[논문]메주에서 분리한 Bacillus polyfermenticus CJ6가 생산하는 항진균 물질의 분리 및 특성

양은주; 마승진; 장해춘

doi:10.4014/kjmb.1203.03001

메주에서 분리한 Bacillus polyfermenticus CJ6가 생산하는 항진균 물질의 분리 및 특성
Isolation and Characterization of Antifungal Compounds Produced by Bacillus polyfermenticus CJ6 Isolated from Meju 원문보기

한국미생물·생명공학회지 = Korean journal of microbiology and biotechnology, v.40 no.1, 2012년, pp.57 - 65

양은주 (조선대학교 식품영양학과.김치연구센터) , 마승진 (목포대학교 식품공학과) , 장해춘 (조선대학교 식품영양학과.김치연구센터)

초록
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B. polyfermenticus CJ6가 생산하는 항진균 물질을 분리 정제하기 위하여 SPE, preparative HPLC, reverse phase-HPLC를 통한 정제를 시행하였다. Preparative HPLC로부터8, B, C의 3개의 항진균 활성 분획을 분리하였으며, LC/MS분석 결과 B. polyfermenticus CJ6는 2종의 iturin A($C_{14}$, $C_{15}$), 3종의 surfactin($C_{13}$, $C_{14}$, $C_{15}$), 4종의 fengycin A($C_{14}$, $C_{15}$, $C_{16}$, $C_{17}$)와 2종의 fengycin B($C_{16}$, $C_{17}$)를 생산하는 것으로 추정되었다. 분리된 항진균 활성 분획의 안정성 실험을 결과 iturin을 함유한 8번 분획은 pH, 열, 효소처리에 안정하였으나 50-$70^{\circ}C$에서 24시간 처리 시에는 항진균 활성이 다소 감소되었다. Surfactins과 fengycins을 포함하는 것으로 추정되는 B 분획은 온도에는 매우 안정하나 pH 3.0과 protease(type I) 및 ${\alpha}$-chymotrypsin 처리에 의하여 항진균활성이 감소되었다. Fengycins 만을 함유한 C 분획은 열과 pH 처리에서 모두 안정하였으나 protease(type I) 처리에 의하여 활성이 감소되었다. 항진균 활성 8번 분획은 reversephase-HPLC를 통하여 2개의 단일 피크가 분리되었으며, 아미노산 조성 분석 결과 Asx, Tyr, Gln, Pro, Ser의 분자비가 3:1:1:1:1으로서 iturin A의 아미노산 서열과 일치하는 것으로 확인되었다. 본 연구를 통하여 B. polyfermenticus CJ6는다양한 항진균 활성 lipopeptides를 생산하는 것을 알 수 있으며, 항진균 활성이 우수한 B. polyfermenticus CJ6 균주의 생물방제 및 생물보존제로서의 활용이 기대된다.

Abstract ▼ AI-Helper

Antifungal compounds from Bacillus polyfermenticus CJ6 were purified using SPE, preparative HPLC, and reverse phase-HPLC. Antifungal compounds from B. polyfermenticus CJ6 were separated into three fractions (8, B, C) using preparative HPLC. LC/MS analysis of antifungal peaks suggested that B. polyfermenticus CJ6 produces lipopeptides; two kinds of iturin A ($C_{14}$, $C_{15}$), three kinds of surfactins ($C_{13}$, $C_{14}$, $C_{15}$), four kinds of fengycin A ($C_{14}$, $C_{15}$, $C_{16}$, $C_{17}$) and two kinds fengycin B ($C_{16}$, $C_{17}$). The antifungal activity of fraction 8, which was presumed as inturin A, was found to be stable after the pH, heat or proteolytic enzyme treatment, but it was unstable at 50-$70^{\circ}C$ for 24 hr. The antifungal activity of fraction B, which presumed as surfactins and fengycin A, was found to be stable after the heat treatment, but it was unstable in the pH 3.0 and after the protease (type I) or ${\alpha}$-chymotrypsin treatment. The antifungal activity of fraction C, which was presumed as fengycin A and B, was found to be stable in the pH 3.0-9.0 range and the heat treatment, but it was unstable with the treatment of protease (type I). The amino acid composition of the purified peaks 8-1 and 8-2 were Asx, Tyr, Gln, Pro, and Ser in a molar ratio of 3:1:1:1:1, which showed the same amino acid composition as iturin. From these results, we confirmed that antifungal compounds from B. polyfermenticus CJ6 most likely belonged to iturin A as well as surfactins and fengycins. As lipopeptides are known to act in a synergistic manner, the antifungal compounds from B. polyfermenticus CJ6 might have potential uses in biotechnology and biopharmaceutical applications.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서는 B. polyfermenticus CJ6가 생산하는 항균물질 중 항진균 활성 물질을 분리 · 정제하여 항진균 활성 원인 물질을 규명하고자 한다.

