[논문]파골세포 분화에 복령 추출물이 미치는 영향

천윤희; 곽성철; 오재민; 최민규; 김정중; 곽한복; 이명수; 전병훈; 문서영

파골세포 분화에 복령 추출물이 미치는 영향
Effect of Hoelen in RANKL-induced Osteoclast Differentiation 원문보기

동의생리병리학회지 = Journal of physiology & pathology in Korean Medicine, v.26 no.3, 2012년, pp.320 - 324

천윤희 (원광대학교 의과대학 해부학교실 & 골격계질환연구소 및 환경과학연구소) , 곽성철 (원광대학교 의과대학 해부학교실 & 골격계질환연구소 및 환경과학연구소) , 오재민 (원광대학교 의과대학 해부학교실 & 골격계질환연구소 및 환경과학연구소) , 최민규 (원광대학교 의과대학 해부학교실 & 골격계질환연구소 및 환경과학연구소) , 김정중 (원광대학교 의과대학 해부학교실 & 골격계질환연구소 및 환경과학연구소) , 곽한복 (원광대학교 의과대학 해부학교실 & 골격계질환연구소 및 환경과학연구소) , 이명수 (원광대학교 의과대학 류마티스내과학교실 및 골격계질환연구소) , 전병훈 (원광대학교 한의과대학 병리학교실 & 한국전통의학연구소) , 문서영 (산본병원 마취통증의학과)

Abstract ▼ AI-Helper

Osteoporosis is an important public health issue in postmenopausal women. It is a major public health concern and is widely believed that osteoporosis results from imbalance between bone resorption and bone formation. Recently natural products from plants have been extensively studied as therapeutic drugs to treat and prevent various diseases. Hoelen (scientific name, Poria cocos) is a mushroom that is used in traditional Chinese medicine. Hoelen exhibits anti-inflammatory activity and has a protective effect on tumor progression. However, the effect of hoelen in osteoclast differentiation remains unknown. Thus, we examined the effect of hoelen in receptor activator of nuclear factor-${\kappa}B$ ligand (RANKL)-induced osteoclast differentiation. Hoelen significantly inhibited RANKL-induced osteoclast differentiation in bone marrow-derived macrophages (BMMs) in dose dependent manner without toxicity. Also, we showed that hoelen significantly inhibited the mRNA expression of tartrate-resistant acid phophatase (TRAP) and nuclear factor of activated T cells 1 (NFATc1) in BMMs treated with RANKL. In Particular, hoelen greatly inhibited the protein expression of NFATc1. Ectopic expression of NFATc1 partially reverses hoelen-mediated inhibition of osteoclast differentiation. Taken together, our results demonstrated that hoelen may be useful treatment option of bone-related disease such as osteoporosis, reumatoid arthritis, and periodontitis.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

RANKL에 의해 발현되는 c-Fos는 NFATc1의 발현을 유도하고 이들 단백질의 발현은 실제 파골세포 분화에서 핵심적인 역할을 한다. 따라서 본 연구진은 c-Fos와 NFATc1 단백질 발현에 복령 추출물의 효과를 검증하기 위하여 western blotting을 시행하였다. RANKL에 의해서 유도되는 NFATc1은 파골세포 분화에 중요한 전사인자로 c-Fos에 의해 조절된다(8).
복령 추출물에 의한 파골세포 분화 억제 작용기전을 규명하기 위해 RANKL의 신호전달체계에 복령 추출물이 미치는 영향을 실험하였다. BMM을 복령 추출물로 전 처리 하고 RANKL을 시간별로 처리한 다음 MAPK (mitogen-activated protein kinase)의 인산화를 측정하였다.
RANKL은 RANK와 결합한 후 세포내 신호 전달 체계를 거쳐 전사인자 c-Fos와 NFATc1의 발현을 촉진하여 파골세포의 지표인 TRAP 유전자 발현을 유도한다. 본 연구진은 RANKL에 의해 유도되는 여러 가지 유전자 발현에 복령 추출물의 영향을 실험하였다. RANKL로 자극한 BMM에서 c-Fos, NFATc1 등의 주요 전사 인자의 발현이 증가하였고 TRAP의 발현도 증가하였으나, RANKL과 복령 추출물을 동시에 처리한 실험군에서는 c-Fos의 발현에는 영향이 없었지만 NFATc1과 TRAP의 발현이 억제되었다(Fig.
이런 시점에서 천연물은 기존 약물이 갖는 부작용은 없으면서 치료에는 도움을 주는 치료제 개발의 맥락에서 한약제 중 골다공증의 치료에 응용 될 수 있는 후보로 연구가 진행되고 있다. 본 연구진은 파골세포의 생성 및 활성을 억제 시킬 수 있는 천연물질을 찾고자 하였고 복령(茯笭, Hoelen)이 파골세포의 형성을 억제한다는 것을 확인하였다.복령은 소나무를 벌목하지 3-4년 지난 소나무 뿌리에 기생하며 혹처럼 크게 자란 균핵이다.
복령은 예로부터 전통의학에서 진정, 이뇨, 강장 등의 목적으로 십전대보탕, 오적산, 오령산, 소풍산 등의 많은 처방에 사용되고 있는 한약재로^12,13), 현재는 항암활성, 항염증활성 등이 보고되어 있는 중요 생약이다. 이에 뼈 흡수에 주된 기능을 하는 파골세포 분화에 복령 추출물이 어떤 영향을 미치는지 연구하였다.

