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문제 정의
- 본 연구에서는 고삼에 의한 위암 세포인 AGS세포에서의 항암작용을 조사해 보았다. 2일과 4일후에 농도에 의존적으로 고삼에 의해 AGS세포가 사멸되는 효과를 보았고 (Figure 1), caspase 3과 sub-G1 analysis를 통해서 세포 사멸에 apoptosis가 관여함을 알 수 있었다 (Figure 2와 3).
- 하지만 항암제로서의 고삼 효과와 항암제의 효과를 증가시키는 보조제로서의 역할에 관한 체계적인 연구는 이루어지지 않았다. 이에 본 연구에서는 고삼 추출물을 이용하여 위암세포에서의 항암효과를 알아보고 항암제에 대한 병용투여로 항암의 효과를 증진시키는 효과를 관찰하고자 한다.
제안 방법
- 고삼에 의한 세포사가 apoptosis에 의한 것인지 확인하기 위하여 flow cytometry를 이용한 세포주기 sub-G1분석을 실시 하였다. Apoptosis가 일어나면 기존의 fluorescence peak가 왼쪽으로 이동해 새로운 sub-G1 fluorescence peak가 만들어 진다.
- 고삼에 의한 세포사가 apoptosis에 의한 것인지 확인하기 위하여 농도별로 세포사멸의 진행 정도를 알아보았다. Caspase는 cystinyl aspartate-specific protease로 세포질에서 pro-form으로 존재하고 특정 위치의 proteolytic 과정에 의해 활성화된다.
- 고삼이 AGS세포의 증식 억제 작용의 가역성을 보기 위해, 대조군과 고삼 100 ㎍/ml을 첨가하여 24시간 동안 배양시킨 후 고삼을 제거한 군, 그리고 고삼 100 ㎍/ml을 첨가해서 계속 그대로 둔 군으로 나누어 관찰하였다. 접종 후 24시간 뒤에 고삼을 첨가하여 24시간 배양했다가 첨가한 고삼을 제거한 날, 즉 접종 1일째는 제거군과 제거하지 않은 군에서의 억제성이 차이가 없었고, 대조군 보다는 유의하게 낮았다.
- 고삼이 AGS세포의 증식을 억제하는데 있어서 세포 주기의 어느 단계를 지연시키는지 flow cytometry를 이용하여 분석하였다. 고삼을 첨가한 배지에서 3일간 배양된 AGS세포를 PBS용액으로 세척한 후, 4℃에서 30분간 70% ethanol로 고정하였다.
- 고삼을 첨가한 배지에서 3일간 배양된 AGS세포를 PBS용액으로 세척한 후, 4℃에서 30분간 70% ethanol로 고정하였다. 고정후 propidium iodide (Sigma, USA)로 DNA를 염색하여 Becton Dickinson FACStar Flow Cytometry를 이용하여 세포주기를 비교 분석하였다.
- 세포 생존율 측정은 세포 배양판(12-well)에 암세포를 1 ml씩 분주하여 24시간 이상 배양 후 고삼추출물을 다양한 농도로 처리한 다음, 37℃, 5% CO2 하에서 72시간 배양한 후, MTT용액 (5 mg/ml)을 배양액 최종 부피의 1/10되게 첨가 하였다. 3시간 후 배양액을 제거하고 형성된 formazan 침전물을 dimethyl sulfoxide (DMSO) 1 ml로 녹여서 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 세척되고 세절된 상태로 구입된 苦蔘 50 g을 분쇄기로 분쇄한 다음, 에탄올 1,000 ml를 이용하여 상온에서 48시간 추출하였다. 추출액을 원심분리하여 얻은 상층액을와트만지 (Watman paper)를 이용하여 2회 반복 여과한 후, 감압농축기 (EYELA, Japan)를 이용하여 감압농축하였다. 감압 농축된 추출액은 동결 건조되었으며, 최종적으로 얻어진 추출물은 6.
대상 데이터
- Caspase 3 assay kits를 BioMol (Plymouth, PA, USA)에서 구입하여 측정하였다. 405 nm의 흡광도에서 여러 번 측정하였다.
- 본 실험에 사용된 고삼(苦蔘, Sophorae radix, SR)은 콩과에 속한 고삼 Sophora flavescens Aiton의 주피를 벗긴 근으로 2010년 10월 경북 상주에서 생산된 것을 화림제약 (부산, 한국)을 통하여 구입하였다. 세척되고 세절된 상태로 구입된 苦蔘 50 g을 분쇄기로 분쇄한 다음, 에탄올 1,000 ml를 이용하여 상온에서 48시간 추출하였다.