제안 방법

JAIGEL-W 252 컬럼을 사용하여 30% acetonitrile 용매로 용출한 다음 A, B, C의 3개의 분획으로 나누었으며(Fig. 2-A), 각 분획의 항진균 활성을 확인한 결과 B와 C 분획에서 강한 곰팡이 저해 활성이 관찰되었다(Fig. 2-B).
Acetonitrile(50%; HPLC-grade, Fisher)에 녹인 SPE 정제물은 0.45 µm syringe filter(Advantec MFS)로 여과시킨 후 preparative LC9104 HPLC system(Japan Analytical Industry, Tokyo, Japan)을 이용하여 정제를 시행하였다.
B. polyfermenticus CJ6가 생산하는 항진균 물질 중 단일피크로 분리된 8-1과 8-2 물질의 아미노산 조성 분석을 시행하였다. 두 물질 모두 Asx, Glx, Ser, Pro, Tyr의 아미노산이 검출되었으며, 구성 비율은 3:1:1:1:1을 나타내었다(Table 4).
B. polyfermenticus CJ6가 생산하는 항진균 물질을 정제하기 위하여 배양 상징액을 C₁₈ Sep-Pak cartridge를 사용한 SPE 정제 후, preparative HPLC 1차 정제 시료로 사용하였다. JAIGEL-W 252 컬럼을 사용하여 50% acetonitrile 용매로 용출한 결과 8개의 주요한 분획을 얻을 수 있었으며(Fig.
HPLC를 통하여 분리된 항진균 물질들의 분자량을 조사하기 위하여 UPLC(Ultra performance liquid chromatography)와 ESI-MS(Electrospray ionization tandem mass spectrometry)를 시행하였다. 항진균 활성 8번 분획에서 분리된 피크 8-1과 8-2는 단일물질로 확인되었으며, 8-1 피크는 m/z 1043.
Preparative HPLC를 통하여 분리된 항진균 활성 분획 8, B, C는 isocratic separation 조건을 사용하는 preparative HPLC에서는 더 이상 분리가 이루어지지 않아 gradient separation 조건으로 바꾸어 C₁₈ 컬럼을 사용하여 각각 reverse phase HPLC를 시행하였다. 분획 8번은 acetonitrile 용매를 35-37%의 농도 구배로 gradient separation을 실행하였으며, 2개의 주요한 피크(8-1과 8-2)를 얻을 수 있었으며(Fig.
Preparative HPLC에서 항진균 활성을 나타낸 분획은 Acme HPLC system(Young Lin, Korea)을 이용하여 분석하였다. 컬럼은 LUNA C18컬럼(4.
UPLC 분석은 ACQUITY UPLC system(Waters)에서 역상 컬럼인 ACQUITY UPLC BEH C18 컬럼(2.1×100mm, 1.7 µm; Waters)을 이용하여 분석하였다.
온도에 의한 영향을 알아보기 위하여 각 항진균 활성 분획을 25℃, 30℃, 37℃, 50℃에서 24시간, 70℃에서 2시간 또는 24시간, 100℃에서 30분, 121℃에서 15분간 열처리한 후에 항진균 활성을 측정하였다. pH에 대한 영향을 알아보기 위하여 각 항진균 활성 분획을 pH 3.0(50 mM glycine-HCl), pH 4.0(50 mM glycine-HCl), pH 5.0(50 mM sodium citrate), pH 6.0(50 mM sodium citrate), pH 7.0(50 mM Tris-HCl), pH 8.0(50 mM Tris-HCl), pH 9.0(50 mM glycine-NaOH) 완충용액에 용해시켜 4℃에서 4시간 동안 처리한 후 항진균 활성을 측정하였다. 각종 효소에 대한 영향을 알아보기 위하여 proteinase K(EC 3.
0)/10 mM NaCl 완충액에 40 mg/mL가 되도록 준비하였다. 각 항진균 활성 분획에 효소 용액을 4 mg/mL의 농도로 첨가하여 25℃에서 24시간을 처리한 다음 100℃에서 5분동안 끓여 효소를 불활성화 시킨 후 잔존하는 항진균 활성을 측정하였다. 대조구로는 항진균 활성 분획에 효소액 대신 20 mM Tris-HCl(pH 7.
각 항진균 활성 분획에 효소 용액을 4 mg/mL의 농도로 첨가하여 25℃에서 24시간을 처리한 다음 100℃에서 5분동안 끓여 효소를 불활성화 시킨 후 잔존하는 항진균 활성을 측정하였다. 대조구로는 항진균 활성 분획에 효소액 대신 20 mM Tris-HCl(pH 7.5) 완충액을 첨가하여 동일한 조건으로 처리한 것으로 삼았다. 잔존하는 항균활성은 spot-on-the lawn test 방법[9]을 사용하여 순차적 2배씩 희석에 의해 항균활성을 측정하였으며, 측정된 대조구의 항균활성(AU/mL)을 100으로 하였을 때 온도, pH, 효소처리에 따른 항균 활성을 대조구에 대한 상대값으로 나타내었다.