가설 설정

1% Triton X-100, and stained with TRAP solution. (B) TRAP-positive cells were counted. (C) BMMs were cultured for 3 days with M-CSF (30 ng/ml) in the presence of hoelen.

제안 방법

분리된 골수세포는 10% FBS, 항생제, M-CSF (30 ng/ml)가 포함된 α-minimum essential medium (α -MEM)배지 (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA)에서 3일간 배양하였다. 3일 후, plate에 부착된 세포를 대식세포 (bone marrow macrophage, BMM)로 사용하여 실험하였다. 대식세포는 M-CSF (30 ng/ml)와 RANKL(100 ng/ml)을 처리하고, 복령추출물을 대식세포에 농도별로 처리하였다.
레트로 바이러스 정제를 위해 pMX와 constitutively active (CA)-NFATc1 이 포함된 벡터를 FuGENE 6 (Roche Applied Siences)를 사용해 plat E cell에 transfection하였다. 48시간 배양후 polybrene (10 ug/ml)을 첨가한 상등액을 BMM에 infection 시킨 후 6h 배양한 뒤 M-CSF (30 ng/ml), RANKL (100 ng/ml)그리고 복령 추출물을 처리하여 4일간 배양하였다.
BMM에CA-NFATc1을 감염시키고 복령추출물을 처리하여 파골세포 분화에 복령 추출물의 영향을 확인하였다. 그 결과 CA-NFATc1을 과 발현 시킨 대조군에서 생성 된 TRAP 양성파골세포와 비교해볼 때 NFATc1을 과발현 시킨 BMM은 복령 추출물을 처리하여 도파골세포로 분화되었다(Fig.
복령 추출물에 의한 파골세포 분화 억제 작용기전을 규명하기 위해 RANKL의 신호전달체계에 복령 추출물이 미치는 영향을 실험하였다. BMM을 복령 추출물로 전 처리 하고 RANKL을 시간별로 처리한 다음 MAPK (mitogen-activated protein kinase)의 인산화를 측정하였다. 그 결과 RANKL에 의해 유도되는 MAPK의 인산화에 복령 추출물의 의미 있는 차이는 없었다(Fig.
PCR 후, 증폭된 cDNA는 1% agarose gel에서 분리하였고Et-Br로 염색하여 U.V.상에서 관찰하였다.
그리고 1차 항체 및 2차 항체를 처리했다. TBS-T 완충용액으로 PVDF막을 세척하여 enhanced chemiluminescence를 이용해 단백질 발현을 관찰했다.
각각의 세포에서 QIAzol (QIAzen)용액으로 제조사의 방법에 따라 RNA를 분리한 후 RNA 1 μg은 oligo dT primer, dNTP, buffer, dithiothreitol, RNase inhibitor와 Superscript II reverse transcriptase를 이용하여 cDNA로 합성하였다.
1B). 다음으로 복령 추출물에 의한 TRAP 양성 파골세포 분화의 억제가 세포독성과 관련 있는지 규명하기 위해 XTT 검사를 실시하였다. 그 결과 파골세포 억제 효과를 나타내는 복령 추출물의 농도에서 세포 독성이 나타나지 않았다(Fig.
다음으로 본 연구진은 복령 추출물의 파골세포 분화 억제 작용기전이 NFATc1 발현 억제와 관련 있는지 확인하기 위해 CA-NFATc1 레트로 바이러스를 사용하였다.
3일 후, plate에 부착된 세포를 대식세포 (bone marrow macrophage, BMM)로 사용하여 실험하였다. 대식세포는 M-CSF (30 ng/ml)와 RANKL(100 ng/ml)을 처리하고, 복령추출물을 대식세포에 농도별로 처리하였다. 배양 4일 후, 배양한세포를 TRAP 용액 (Sigma Aldrich, USA)으로 염색하고 붉은색으로 염색된 세포를 성숙된 파골세포로 간주하고 숫자를 세었다.
레트로 바이러스 정제를 위해 pMX와 constitutively active (CA)-NFATc1 이 포함된 벡터를 FuGENE 6 (Roche Applied Siences)를 사용해 plat E cell에 transfection하였다. 48시간 배양후 polybrene (10 ug/ml)을 첨가한 상등액을 BMM에 infection 시킨 후 6h 배양한 뒤 M-CSF (30 ng/ml), RANKL (100 ng/ml)그리고 복령 추출물을 처리하여 4일간 배양하였다.
대식세포는 M-CSF (30 ng/ml)와 RANKL(100 ng/ml)을 처리하고, 복령추출물을 대식세포에 농도별로 처리하였다. 배양 4일 후, 배양한세포를 TRAP 용액 (Sigma Aldrich, USA)으로 염색하고 붉은색으로 염색된 세포를 성숙된 파골세포로 간주하고 숫자를 세었다.
파골세포는 뼈 흡수 작용을 하는 세포로서, 본 연구진은 복령 추출물이 파골세포 분화에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위해 BMM에 M-CSF와 RANKL을 첨가하여 파골세포 분화를 유도하는 실험 조건에서 복령 추출물을 처리하였다. 그 결과 M-CSF와 RANKL만을 처리한 대조군에 비해 복령 추출물을 같이 처리한 경우, 농도 의존적으로 TRAP 양성 파골세포의 형성이 의미 있게 억제되었고(Fig.
각각의 세포에서 QIAzol (QIAzen)용액으로 제조사의 방법에 따라 RNA를 분리한 후 RNA 1 μg은 oligo dT primer, dNTP, buffer, dithiothreitol, RNase inhibitor와 Superscript II reverse transcriptase를 이용하여 cDNA로 합성하였다. 합성된 cDNA를다음과 같은 primer를 이용하여 PCR 증폭을 시행하였다.

