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문제 정의
- MALDI-TOF를 사용한 peptide mass fingerprinting은 2-DE 에서 변화된 발현을 보여준 단백질을 동정하기 위하여 실시되었다. MALDI-TOF 분석으로부터 얻어진 결과는 Table 1에 열거되었다.
- 이 연구의 목적은 국산 녹차(Camellia sinensis L.)에서 추출한 차폴리페놀(tea polyphenols, TPP)에 노출된 Salmonella typhimurium의 여러 가지 세포반응을 조사하는 것이다. TPP는 S.
- 이러한 배경을 바탕으로 녹차에서 추출된 TPP에 노출됨으로서, Salmonella typhimurium에서 유도된 단백질들의 특성을 조사하는데 적용하였다. 다양한 농도의 TPP에 노출된 S.
제안 방법
- 0)에서 2회 세척하여, 5,000 μg/ml TPP을 포함하는 potassium phosphate buffer에 재현탁시켰다. 12시간 배양 후, 지방산 조성은 위에서 기술된 방법에 따라 결정하였다.
- MALDI-TOF 분석으로부터 얻어진 결과는 Table 1에 열거되었다. 16개의 단백질은 성공적으로 동정되었으며, elucidated amino acid sequences를 사용하여 sequence homology에 의해 특성조사를 실시하였다. 2,000 μg/ml TPP에서 60분간 처리된 S.
- 2-DE protein profiles 분석은 S. typhimurium에서 세포 단백질이 TPP에 노출된 후에 증가 또는 감소여부를 조사하기 위하여, TPP 미처리 세균세포와 2,000 μg/ml TPP로 60분간 처리된 세포를 사용하여 실시되었다(Fig. 5).
- , 2002). FAME은 MIDI database에 의해 제공된 authentic standard의 retention time과 mass spectra을 비교하여 분석되었다. TPP에 대한 반응으로 변화된 지방산을 조사하기 위하여 세포들은 TSB에서 37℃, 24시간동안 배양하였으며, 수거된 세포는 potassium phosphate buffer (pH 7.
- S. typhimurium 세포를 다양한 농도의 TPP (1,000–4,000μg/ml)에 노출시킨 후에 경과시간에 따른 세포내에서 발현되는 스트레스 충격단백질의 발현을 조사하였다(Table 1).
- S. typhimurium 세포에 존재하는 phospholipid ester-linked fatty acids은 MIDI system (Microbial Insights, Inc., USA)를 사용한 fatty acid methyl esters (FAMEs)의 형태로 분석되었다. Fatty acid 추출은 사용자 매뉴얼에서 제시한 방법에 따라 수행되었다(Cho et al.
- typhimurium에서 생존율과 막 지방산 조성의 변화, 그리고 스트레스 충격단백질인 DnaK와 GroEL의 유도를 조사하였다. TPP의 노출에 따른 S. typhimurium의 사멸상태를 주사전자현미경을 통하여 관찰하였으며, TPP의 작용기작의 규명과 세포반응과 발현된 프로테옴의 분석을 통한 상관관계를 조사하였다.
- TSB에서 24시간동안 자란 S. typhimurium 세포에서, 그리고 3,000 μg/ml TPP를 포함하는 phosphate buffer에서 40분 동안 TSB에서 자란 세포에서 총 세포 지방산의 양을 비교하였다.
- typhimurium 세포를 포함하는 한천블록은 그 후 phosphate buffer에서 37℃, 12시간 동안 3,000 μg/ml TPP에 노출시켰다. 그후 TPP로 처리된 집 락들은 고정, 탈수, 금으로 코팅 등의 이전에 기술된 방법에 따라, Hitachi S-2500C 주사전자현미경(Hitachi, Japan)으로 조사하였다(Ho et al., 2004).
- 15 mM H3PO4에서 유지시켰다. 녹차추출물의 TPP에 포함된 카테킨을 HPLC로 분석하여(자료 미제시), 5가지의 주요 화합물을 동정하였으며, 그 성분과 농도는 각각 다음과 같았다: (-)-epigallocatechin gallate (EGCG) (～50%), (-)-epicatechin gallate (ECG) (～24%), (-)-gallocatechin gallate (GCG) (～16%), (-)-epicatechin (EC) (～2%), (-)-epigallocatechin (EGC) (～1%).