두 피크의 분자량을 Bacillus 속 유래의 항진균 물질들과 비교해 본 결과 iturin 계열에 속하는 항생물질과 일치하였으며, 8-1 피크는 β-아미노산의 탄소수가 14개인 iturin A이며, 8-2 피크는 β-아미노산의 탄소수가 15개인 iturin A로 추정되었다. 분획 B와 C에서 분리된 각각의 항진균 활성 피크들은 HPLC상에서 더 이상의 분리가 불가능하여 항진균 활성 피크들에 대한 MS 분석을 바로 시행하였다. 분획 B에서 항진균 활성을 나타낸 4개의 피크 B-10, B-11, B-12, B-13를 모두 합하여 MS 분석을 시행한 결과 m/z, 1016.
항진균 물질의 안정성을 조사하기 위하여 preparative HPLC에서 분리한 항진균 활성 8, B, C 분획을 온도와 pH 및 각종 효소로 처리한 후 잔존 활성을 측정하였다. 온도에 의한 영향을 알아보기 위하여 각 항진균 활성 분획을 25℃, 30℃, 37℃, 50℃에서 24시간, 70℃에서 2시간 또는 24시간, 100℃에서 30분, 121℃에서 15분간 열처리한 후에 항진균 활성을 측정하였다. pH에 대한 영향을 알아보기 위하여 각 항진균 활성 분획을 pH 3.
5) 완충액에 녹여진 항진균 물질 10 µL를 가하였다. 이를 30℃에서 48시간 배양한 후 항진균 물질에 의한 곰팡이의 생육 저해 여부를 관찰하였다. 정제 단계에 따른 항진균 활성 역가는 항진균 물질을 순차적으로 2배씩 희석하여 저해환을 형성하는 최대 희석배수의 역을 취하고, 이 값에 1 mL에 대해서 환산해주는 환산계수를 곱하여 AU/mL로 나타내었다.
UV 검출 파장은 210 nm에서 측정하였다. 정제된 분획은 speed vac concentrator (Centra-Vac VS-802)를 이용하여 용매를 제거한 후 20 mM Tris-HCl(pH 7.5) 완충액에 녹여 항진균 활성을 확인하였다.
각 활성 분획의 검출은 UV detector(UV730D, Young Lin)를 이용하여 230 nm에서 측정하였다. 정제된 분획은 speed vac concentrator에서 용매를 제거한 후 20 mM Tris-HCl(pH 7.5) 완충액에 녹여 항진균 활성을 확인하였다.
질량 분석 및 MS/MS fragmentation은 Synapt HDMS (Waters)를 사용하여 실행하였다. 질량분석기는 capillary 3.
질량 분석 및 MS/MS fragmentation은 Synapt HDMS (Waters)를 사용하여 실행하였다. 질량분석기는 capillary 3.1 kV, source 온도 100℃, desolvation 온도 300℃, gas flow는 desolvation 450 L/hr로 하여 ESI positive와 negative mode에서 이온화 하였다. Collision energy(CE)는 15에서 45 V로 맞추어 사용하였다.
항진균 물질의 아미노산 조성 분석을 위하여 정제한 물질을 6 N HCl에 녹인 후 1% phenol을 첨가하고 질소를 채워 105℃에서 20시간 동안 가수분해시킨 후 AccQ-Fluor Reagent Kit(Waters)로 유도체화하여 아미노산 분석기로 분석하였다. 분석기기는 Amino Acid Analyzer(Waters 2690, Waters 747, Waters), 컬럼은 AccQ-Tag(3.
항진균 물질의 안정성을 조사하기 위하여 prep-HPLC에서 분리된 항진균 활성 물질인 8, B, C 분획을 온도와 pH 및 각종 효소에 처리한 후 항진균 활성을 측정하였다. 온도 안정성 실험 결과 B와 C 분획의 항진균 활성은 모든 온도에서 매우 안정하였으며, 8번 분획도 모든 온도에서 안정하였으나, 50℃와 70℃에서 24시간 처리한 후 항진균 활성이 다소 감소되었다.
항진균 물질의 안정성을 조사하기 위하여 preparative HPLC에서 분리한 항진균 활성 8, B, C 분획을 온도와 pH 및 각종 효소로 처리한 후 잔존 활성을 측정하였다. 온도에 의한 영향을 알아보기 위하여 각 항진균 활성 분획을 25℃, 30℃, 37℃, 50℃에서 24시간, 70℃에서 2시간 또는 24시간, 100℃에서 30분, 121℃에서 15분간 열처리한 후에 항진균 활성을 측정하였다.
4 mL 속도로 용출하였다. 항진균 활성 8번 분획은 35-37% acetonitrile gradient 조건을, 항진균 활성 B와 C 분획은 5-70% acetonitrile gradient 조건을 사용하였다. 각 활성 분획의 검출은 UV detector(UV730D, Young Lin)를 이용하여 230 nm에서 측정하였다.