- 이 실험에 사용한 인체 유방암세포는 서울대학교 암세포주 은행에서 구입한 위암 세포주 AGS이며, adenocarcinoma의 histopathology 특징을 나타내고 있다.
데이터처리
- 대조군과 실험군 사이의 통계학적 유의성 검정은 SPSS 16.0 (SPSS Inc, Chicago)의 Independent t-test를 사용하였으며 유의수준 p<0.05를 사용하였다.
성능/효과
- 따라서 아직도 많은 경우의 진행위암 환자들은 위암의 진단법이나 조직학적 분류, 분자학적 생물학 및 치료법에 많은 진전이 있었음에도 불구하고 비록 근치적 절제 수술을 시행 받았더라도, 수술 후 국소재발이나 원격전이가 많아 예후가 나쁘기 때문에 고식적이기는 하여도 항암화학요법의 중요성이 증폭되고 있다.1.2) 현재 사용하고 있는 항암제들은 생체에 대한 독성이 심하여 정상적인 세포의 대사를 크게 억제하여 항암제의 사용에 커다란 장애로 나타나고 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여 부작용이 적은 새로운 항암제의 개발에 중점을 두고 있으며 특히 천연물로부터 유용한 항암제를 개발하려는 노력이 시도되고 있다.
- 본 연구에서는 고삼에 의한 위암 세포인 AGS세포에서의 항암작용을 조사해 보았다. 2일과 4일후에 농도에 의존적으로 고삼에 의해 AGS세포가 사멸되는 효과를 보았고 (Figure 1), caspase 3과 sub-G1 analysis를 통해서 세포 사멸에 apoptosis가 관여함을 알 수 있었다 (Figure 2와 3). 또 고삼에 의한 세포독성에 가역성이 존재함을 확인하였고 (Figure 4), 고삼과 5-FU와의 병용투여로 5-FU만 투여시 보다 좀 더 나은 세포 사멸을 확인하였다 (Figure 5).
- 4) 우리나라 전역에 자생하고 성질은 차고 무독하며 강한 쓴맛을 지니고 있으며5) 항부정맥 등에 효능이 있다고 알려져 있다.6) 또한 한방에서는 황달, 간질, 해열, 이뇨, 진통, 구충제 내복용으로 쓰이고 있으며, 강장제로 민간 약제로 이용되어 왔다.
- 5-Fluorouracil (5-FU) 3 μM과 고삼 50 ㎍/ml을 같이 첨가한 군의 세포억제는 약 35 %로 5-FU만을 첨가한 군(약 12 % 억제) 및 고삼만을 첨가한 군(약 11 % 억제)에 비해서 세포 억제가 현저히 증가하였다.
- 고삼에 의한 항암효과는 많은 논문에서 연구가 되어지고 있다. 간 세포성 암(hepatocellular carcinoma) 세포에서 proapoptotic protein Bax의 발현이 증가되고, NF-kappa B 기전이 억제되어 항암효과가 나타났다.10-11) 유방암세포에서는 Bcl-2/Bax의 비율이 감소되고, VEGF (vascular endothelial growth factor)와 VEGFR (vascular endothelial growth factor receptor)-2의 발현이 감소되며, caspase-3와 caspase-9의 활성이 증가되어 항암효과가 나타난다고 알려지고 있다.
- 추출액을 원심분리하여 얻은 상층액을와트만지 (Watman paper)를 이용하여 2회 반복 여과한 후, 감압농축기 (EYELA, Japan)를 이용하여 감압농축하였다. 감압 농축된 추출액은 동결 건조되었으며, 최종적으로 얻어진 추출물은 6.43 g으로 수율은 12.9%였다.
- 접종 후 24시간 뒤에 고삼을 첨가하여 24시간 배양했다가 첨가한 고삼을 제거한 날, 즉 접종 1일째는 제거군과 제거하지 않은 군에서의 억제성이 차이가 없었고, 대조군 보다는 유의하게 낮았다. 고삼을 제거한지 3일째 즉 접종 4일째 제거군의 세포억제는 약 5 %정도로 제거하지 않았던 군의 세포억제 약 45 % 보다 세포수가 현저히 많았다. 이러한 경향은 시간이 흐를수록 더욱 현저해짐을 알 수 있다 (Figure 4).
- 그리고 5-FU 10 μM과 고삼을 병용 첨가했을 때에도 농도에 따르는 증식억제 효과가 각각을 따로 첨가 했을 때 보다도 현저하게 증식억제 효과가 증가함을 알 수 있었다.