- 이러한 배경을 바탕으로 녹차에서 추출된 TPP에 노출됨으로서, Salmonella typhimurium에서 유도된 단백질들의 특성을 조사하는데 적용하였다. 다양한 농도의 TPP에 노출된 S. typhimurium에서 생존율과 막 지방산 조성의 변화, 그리고 스트레스 충격단백질인 DnaK와 GroEL의 유도를 조사하였다. TPP의 노출에 따른 S.
- 생존율 실험과 관련하여 TPP 노출에 따른 S. typhimurium 세포의 외부형태의 변화를 주사전자현미경을 사용하여 관찰하였다. 주사전자현미경 사진에서 보여주는 바와 같이, TPP에 노출되지 않은 상태에서 복합배지(LB)에서 자란 정상 세포들은 매끈한 표면의 전형적인 막대형을 보여주었다(Fig.
- typhimurium 세포를 다양한 농도의 TPP (1,000–4,000μg/ml)에 노출시킨 후에 경과시간에 따른 세포내에서 발현되는 스트레스 충격단백질의 발현을 조사하였다(Table 1). 충격단백질 DnaK와 GroEL의 발현정도를 알아보기 위하여 주어진 농도에서 20분 간격으로 TPP 충격에 의해 유도 발현되는 DnaK와 GroEL을 조사하였다. Fig.
대상 데이터
- 대략 150 protein spots가 isoelectric focusing (pH 4-7)의 2-DE gel과 12% polyacrylamide SDS gel상에서 검출되었다. 30 protein spots 이상이 TPP로 처리된 세균의 2-DE 상에서 발현되었으며, 이들 protein spots 가운데 TPP 처리에 의해 유도되어 크기가 증가된 16개를 동정하기 위하여 선발하였다.
- 녹차(Camellia sinensis, L)로부터 tea polyphenols (TPP, 순도 97% 이상)를 추출하였다. 녹차잎을 20% 에탄올에서 물중탕하고, 여과하여 추출액을 수거한 후, 50–60℃에서 감압농축하였다.
- 본 연구에서 사용된 S. typhimurium은 American Type Culture Collection (ATCC)에서 구입한 S. typhimurium 13311을 사용하였다. 이 균주는 Luria-Bertani (LB) 액체 또는 고체배지에 접종한 후, 분당 170회로 회전하는 37℃ 진탕배양기에서 배양유지 시키면서 실험에 사용하였다.
- typhimurium 13311을 사용하였다. 이 균주는 Luria-Bertani (LB) 액체 또는 고체배지에 접종한 후, 분당 170회로 회전하는 37℃ 진탕배양기에서 배양유지 시키면서 실험에 사용하였다.
이론/모형
- , USA)를 사용한 fatty acid methyl esters (FAMEs)의 형태로 분석되었다. Fatty acid 추출은 사용자 매뉴얼에서 제시한 방법에 따라 수행되었다(Cho et al., 2002). FAME은 MIDI database에 의해 제공된 authentic standard의 retention time과 mass spectra을 비교하여 분석되었다.
- SDS-PAGE 분석은 Bollag 등(1996)의 방법에 의해 실시되었다. Separating gel은 12% acrylamide gel을 사용하였으며, stacking gel은 4% acrylamide gel을 사용하였다.
- 전기영동을 한 후 gel은 staining solution으로 2시간 염색하였고, destaining solution I destaining solution II로 탈색하였다. 스트레스 충격단백질(DnaK와 GroEL)을 분석하기 위하여 Sambrook 등(2001)의 방법에 따라 Western blot을 실시하였다.
- 파쇄된 세포는 3,500×g로 30분간 원심분리한 후 단백질을 포함하고 있는 상등액을 취해 Bradford 방법(1976)을 이용하여 단백질 정량을 실시하였다.
성능/효과
- 2,000 μg/ml TPP에서 60분간 처리된 S. typhimurium 세포에서 항산화 및 무독성화(KatE, YfaE), chaperone protein HSP (DnaK, GroEL), 전사단백질, 에너지 대사에 관여(Trm, CysW, AcrA), DNA 대사(GyrA, Ssb) 등에 관여하는 단백질들이 1.8–12.3배의 범위에서 유도되었다(Table 2).