대상 데이터

항진균 활성 8번 분획은 35-37% acetonitrile gradient 조건을, 항진균 활성 B와 C 분획은 5-70% acetonitrile gradient 조건을 사용하였다. 각 활성 분획의 검출은 UV detector(UV730D, Young Lin)를 이용하여 230 nm에서 측정하였다. 정제된 분획은 speed vac concentrator에서 용매를 제거한 후 20 mM Tris-HCl(pH 7.
컬럼은 JAIGEL-W gel permeation chromatography 컬럼(W252, 20×500 mm, Japan Analytical Industry)을 사용하였으며, 검출기로는 3702 UV 검출기(Japan Analytical Industry)를 사용하였다.
1-A)은 25,600 AU로 정제에 사용한 배양 상징액의 전체 활성(1,280,000 AU) 중 2%의 회수율을, B와 C 분획은 각각 64,000 AU로 전체 활성중 5%의 회수율을 나타내었다(Table 1). 항진균 활성이 확인된 preparative HPLC 1차 정제에서의 8번 분획(Fig. 1-A)과 2차 정제에서의 B와 C 분획(Fig. 2-A)은 각각 농축 후 다음 단계의 정제 시료로 사용하였다.
3-c). 항진균 활성이 확인된 피크들은 농축 후 LC-MS 분석의 시료로 사용하였다.

