 g을 분쇄기로 분쇄한 다음, 에탄올 1,000 ml를 이용하여 상온에서 48시간 추출하였다. 추출액을 원심분리하여 얻은 상층액을 와트만지 (Watman paper)를 이용하여 2회 반복 여과한 후, 감압농축기(EYELA, Japan)를 이용하여 감압 농축하였다. 감압 농축된 추출액은 동결 건조되었으며, 최종적으로 얻어진 추출물은 6.
세포 생존율 측정은 세포 배양판 (12-well)에 암세포를 1 ml 씩 분주하여 24시간 이상 배양 후 고삼추출물을 다양한 농도로 처리한 다음, 37℃, 5% CO₂ 하에서 48시간 또는 72시간 배양한 후, MTT용액 (5 mg/ml)을 배양액 최종 부피의 1/10되게 첨가하였다. 3시간 후 배양액을 제거하고 형성된 formazan 침전물을 dimethyl sulfoxide (DMSO) 1 ml로 녹여서 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
고삼추출물이 HT-29세포의 증식을 억제하는데 있어서 세포주기의 어느 단계를 지연시키는지 flow cytometry를 이용하여 분석하였다. 고삼추출물을 첨가한 배지에서 3일간 배양된 AGS세포를 PBS용액으로 세척한 후, 4℃에서 30분간 70% ethanol로 고정하였다.
고삼추출물을 첨가한 배지에서 3일간 배양된 AGS세포를 PBS용액으로 세척한 후, 4℃에서 30분간 70% ethanol로 고정하였다. 고정후 propidium iodide (Sigma, USA)로 DNA를 염색하여 Becton Dickinson FACStar Flow Cytometry를 이용하여 세포주기를 비교 분석하였다.
고삼추출물에 의한 세포사가 apoptosis에 의한 것인지 확인하기 위하여 농도별로 세포사멸의 진행 정도를 알아보았다. Caspase는 cystinyl aspartate-specific protease로 세포질에서 pro-form으로 존재하고 특정 위치의 proteolytic 과정에 의해 활성화된다.
고삼추출물에 의한 세포사가 apoptosis에 의한 것인지 확인하기 위하여 flow cytometry를 이용한 세포주기 sub-G1분석을 실시하였다. Apoptosis가 일어나면 기존의 fluorescence peak가 왼쪽으로 이동해 새로운 sub-G1 fluorescence peak가 만들어 진다.
고삼추출물이 HT-29세포의 증식 억제 작용의 가역성을 보기 위해, 대조군과 고삼추출물 150 ㎍/ml을 첨가하여 24시간 동안 배양시킨 후 고삼추출물을 제거한 군, 그리고 고삼추출물 150 ㎍/ml을 첨가해서 계속 그대로 두 군으로 나누어 관찰하였다. 접종 후 24시간 뒤에 고삼추출물을 첨가하여 24시간 배양했다가 첨가한 고삼추출물을 제거한 날, 즉 접종 1일째는 제거군과 제거하지 않은 군에서의 억제성이 차이가 없었고, 대조군 보다는 유의하게 낮았다.

대상 데이터

본 실험에 사용된 고삼(苦蔘, Sophorae radix, SR)은 콩과에 속한 고삼 Sophora flavescens Aiton의 주피를 벗긴 근으로 2010년 10월 경북 상주에서 생산된 것을 화림제약 (부산, 한국)을 통하여 구입하였다. 세척되고 세절된 상태로 구입된 苦蔘 50 g을 분쇄기로 분쇄한 다음, 에탄올 1,000 ml를 이용하여 상온에서 48시간 추출하였다.
이 실험에 사용한 인체 위암세포는 서울대학교 암세포주 은행에서 구입한 대장암 세포주 HT-29이며, adenocarcinoma의 histopathology 특징을 나타내고 있다.
Caspase 3 assay kits를 BioMol (Plymouth, PA, USA)에서 구입하여 측정하였다. 405 nm의 흡광도에서 여러 번 측정하였다.

데이터처리

대조군과 실험군 사이의 통계학적 유의성 검정은 SPSS 16.0(SPSS Inc, Chicago)의 Independent t-test를 사용하였으며 유의수준 p<0.05를 사용하였다.