대상 데이터

5주령 ICR 생쥐를 경추 탈골법으로 희생시킨 후 분리한 대퇴골과 경골을 1 ml 주사기를 이용하여 뼈의 속질을 수세하여골수세포를 얻었다. 분리된 골수세포는 10% FBS, 항생제, M-CSF (30 ng/ml)가 포함된 α-minimum essential medium (α -MEM)배지 (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA)에서 3일간 배양하였다.
복령 추출물은 한국생명공학연구원에서 구입하였다. Human RANKL과 M-CSF는 Peprotech (London, UK)사에서 구입하였고, XTT assay kit는 Roche (Indianapolis, IN, USA)사에서구입하였다. p-JNK, JNK, p-ERK, ERK, p-p38, p38, I-κB 항체는Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)사의 제품을 사용하였다.
p-JNK, JNK, p-ERK, ERK, p-p38, p38, I-κB 항체는Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)사의 제품을 사용하였다. c-Fos와 NFATc1 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)사에서 구입하였다.
p-JNK, JNK, p-ERK, ERK, p-p38, p38, I-κB 항체는Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)사의 제품을 사용하였다.
복령 추출물은 한국생명공학연구원에서 구입하였다. Human RANKL과 M-CSF는 Peprotech (London, UK)사에서 구입하였고, XTT assay kit는 Roche (Indianapolis, IN, USA)사에서구입하였다.
흰색인 것을 백복령(白茯笭), 붉은색인 것을 적복령(赤茯笭)이라 한다. 본 연구진은 그 중 백복령 추출물을 선택하여 사용하였다. 복령은 예로부터 전통의학에서 진정, 이뇨, 강장 등의 목적으로 십전대보탕, 오적산, 오령산, 소풍산 등의 많은 처방에 사용되고 있는 한약재로^12,13), 현재는 항암활성, 항염증활성 등이 보고되어 있는 중요 생약이다.

데이터처리

각각의 실험군은 3개 이상 수행하였고 평균값과 표준편차를 계산하였다. 모든 실험은 3회 이상 반복하여 동일한 실험결과를 얻은 경우 실험결과로 사용하였으며, 정량적인 결과의 통계는 Student's t-test를 이용하여 분석하였고 p 값이 0.
모든 실험은 3회 이상 반복하여 동일한 실험결과를 얻은 경우 실험결과로 사용하였으며, 정량적인 결과의 통계는 Student's t-test를 이용하여 분석하였고 p 값이 0.05 이하인 경우통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.