이론/모형

0). The antifungal activity was measured by the spot-on-the lawn method. A.
각 정제 분획의 항진균 활성 측정은 spot-on-the lawn test 방법[9]을 사용하였으며, 감수성 곰팡이는 Aspergillus petrakii PF-1[35]을 사용하였다. Potato dextrose agar(PDA, Difco Laboratories, MI, USA) 배지 20 mL에 A.
5) 완충액을 첨가하여 동일한 조건으로 처리한 것으로 삼았다. 잔존하는 항균활성은 spot-on-the lawn test 방법[9]을 사용하여 순차적 2배씩 희석에 의해 항균활성을 측정하였으며, 측정된 대조구의 항균활성(AU/mL)을 100으로 하였을 때 온도, pH, 효소처리에 따른 항균 활성을 대조구에 대한 상대값으로 나타내었다.

성능/효과

polyfermenticus CJ6가 생산하는 항진균 물질을 정제하기 위하여 배양 상징액을 C₁₈ Sep-Pak cartridge를 사용한 SPE 정제 후, preparative HPLC 1차 정제 시료로 사용하였다. JAIGEL-W 252 컬럼을 사용하여 50% acetonitrile 용매로 용출한 결과 8개의 주요한 분획을 얻을 수 있었으며(Fig.1-A), A. petrakii PF-1에 대한 항진균 활성을 확인한 결과 1, 2, 3, 8번 분획에서 곰팡이 저해 활성이 관찰되었다(Fig.1-B). Fig.
각각의 분자량을 Bacillus 속 유래의 항진균 물질들과 비교해 본 결과 m/z 1016.8의 물질은 β-아미노산의 탄소수가 13개인 surfactin, m/z 1058.6의 물질은 β-아미노산의 탄소수가 각각 14개와 15개인 surfactin으로 추정되며, m/z 1435.8과 1449.8의 물질은 β-아미노산의 탄소수가 각각 14개와 15개인 fengycin A 로 추정되었다.
polyfermenticus CJ6가 생산하는 항진균 물질 중 단일피크로 분리된 8-1과 8-2 물질의 아미노산 조성 분석을 시행하였다. 두 물질 모두 Asx, Glx, Ser, Pro, Tyr의 아미노산이 검출되었으며, 구성 비율은 3:1:1:1:1을 나타내었다(Table 4). Bacillus가 생산하는 cyclic lipoheptapeptides인 iturin family는 iturin A, iturin A L , iturin C, bacillomycin D, bacillomycin F, bacillomycin L, bacillomycin LC, 그리고 mycosubtilin으로 나뉜다[26].
두 피크의 분자량을 Bacillus 속 유래의 항진균 물질들과 비교해 본 결과 iturin 계열에 속하는 항생물질과 일치하였으며, 8-1 피크는 β-아미노산의 탄소수가 14개인 iturin A이며, 8-2 피크는 β-아미노산의 탄소수가 15개인 iturin A로 추정되었다.
본 실험 결과를 통하여 surfactin이나 fengycin은 protease(type I) 또는 α-chymotrypsin의 처리에 영향을 받는 것으로 추정된다.
본 연구를 통하여 항진균 활성을 나타내는 B. polyfermenticus CJ6로부터 iturin A가 생산되며, 동시에 surfactin과 fengycin class lipopeptides가 생산됨을 추정할 수 있었다. B.