성능/효과

추출액을 원심분리하여 얻은 상층액을 와트만지 (Watman paper)를 이용하여 2회 반복 여과한 후, 감압농축기(EYELA, Japan)를 이용하여 감압 농축하였다. 감압 농축된 추출액은 동결 건조되었으며, 최종적으로 얻어진 추출물은 6.43 g으로 수율은 12.9%였다.
암세포 살상 효과를 측정하기 위하여 50, 100, 150, 200 ㎍/ml의 농도로 각각 3회씩 시험한 결과 고삼추출물에 의한 HT-29에서의 효과 2일후인 (A)에서는 150 ㎍/ml 이상에서 암세포 살상 효과를 볼 수 있었으며, 4일후인 (B)에서는 50 ㎍/ml 이상에서 뚜렷한 암세포 살상 효과를 볼 수 있었다(Fig. 1). A에 있어서는 MTT assay로 50 ㎍/ml에서 99.
1%의 결과를 보였다. 이러한 결과는 A, B 모두 통계적으로 유의하게 암세포 살상 효과가 있다는 것을 확인한 결과로 HT-29에서는 고삼추출물에 의해서 2일후에는 150 ㎍/ml이상 농도에서 항암작용이 나타나고, 4일후에서는 50 ㎍/ml 이상 농도에서 뚜렷한 항암작용이 있음을 의미한다.
5-Fluorouracil (5-FU) 10 μM과 고삼추출물 50 ㎍을 같이 첨가한 군의 세포억제는 약 31%로 5-FU만을 첨가한 군(약 11% 억제) 및 고삼추출물만을 첨가한 군(약 15% 억제)에 비해서 세포 억제가 현저히 증가하였다.
5-FU 100 μM과 고삼추출물 150 ㎍을 병용 투여 하였을 때에는 약 93% 억제로 세포가 거의 없을 정도로 그 증식 억제 작용이 뚜렷하였다(Table 1).
그리고 5-FU 100 μM과 고삼추출물을 병용 첨가했을 때에도 농도에 따르는 증식억제 효과가 각각을 따로 첨가 했을 때보다도 현저하게 증식억제 효과가 증가함을 알 수 있었다.
고삼추출물의 농도를 높였을 때는 더욱 현저하여, 고삼추출물 150 ㎍을 5-FU 10 μM과 병용 첨가했을 때에는 배양 3일째 대조군에 비해서 약 62%의 억제 작용을 보였다.
이로 인해 세포의 DNA 복제 및 유전자 발현과 관련된 단백질 및 핵의 구조 유지, 세포의 항상성 유지 등과 관련된 단백질들을 파괴시키거나 관련된 단백질을 활성화시켜 apoptosis를 유도하게 된다. Caspase 3 activity를 측정한 결과 고삼추출물에 의해 caspase 3 activity가 증가함을 알 수 있다(Fig. 2).
Apoptosis가 일어나면 기존의 fluorescence peak가 왼쪽으로 이동해 새로운 sub-G1 fluorescence peak가 만들어 진다. 고삼추출물에 의한 Sub-G1 분석 결과 고삼추출물 농도에 비례해서 sub-G1 peak가 증가함을 알 수 있다(Fig. 3).
고삼추출물이 HT-29세포의 증식 억제 작용의 가역성을 보기 위해, 대조군과 고삼추출물 150 ㎍/ml을 첨가하여 24시간 동안 배양시킨 후 고삼추출물을 제거한 군, 그리고 고삼추출물 150 ㎍/ml을 첨가해서 계속 그대로 두 군으로 나누어 관찰하였다. 접종 후 24시간 뒤에 고삼추출물을 첨가하여 24시간 배양했다가 첨가한 고삼추출물을 제거한 날, 즉 접종 1일째는 제거군과 제거하지 않은 군에서의 억제성이 차이가 없었고, 대조군 보다는 유의하게 낮았다. 고삼추출물을 제거한지 3일째 즉 접종 4일째 제거군의 세포억제는 거의 회복되었고 제거하지 않았던 군의 세포억제 약 46 % 보다 세포수가 현저히 많았다.
접종 후 24시간 뒤에 고삼추출물을 첨가하여 24시간 배양했다가 첨가한 고삼추출물을 제거한 날, 즉 접종 1일째는 제거군과 제거하지 않은 군에서의 억제성이 차이가 없었고, 대조군 보다는 유의하게 낮았다. 고삼추출물을 제거한지 3일째 즉 접종 4일째 제거군의 세포억제는 거의 회복되었고 제거하지 않았던 군의 세포억제 약 46 % 보다 세포수가 현저히 많았다. 이러한 경향은 시간이 흐를수록 더욱 현저해짐을 알 수 있다(Fig.
본 연구에서는 고삼추출물에 의한 대장암 세포인 HT-29세포에서의 항암작용을 조사해 보았다. 2일과 4일후에 농도에 의존적으로 고삼추출물에 의해 HT-29세포가 사멸되는 효과를 보았고, caspase 3과 sub-G1 analysis를 통해서 세포 사멸에 apoptosis가 관여함을 알 수 있었다. 또 고삼추출물에 의한 세포독성에 가역성이 존재함을 확인하였고, 고삼추출물과 5-FU와의 병용투여로 5-FU만 투여시보다 좀 더 나은 세포 사멸을 확인 하였다.
2일과 4일후에 농도에 의존적으로 고삼추출물에 의해 HT-29세포가 사멸되는 효과를 보았고, caspase 3과 sub-G1 analysis를 통해서 세포 사멸에 apoptosis가 관여함을 알 수 있었다. 또 고삼추출물에 의한 세포독성에 가역성이 존재함을 확인하였고, 고삼추출물과 5-FU와의 병용투여로 5-FU만 투여시보다 좀 더 나은 세포 사멸을 확인 하였다.