성능/효과

본 연구진은 RANKL에 의해 유도되는 여러 가지 유전자 발현에 복령 추출물의 영향을 실험하였다. RANKL로 자극한 BMM에서 c-Fos, NFATc1 등의 주요 전사 인자의 발현이 증가하였고 TRAP의 발현도 증가하였으나, RANKL과 복령 추출물을 동시에 처리한 실험군에서는 c-Fos의 발현에는 영향이 없었지만 NFATc1과 TRAP의 발현이 억제되었다(Fig. 2).
BMM에CA-NFATc1을 감염시키고 복령추출물을 처리하여 파골세포 분화에 복령 추출물의 영향을 확인하였다. 그 결과 CA-NFATc1을 과 발현 시킨 대조군에서 생성 된 TRAP 양성파골세포와 비교해볼 때 NFATc1을 과발현 시킨 BMM은 복령 추출물을 처리하여 도파골세포로 분화되었다(Fig. 5). 위 결과는 복령 추출물의 파골세포 분화 억제 작용 기전이 NFATc1과 관련 있음을 시사한다.
파골세포는 뼈 흡수 작용을 하는 세포로서, 본 연구진은 복령 추출물이 파골세포 분화에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위해 BMM에 M-CSF와 RANKL을 첨가하여 파골세포 분화를 유도하는 실험 조건에서 복령 추출물을 처리하였다. 그 결과 M-CSF와 RANKL만을 처리한 대조군에 비해 복령 추출물을 같이 처리한 경우, 농도 의존적으로 TRAP 양성 파골세포의 형성이 의미 있게 억제되었고(Fig. 1A) 다핵성 파골세포를 가지고 있는 성숙한 파골세포의 수도 의미 있게 복령 추출물에 의해 감소됨을 확인 수 있었다(Fig. 1B). 다음으로 복령 추출물에 의한 TRAP 양성 파골세포 분화의 억제가 세포독성과 관련 있는지 규명하기 위해 XTT 검사를 실시하였다.
BMM을 복령 추출물로 전 처리 하고 RANKL을 시간별로 처리한 다음 MAPK (mitogen-activated protein kinase)의 인산화를 측정하였다. 그 결과 RANKL에 의해 유도되는 MAPK의 인산화에 복령 추출물의 의미 있는 차이는 없었다(Fig. 4).
다음으로 복령 추출물에 의한 TRAP 양성 파골세포 분화의 억제가 세포독성과 관련 있는지 규명하기 위해 XTT 검사를 실시하였다. 그 결과 파골세포 억제 효과를 나타내는 복령 추출물의 농도에서 세포 독성이 나타나지 않았다(Fig. 1C). 이를 통해 복령 추출물의 파골세포 억제 효과가 세포 독성에 대한 것이 아니라 약물 자체의 효과임을 알 수 있었다.
RANKL에 의한 c-Fos의 발현에는 복령 추출물의 영향이 없었다. 그러나 RANKL을 처리한 후 24시간과 48시간에 NFATc1의 발현은 증가되었으나 복령 추출을 처리한 실험군에서는 단백질 발현이 현저히 억제 되었다(Fig. 3).
이 결과는 복령이 c-Fos 발현에 영향이 없는 것과일치 한다고 할 수 있다. 복령 추출물을 이용한 실험을 통해 파골세포 분화에 억제 효과가 있음을 알게 되었고 이러한 억제 효과는 파골세포 분화에 핵심적인 NFATc1의 발현을 억제하기 때문인 것으로 나타났다. 향후 복령 추출물을 이용한 동물 실험이나 화학적인 성분 분석을 통한 지속적인 연구가 필요할 것으로판단된다.
이는복령 추출물이 파골세포 분화의 핵심 기전을 억제함을 의미한다.복령 추출물이 NFATc1의 발현을 억제함과 관련하여 NFATc1을과 발현 시킨 상태에서의 복령 추출물이 미치는 영향은 TRAP양성파골세포 분화가 부분적으로 회복됨을 확인하였고, 다시 한번 파골세포 분화과정에서 핵심 역할을 하는 NFATc1의 발현과 관련하여 복령이 중요한 억제 역할을 하고 있음을 확인 하였다. c-Fos는 RANKL의 자극에 의해 30분 안에 발현되는 전사인자로NF-κB와 MITF등과 함께 NFATc1과 같은 파골세포 분화에 중요한 단백질 발현을 촉진한다⁸⁾.
특히 NFATc1은 파골세포 분화의 중요 전사인자로 파골세포 표지 유전자인 TRAP과 OSCAR의 발현을 촉진한다^17,18). 본연구진은 복령 추출물이 RANKL에 의해 진행되는 분화과정에서핵심 유전자인 NFATc1의 발현을 억제함을 확인 하였다. 이는복령 추출물이 파골세포 분화의 핵심 기전을 억제함을 의미한다.
5). 위 결과는 복령 추출물의 파골세포 분화 억제 작용 기전이 NFATc1과 관련 있음을 시사한다.
1C). 이를 통해 복령 추출물의 파골세포 억제 효과가 세포 독성에 대한 것이 아니라 약물 자체의 효과임을 알 수 있었다.
RANKL과 RANK의 결합으로 RANK의 세포질 부위로TRAF 계열 단백질 결합이 촉진되고 RANKL의 신호가 전달되어MAPKs인 JNK, p38, ERK와 같은 신호전달 단백질의 활성화를통하여 파골세포 분화에 필수적인 NF-κB, NFATc1, c-Fos를 유도한다¹⁹⁾. 하지만 복령 추출물은 파골세포 분화과정 중 초기단계에 해당하는 신호전달단계에는 별다른 영향을 미치지 않은 것으로 확인되었다. 이 결과는 복령이 c-Fos 발현에 영향이 없는 것과일치 한다고 할 수 있다.