또한 acyl chain의 길이나 구조, 구성 아미노산의 종류에 따라 다양한 isomer를 가지며, 균주의 배양 조건에 따라 isomer의 형태나 양이 다르게 생산되는 것으로 알려져 있다[1]. 본 연구에서는 MS 분석 및 아미노산 조성 분석을 통하여 B. polyfermenticus CJ6가 2종의 iturin A를 생산함을 알 수 있었으며, 다른 항진균 활성 분획의 MS 분석으로부터 3종의 surfactin, 4종의 fengycin A 및 2종의 fengycin B를 생산함을 추정할 수 있었다. Bacillus 속 균주로부터 항진균 활성 lipopeptide의 생산에 관한 보고는 매우 많으며, 그 대부분이 iturin이나 surfactin 또는 fengycin class 중 1종 또는 2종의 lipopeptide를 규명한 보고들이다[5, 17, 34].
컬럼을 사용하여 각각 reverse phase HPLC를 시행하였다. 분획 8번은 acetonitrile 용매를 35-37%의 농도 구배로 gradient separation을 실행하였으며, 2개의 주요한 피크(8-1과 8-2)를 얻을 수 있었으며(Fig. 3-A), 피크 8-1과 8-2 모두 항진균 활성이 있음을 확인하였다(Fig. 3-a). 분획 B와 C는 acetonitrile 용매를 5-70%의 농도 구배로 gradient separation을 실행하였다.
분획 B와 C에서 분리된 각각의 항진균 활성 피크들은 HPLC상에서 더 이상의 분리가 불가능하여 항진균 활성 피크들에 대한 MS 분석을 바로 시행하였다. 분획 B에서 항진균 활성을 나타낸 4개의 피크 B-10, B-11, B-12, B-13를 모두 합하여 MS 분석을 시행한 결과 m/z, 1016.8([M+Na]⁺), 1044.5([M+Na]⁺), 1058.6([M+Na]⁺), 1435.8([M+H]⁺), 1449.8([M+H]⁺) 등 5개의 분자량이 검출되었다(Table 2). 각각의 분자량을 Bacillus 속 유래의 항진균 물질들과 비교해 본 결과 m/z 1016.
분획 B와 C는 acetonitrile 용매를 5-70%의 농도 구배로 gradient separation을 실행하였다. 분획 B의 reverse phase HPLC 실행 결과 다수의 피크가 검출되었으며(Fig. 3-B), 이 중 14개의 피크를 분취하여 항진균 활성을 측정한 결과 B-10, B-11, B-12, B-13번 피크에서 활성을 나타내었다(Fig. 3-b). 분획 C는 reverse phase HPLC를 통하여 6개의 주요 피크가 검출되었으며(Fig.
3-b). 분획 C는 reverse phase HPLC를 통하여 6개의 주요 피크가 검출되었으며(Fig. 3-C), 항진균 활성 측정 결과 C-4, C-5, C-6번 피크에서 활성이 확인되었다(Fig. 3-c). 항진균 활성이 확인된 피크들은 농축 후 LC-MS 분석의 시료로 사용하였다.
분획 C에서 분리된 항진균 활성 C-4, C-5, C-6의 3개 피크를 합하여 MS 분석을 시행한 결과 m/z 1463.9([M+H]+), 1477.9([M+H]+), 1491.9([M+H]+), 1505.9([M+H]+)의 4개의 질량값을 얻을 수 있었으며(Table 2), Bacillus 속 유래 항진균 물질들과 비교해 본 결과 m/z 1463.9와 1477.9의 물질은 β-아미노산의 탄소수가 각각 16개와 17개인 fengycin A로, m/z 1491.9와 1505.9의 물질은 β-아미노산의 탄소수가 각각 16개와 17개인 fengycin B로 추정되었다.