- 고삼에 의한 위암 세포주에서의 효과는 여러 논문에서 보여주고 있다. 누드마우스에서 이식된 위암세포에서 고삼과 5-FU의 병용투여시 고삼과 5-FU만의 단독 투여시보다 위암세포 사멸효과가 좋게 나왔고, 조혈 골수 세포도 감소시키는 것으로 나왔다.27) 또한 SGC-7901 인간 위암 세포주에서는 고삼에 의한 항암 효과에 autophagy 현상도 함께 나타나 apoptosis와 항암효과의 기전으로 제시하였다.
- 2일과 4일후에 농도에 의존적으로 고삼에 의해 AGS세포가 사멸되는 효과를 보았고 (Figure 1), caspase 3과 sub-G1 analysis를 통해서 세포 사멸에 apoptosis가 관여함을 알 수 있었다 (Figure 2와 3). 또 고삼에 의한 세포독성에 가역성이 존재함을 확인하였고 (Figure 4), 고삼과 5-FU와의 병용투여로 5-FU만 투여시 보다 좀 더 나은 세포 사멸을 확인하였다 (Figure 5). 앞으로 어떤 분자적 기전에 의해 고삼에 의한 세포사멸이 나타나는지를 연구할 예정이며, 다양한 세포막 이온통로가 세포사멸에 관여한다는 보고가 있으므로 이온통로의 관련성을 연구할 예정이다.
- 등이 발표한 홍화에 의한 항암제와의 병용투여로위암세포주인 AGS에서는 cisplatin, MKN에서는 Doxorubicin에 의한 세포 사멸효과가 탁월함을 확인 하였다. 본 논문에서도 고삼 단독 투여보다는 항암제와의 병용투여시 항암제의 농도를 줄일 수 있음을 알 수 있었다. 따라서 홍화와 고삼과 같은 한약제를 이용한 항암효과에 대한 체계적인 연구가 이루어 진다면, 그리고 항암작용이 있는 홍화와 고삼을 이용한 건강보조식품 등이 개발된다면 많은 암환자들의 삶의 질 향상에 도움이 될 것으로 생각된다.
- 암세포 살상 효과를 측정하기 위하여 100, 150, 200, 300 ㎍/ml의 농도로 각각 3회씩 시험한 결과고삼에 의한 AGS에서의 효과 2일후인 (A)에서는 200 ㎍/ml 이상에서 암세포 살상 효과를 볼 수 있었으며, 4일후인 (B)에서는 100 ㎍/ml 이상에서 뚜렷한 암세포 살상 효과를 볼 수 있었다 (Figure. 1). A에 있어서는 MTT assay로 100 ㎍/ml에서 90.
- 9 %의 결과를 보였다. 이러한 결과는 A, B 모두 통계적으로 유의하게 암세포 살상 효과가 있다는 것을 확인한 결과로 AGS는 고삼에 의해서 100 ㎍/ml 이상 농도에서 항암작용이 나타나고, 4일후에서는 150 ㎍/ml 이상 농도에서 뚜렷한 항암작용이 있음을 의미한다.
- 고삼이 AGS세포의 증식 억제 작용의 가역성을 보기 위해, 대조군과 고삼 100 ㎍/ml을 첨가하여 24시간 동안 배양시킨 후 고삼을 제거한 군, 그리고 고삼 100 ㎍/ml을 첨가해서 계속 그대로 둔 군으로 나누어 관찰하였다. 접종 후 24시간 뒤에 고삼을 첨가하여 24시간 배양했다가 첨가한 고삼을 제거한 날, 즉 접종 1일째는 제거군과 제거하지 않은 군에서의 억제성이 차이가 없었고, 대조군 보다는 유의하게 낮았다. 고삼을 제거한지 3일째 즉 접종 4일째 제거군의 세포억제는 약 5 %정도로 제거하지 않았던 군의 세포억제 약 45 % 보다 세포수가 현저히 많았다.
후속연구
- 본 논문에서도 고삼 단독 투여보다는 항암제와의 병용투여시 항암제의 농도를 줄일 수 있음을 알 수 있었다. 따라서 홍화와 고삼과 같은 한약제를 이용한 항암효과에 대한 체계적인 연구가 이루어 진다면, 그리고 항암작용이 있는 홍화와 고삼을 이용한 건강보조식품 등이 개발된다면 많은 암환자들의 삶의 질 향상에 도움이 될 것으로 생각된다.
- 또 고삼에 의한 세포독성에 가역성이 존재함을 확인하였고 (Figure 4), 고삼과 5-FU와의 병용투여로 5-FU만 투여시 보다 좀 더 나은 세포 사멸을 확인하였다 (Figure 5). 앞으로 어떤 분자적 기전에 의해 고삼에 의한 세포사멸이 나타나는지를 연구할 예정이며, 다양한 세포막 이온통로가 세포사멸에 관여한다는 보고가 있으므로 이온통로의 관련성을 연구할 예정이다.
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