후속연구

천연물인 복령 추출물은 골 흡수 역할을 담당하는 파골세포의 분화를 세포의 독성 없이 억제시켰다. 이를 통해 그 동안 전통적인 약제로 사용되어 왔던 복령의 또 다른 효능을 밝혀냈고,부작용 없이 뼈를 강화 시킬 수 있는 한약제로서의 가능성을 제시하여 기존 부작용이 많은 약물을 대체 할 수 있는 후보 물질로제시 할 수 있다고 사료된다.
복령 추출물을 이용한 실험을 통해 파골세포 분화에 억제 효과가 있음을 알게 되었고 이러한 억제 효과는 파골세포 분화에 핵심적인 NFATc1의 발현을 억제하기 때문인 것으로 나타났다. 향후 복령 추출물을 이용한 동물 실험이나 화학적인 성분 분석을 통한 지속적인 연구가 필요할 것으로판단된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	골다공증은 어떤 경우에 발생하는가?	이러한 뼈는 태어나면서부터 사망할 때 까지 양질의 뼈를유지할 수 있도록 생성과 흡수 과정을 반복하는데, 조골세포에의한 뼈의 생성과 파골세포에 의한 뼈의 흡수가 균형을 이루어항상성을 유지한다. 특히, 이 과정에서 뼈 파괴를 담당하는 파골세포의 역할이 매우 중요하고 파골세포의 골 흡수 기능이 비정상적으로 증가할 경우 골다공증과 같은 질환이 발생하게 된다1-3).골다공증은 폐경기와 관련이 있을 뿐만 아니라 난소적제술, 흡연, 운동부족, 식생활등의 변화로 인하여 최근에는 젊은 여성에서도 빈번히 발생되고 있는 추세여서 경제적인 문제와 더불어삶의 질에도 큰 문제점을 야기 시키고 있다4-6).
	복령은 어떻게 분류되는가?	복령은 소나무를 벌목하지 3-4년 지난 소나무 뿌리에 기생하며혹처럼 크게 자란 균핵이다. 흰색인 것을 백복령(白茯笭), 붉은색인 것을 적복령(赤茯笭)이라 한다. 본 연구진은 그 중 백복령 추출물을 선택하여 사용하였다.
	뼈의 역할은 무엇인가?	뼈는 사람의 골격을 이루는 가장 단단한 조직으로 구조적으로는 몸의 형태를 유지하고, 내부 장기를 보호하며, 칼슘과 인 등무기질의 저장고로서 이들의 혈중 농도 유지에 중요한 역할을한다. 이러한 뼈는 태어나면서부터 사망할 때 까지 양질의 뼈를유지할 수 있도록 생성과 흡수 과정을 반복하는데, 조골세포에의한 뼈의 생성과 파골세포에 의한 뼈의 흡수가 균형을 이루어항상성을 유지한다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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