항진균 물질의 안정성을 조사하기 위하여 prep-HPLC에서 분리된 항진균 활성 물질인 8, B, C 분획을 온도와 pH 및 각종 효소에 처리한 후 항진균 활성을 측정하였다. 온도 안정성 실험 결과 B와 C 분획의 항진균 활성은 모든 온도에서 매우 안정하였으며, 8번 분획도 모든 온도에서 안정하였으나, 50℃와 70℃에서 24시간 처리한 후 항진균 활성이 다소 감소되었다. 항진균 활성 8번 분획은 70℃에서 2시간 처리한 경우에는 활성이 100% 유지되었으나, 70℃에서 24시간 처리한 경우에는 침전물이 생성되며 활성이 감소되는 것을 관찰할 수 있었다(Table 3).
2-B). 정제 단계에 따른 활성 분획의 항진균 활성 역가를 AU(arbitrary unit)로 측정하였을 때, 8번 분획(Fig. 1-A)은 25,600 AU로 정제에 사용한 배양 상징액의 전체 활성(1,280,000 AU) 중 2%의 회수율을, B와 C 분획은 각각 64,000 AU로 전체 활성중 5%의 회수율을 나타내었다(Table 1). 항진균 활성이 확인된 preparative HPLC 1차 정제에서의 8번 분획(Fig.
HPLC를 통하여 분리된 항진균 물질들의 분자량을 조사하기 위하여 UPLC(Ultra performance liquid chromatography)와 ESI-MS(Electrospray ionization tandem mass spectrometry)를 시행하였다. 항진균 활성 8번 분획에서 분리된 피크 8-1과 8-2는 단일물질로 확인되었으며, 8-1 피크는 m/z 1043.6([M+H]⁺)을 나타내었고, 8-2 피크는 m/z 1057.6([M+H]⁺)을 나타내었다(Table 2). 두 피크의 분자량을 Bacillus 속 유래의 항진균 물질들과 비교해 본 결과 iturin 계열에 속하는 항생물질과 일치하였으며, 8-1 피크는 β-아미노산의 탄소수가 14개인 iturin A이며, 8-2 피크는 β-아미노산의 탄소수가 15개인 iturin A로 추정되었다.
온도 안정성 실험 결과 B와 C 분획의 항진균 활성은 모든 온도에서 매우 안정하였으며, 8번 분획도 모든 온도에서 안정하였으나, 50℃와 70℃에서 24시간 처리한 후 항진균 활성이 다소 감소되었다. 항진균 활성 8번 분획은 70℃에서 2시간 처리한 경우에는 활성이 100% 유지되었으나, 70℃에서 24시간 처리한 경우에는 침전물이 생성되며 활성이 감소되는 것을 관찰할 수 있었다(Table 3). 다른 연구보고들에서 정제된 iturin A의 온도 안정성 실험을 시행한 결과도 본 연구의 8번 분획의 열안정성 실험결과와 같은 결과를 나타내었다[15, 30].
Fengycins만을 함유한 C 분획은 열과 pH 처리에서 모두 안정하였으나 protease(type I) 처리에 의하여 활성이 감소되었다. 항진균 활성 8번 분획은 reverse phase-HPLC를 통하여 2개의 단일 피크가 분리되었으며, 아미노산 조성 분석 결과 Asx, Tyr, Gln, Pro, Ser의 분자비가 3:1:1:1:1으로서 iturin A의 아미노산 서열과 일치하는 것으로 확인되었다. 본 연구를 통하여 B.
항진균 활성 분획을 각종 효소로 처리하여 항진균 활성을 측정한 결과 iturin으로 구성된 8번 분획은 어떠한 효소에도 영향을 받지 않았으나, surfactin과 fengycin으로 추정되는 물질을 함유한 B 분획은 protease(type I)와 α-chymotrypsin에 의하여 활성이 일부 감소되었으며, fengycin으로 추정되는 물질을 함유한 C 분획은 protease(type I) 처리에서 활성이 감소되는 결과를 보였다(Table 3).