후속연구

최근 이러한 관심에 천연물 식품 및 신약의 개발이 급속히 증가하고 있다. 따라서 고삼과 같은 한약재를 이용한 항암효과에 대한 체계적인 연구가 이루어진다면, 그리고 항암작용이 있는 고삼을 이용한 천연물 신약이 개발된다면 많은 암환자들의 삶의 질 향상에 도움이 될 것이다. 더 나아가 치료약물로써의 개발 이외에도 고삼의 효능을 이용하여 사전에 암 발생을 차단할 수 있는 예방약물로써의 역할도 기대해 볼만하다.
따라서 고삼과 같은 한약재를 이용한 항암효과에 대한 체계적인 연구가 이루어진다면, 그리고 항암작용이 있는 고삼을 이용한 천연물 신약이 개발된다면 많은 암환자들의 삶의 질 향상에 도움이 될 것이다. 더 나아가 치료약물로써의 개발 이외에도 고삼의 효능을 이용하여 사전에 암 발생을 차단할 수 있는 예방약물로써의 역할도 기대해 볼만하다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	고삼은 무엇인가?	고삼은 콩과에 속하는 다년생 초본식물인 도독놈의 지팡이(Sophora flavescens Aition)라는 식물의 뿌리로 한방에서는 이 식물의 뿌리를 약재로 이용한다6). 우리나라 전역에 자생하고 성질은 차고 무독하며 강한 쓴맛을 지니고 있으며7) 항(抗)부정맥 등에 효능이 있다고 알려져 있다8).
	한방추출물로부터 항암활성을 갖는 물질을 분리하여 암치료에 적용시키려는 이유는 무엇인가?	대장암은 대장의 가장 안쪽 표면인 점막에서 발생하는 아주 흔한 암으로써 최근 식생활 등의 환경요인이 서구화되어 감에 따라 그 발생빈도는 계속 증가하고 있어 우리나라의 경우 소화기암 중에서는 위암 다음으로 두 번째로 흔히 발생하는 병이다15). 대장암의 치료는 수술적 요법에 방사선 치료 및 화학요법을 병행하여 사용하고 있으며 대부분 효율적이지만 잘 알려진 바와 같이 심각한 부작용을 가지는 cytotoxic 화학 치료 요법에 기반을 두고 있기 때문에 문제가 되고 있다. 따라서 최근에는 한방추출물로부터 항암활성을 갖는 물질을 분리하고 이를 암치료에 적용하려는 시도가 많이 이루어지고 있는 추세이다16).
	대장암의 발병요인은 무엇인가?	대장암은 일반적으로 ‘선진국형’ 암으로 인식되어 왔으나 우리나라에서도 생활방식이 점차 서구화되어 감에 따라 1980년대 이후 그 발병률이 꾸준히 증가하고 있는 실정이다. 암의 원인은 유전적 인자와 환경적 인자의 복합작용으로 발생하는데 대장암의 발병은 유전적 요인보다 식이, 환경적 요인이 크게 작용하는 것으로 생각되고 있다1). 육체적 활동량이 많은 직업에서 대장암 발병률이 낮아진다는 보고도 있고, 일본에 거주하는 일본인보다 하와이나 캘리포니아에 거주하는 이민간 일본인 1세와 2세에서 대장암의 발병률이 높거나2) 동물성 지방질과 육류를 많이 섭취하는 미국이나 유럽에 사는 사람들에게 대장암이 많이 발생한다는 점을 들 수 있다3).

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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