- 충격단백질 DnaK와 GroEL의 발현정도를 알아보기 위하여 주어진 농도에서 20분 간격으로 TPP 충격에 의해 유도 발현되는 DnaK와 GroEL을 조사하였다. Fig. 4에서 보여주는 바와 같이, TPP 농도가 낮을 때에 세균에서 발현되는 충격단백질은 노출시간에 경과 함에 따라 발현량이 증가하였으며, 또한 노출 TPP의 농도가 증가함에 따라 발현량도 증가하였다. S.
- S. typhimurium 세포가 2,000μg/ml TPP에 노출되었을 때, DnaK와 GroEL은 각각 40분과 60분에 최대 발현을 보여주었다(Table 1).
- typhimurium에 대하여 투여량에 비례한 살균효과를 보여주었다. TPP로 처리된 S. typhimurium 배양에서 세포막을 구성하는 포화 및 불포화 지방산은 조성에서 상당한 변화가 일어난 것으로 분석되었으며, 주사전자현미경 분석에서 아치사 농도의 TPP 로 처리된 세포는 세포표면에 구멍이 나고, 속이 움푹 패인 불규칙한 모양으로 관찰되었다. TPP에 노출된 S.
- typhimurium 배양에서 세포막을 구성하는 포화 및 불포화 지방산은 조성에서 상당한 변화가 일어난 것으로 분석되었으며, 주사전자현미경 분석에서 아치사 농도의 TPP 로 처리된 세포는 세포표면에 구멍이 나고, 속이 움푹 패인 불규칙한 모양으로 관찰되었다. TPP에 노출된 S. typhimurium 배양의 수용성 단백질 부분에 대한 이차원 폴리아크릴아미드 젤 전기영동에서 16개의 단백질이 TPP 노출에 의해 증가하는 것이 확인되었다. 항산화 및 chaperons, 전사 및 결합단백질, 에너지 및 DNA 대사 등에 수반되는 단백질을 포함하는 이들 유도된 단백질은 MALDI-TOF를 사용한 peptide mass fingerprinting에 의해 동정되었다.
- TPP의 농도증가에 따른 S. typhimurium의 노출은 TPP가 살균력을 가지고 있다는 것을 보여주었다. S.
- TSB에서 자란 S. typhimurium 세포에서 검출되지 않았던 지방산 18:1 iso, 19:0 cyclo ω8c는 TPP 에 노출된 세포의 총 세포 지방산들 가운데 각각 2.3%, 1.5% 증가하였다.
- typhimurium 세포가 2,000μg/ml TPP에 노출되었을 때, DnaK와 GroEL은 각각 40분과 60분에 최대 발현을 보여주었다(Table 1). 고농도의 TPP와 장시간의 노출에서 S. typhimurium 세포에서 유도되는 스트레스 충격 단백질은 크게 감소하였으며, 이 상태의 세포를 주사전자현미경으로 관찰하였을 때 형태의 변형과 손상이 이루어져 죽게되는 것이 관찰되었다.
- 5% 증가하였다. 더욱이 TSB에서 자란 S. typhimurium 세포에 존재하였던 지방산인 12:0 2OH와 16:1 iso는 TPP에 노출된 세포에서 검출되지 않았으며, 부가적으로 분석된 15:0 iso, 16:0 iso 3OH, 16:0 2OH 등의 지방산에서는 TPP 노출에 따른 변화가 관찰되지 않았다. 이와 유사한 실험이 5,000 μg/ml TPP에 12시간 노출된 E.
- , 2007). 본 연구에서 수행된 S. typhimurium의 결과를 E. coli 세포와 비교하여 볼 때, TPP 노출에 따른 지방산의 변화는 균주의 종류와 노출시간에 따라 달라지는 것으로 확인되었으며, 이러한 세포막 성분인 여러가지 지방산 변화 증감의 차이는 균주의 종류에 따른 세포막의 파괴 형태와도 연관이 있을 것으로 사료된다.
- 3배의 범위에서 유도되었다(Table 2). 이들 발견은 세포에서 방어기작과 관련된 TPP-유도 단백질들이 TPP 노출에서와 같은 좋지 않은 환경조건에 노출되었을 때 세포를 방어하거나 세포의 생존을 돕는데 중요한 역할을 한다는 것을 시사하였다.
후속연구
- , 2011). 향후의 연구는 녹차추출물을 구성성분이 가지는 항균활성에 대한 연구를 통하여 단일 천연 phytochemical의 항균활성을 비교평가하고, 그 기작을 밝히는 방향으로 추진되어야 할 것이다.
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