후속연구

항진균 활성 8번 분획은 reverse phase-HPLC를 통하여 2개의 단일 피크가 분리되었으며, 아미노산 조성 분석 결과 Asx, Tyr, Gln, Pro, Ser의 분자비가 3:1:1:1:1으로서 iturin A의 아미노산 서열과 일치하는 것으로 확인되었다. 본 연구를 통하여 B. polyfermenticus CJ6는 다양한 항진균 활성 lipopeptides를 생산하는 것을 알 수 있으며, 항진균 활성이 우수한 B. polyfermenticus CJ6 균주의 생물방제 및 생물보존제로서의 활용이 기대된다.
polyfermenticus CJ6 균주는 식중독 세균에 대한 저해 활성과 박테리오신 생성능에 대한 연구보고를 통하여 정장작용 및 식중독 예방과 치료를 위한프로바이오틱 생균제제로서의 활용가능성을 제시한 바 있다[11]. 항세균 물질 뿐만 아니라 다양한 항진균 물질을 생산 하는 B. polyfermenticus CJ6 균주는 앞으로 추가적인 연구를 통하여 프로바이오틱 뿐만 아니라 농업, 식품, 임상 및각종 산업분야에서 생물방제제, 생물보존제, 병원성 곰팡이 치료제 등으로 개발될 수 있는 가능성이 높을 것으로 기대된다. protease(type I) 및 α-chymotrypsin 처리에 의하여 항진균 활성이 감소되었다.
본 실험 결과를 통하여 surfactin이나 fengycin은 protease(type I) 또는 α-chymotrypsin의 처리에 영향을 받는 것으로 추정된다. 향후 각각의 정제된 항진균 활성 lipopeptides에 대한 효소 처리실험을 통하여 다양한 lipopeptide에 대한 효소의 영향은 보다 정확히 규명하여야 할 것이다.
0에서 활성이 저하되므로, B 분획에서 항진균 활성의 저하가 surfactin의 pH 영향일 것으로 추정되어진다. 현재까지 정제물로서 각각의 surfactin이나 fengycin의 pH 안정성 특성에 관한 실험보고는 없는 실정이므로, 향후 각각의 정제물 surfactin과 fengycin을 사용한 pH 안정성 특성이 규명되어야 할 것이다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	Bacillus 속이 생산하는 대표적인 peptide antibiotics의 종류는?	Bacillus 속은 오랜 세월동안 식품 및 각종 발효산업에서 널리 사용되어진 산업적으로 중요한 균주 중 하나로서 다양한 효소와 peptide antibiotics를 생산하는 것으로 알려져 있다[31]. Bacillus 속이 생산하는 peptide antibiotics로는 ribosome에서 합성되는 subtilin, subtilosin A, sublancin 등과 ribosome에서 합성되지 않는 surfactin, iturin, mycosubtilin, fengycin, bacilysin 등이 대표적이다[33]. Bacillus 속유래 peptide antibiotics 중 cyclic lipopeptides로는 surfactin, fengycin, iturin families가 잘 알려져 있으며, Bacillus lipopeptides는 양친매성 생물계면활성제(amphiphilic biosurfactant)의 특성과 강력한 항균 활성을 지니는 것으로서[33], fengycin과 iturin은 강력한 항진균 활성을 나타내며[25, 26], surfactin은 항세균, 항진균, 항바이러스 활성과 함께 항마이 코플라스마 효과와 혈전용해 작용 등을 지니는 것으로 알려져 있다[28].
	산업에서 Bacillus 속이란?	Bacillus 속은 오랜 세월동안 식품 및 각종 발효산업에서 널리 사용되어진 산업적으로 중요한 균주 중 하나로서 다양한 효소와 peptide antibiotics를 생산하는 것으로 알려져 있다[31]. Bacillus 속이 생산하는 peptide antibiotics로는 ribosome에서 합성되는 subtilin, subtilosin A, sublancin 등과 ribosome에서 합성되지 않는 surfactin, iturin, mycosubtilin, fengycin, bacilysin 등이 대표적이다[33].
	Bacillus 속이 생산하는 peptide antibiotics 중 surfactin의 기능성은?	Bacillus 속이 생산하는 peptide antibiotics로는 ribosome에서 합성되는 subtilin, subtilosin A, sublancin 등과 ribosome에서 합성되지 않는 surfactin, iturin, mycosubtilin, fengycin, bacilysin 등이 대표적이다[33]. Bacillus 속유래 peptide antibiotics 중 cyclic lipopeptides로는 surfactin, fengycin, iturin families가 잘 알려져 있으며, Bacillus lipopeptides는 양친매성 생물계면활성제(amphiphilic biosurfactant)의 특성과 강력한 항균 활성을 지니는 것으로서[33], fengycin과 iturin은 강력한 항진균 활성을 나타내며[25, 26], surfactin은 항세균, 항진균, 항바이러스 활성과 함께 항마이 코플라스마 효과와 혈전용해 작용 등을 지니는 것으로 알려져 있다[28]. Bacillus 속이 생산하는 lipopeptides는 낮은 독성과 높은 생물분해성(biodegradability) 그리고 친환경적인 특성을 가지므로 화학적 화합물을 대신하여 농업, 식품, 화장품, 제약 분야에서 생물학적 방제제 및 보존제, 생물계면 활성제로서의 활용 가치가 매우 크다[26].

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용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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