[논문]가시오가피 에탄올추출물의 AGS위암세포주에서 세포주기억제효과

이선동; 고성규; 신헌태; 신용철

[국내논문] 가시오가피 에탄올추출물의 AGS위암세포주에서 세포주기억제효과
The antitumor activities of Acanthopanax senticosus Harms(ASH) in human gastric cancer AGS cell lines 원문보기

대한예방한의학회지 = Journal of Society of Preventive Korean Medicine, v.15 no.3, 2011년, pp.127 - 140

이선동 (상지대학교 한의과대학 예방의학교실) , 고성규 (경희대학교 한의과대학 예방의학교실) , 신헌태 (동신대학교 한의과대학 예방의학교실) , 신용철 (경희대학교 한의과대학 예방의학교실)

Abstract ▼ AI-Helper

Objectives : The research was conducted to confirm the effect of Acanthopanax senticosus harms(ASH) on the anti-tumor activities in AGS human gastric cancer cells. Methods : To examine the potential anti-tumor effect of ASH, we performed many experiments. After processing AGS cancer cells with varying concentrations 80% ethanol ASH extract, analyses by MTT, flow cytometer(FACS) and western blot were used. Results : AGS cancer cells showed decreased cell proliferation and increased contents of S phase when treated with ASH. Moreover, the Western blot experiment showed that ASH affected S phase cell cycle-related molecules(Cyclin A, p21 and p16) in AGS cells. ASH also inhibited EGFR-STAT3 pathway in AGS human gastric cancer cells. Conclusion : Based on these results, we observed that ASH arrested the cell cycle at S phase and inhibited the phosphorylation of EGFR and STAT3 proteins which reduce the cell cycle and the manifestation of the genes that are related to inhibiting cell growth in AGS cells. It can be concluded that ASH can be used in developing medicine for gastric cancer.

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AI 본문요약
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문제 정의

또한 항알레르기,²⁰⁾ 항산화,²¹⁾ 항염증,²²⁾ 항암²³⁾의 효능도 가지고 있을 뿐만 아니라 류머티즘, 고혈압, 허혈성심장질환, 간염, 위궤양 치료제로도 사용되고 있다.^{21, 24-26)} 아직까지 위암에 대한 가시오가피의 연구는 미흡한 실정으로 본 연구에서는 가시오가피(Acanthopanax senticosus Harms)의 위암세포주의 증식을 억제하는 기전에 관한 내용을 보고하는 바이다.

제안 방법

etMaxim) Harms, ASH)는 옴니허브(Omniherb, Yeongcheon, Korea)에서 2010년에 구입하였다. 이것을 100g 정량 후 분쇄하여 80% 에탄올(1ℓ⨉2)을 가하여 30분씩 2회에 걸쳐 초음파진동을 이용하여 추출액을 획득하였다. 획득한 추출액을 지름이 185 mm인 종이여과지(Whatman, Maidstone, England)를 사용하여 감압 여과 한 후, 감압농축기(Eyela, Japan)를 사용하여 농축하였다.
이것을 100g 정량 후 분쇄하여 80% 에탄올(1ℓ⨉2)을 가하여 30분씩 2회에 걸쳐 초음파진동을 이용하여 추출액을 획득하였다. 획득한 추출액을 지름이 185 mm인 종이여과지(Whatman, Maidstone, England)를 사용하여 감압 여과 한 후, 감압농축기(Eyela, Japan)를 사용하여 농축하였다. 30분 동안 예비 동결을 시킨 후 동결건조기(Freezedryer, Matsushita, Japan)를 사용하여 48시간 동결건조 하였다.
획득한 추출액을 지름이 185 mm인 종이여과지(Whatman, Maidstone, England)를 사용하여 감압 여과 한 후, 감압농축기(Eyela, Japan)를 사용하여 농축하였다. 30분 동안 예비 동결을 시킨 후 동결건조기(Freezedryer, Matsushita, Japan)를 사용하여 48시간 동결건조 하였다. 최종적으로 분말 3.
80% 에탄올로 추출하고 DMSO에 녹여 놓은 가시오가피의 세포증식 정도를 MTT assay를 이용하여 확인하였다. 위암 AGS세포주를 well 당 배지 100 ㎕ 안에 각각 5×10³cells의 초기세포 농도로 96-well pate에 분주하였다.
가시오가피 에탄올 추출물이 위암 AGS세포 주의 세포사멸과 세포주기에 미치는 영향을 시간 별로 확인하기 위하여 100 mm dish에 6×105cells의 초기농도로 분주하여 5% CO2가 든 37℃ humidified incubator에서 배양하여 이것을 24시간 후에 가시오가피 에탄올 추출물과 DMSO를 각각 0.2%와 400 ㎍/㎖ 처리하여 12, 24, 36시간 동안 각각 배양하였다.
위암 AGS세포주를 well 당 배지 100 ㎕ 안에 각각 5×10³cells의 초기세포 농도로 96-well pate에 분주하였다. 5% CO₂가 든 37℃ humidified incubator에서 24시간 동안 배양 시킨 후에 DMSO에 녹인 가시오가피 에탄올 추출물과 DMSO(negative control)를 농도별(0, 10, 50, 100, 250, 500 ㎍/㎖)로 각각 분주한 세포에 처리하였다. 가시오가피 처리후 48, 72시간 동안 37℃ humidified incubator에서 배양하였다.
가시오가피 처리후 48, 72시간 동안 37℃ humidified incubator에서 배양하였다. 각각의 well에 MTT〔3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide〕 solution을 첨가(MTT solution 20 ㎕/배지 100 ㎕)하고 5% CO₂가 든 37℃ humidified incubator에서 2시간 정도 반응 시킨 후 440 nm파장에서 ELISA reader(Molecular Devices, Palo Alto, CA)를 사용하여 세포 증식 정도를 측정하였다.
가 든 37℃ humidified incubator에서 24시간 동안 배양시켰다. 아무것도 처리하지 않은 군(control group), DMSO 처리군(0.2%, negative control group), 가시오가피 에탄올 추출물(ASH) 처리군(400 ㎍/㎖, treatment group)을 12, 24, 36시간 배양한 후 현미경을 통하여 세포형태를 관찰하였다.
2%와 400 ㎍/㎖ 처리하여 12, 24, 36시간 동안 각각 배양하였다. 각각의 시간마다 세포를 수집하기 위해 트립신을 처리하여 dish 바닥에 붙어있는 세포들을 떼어내고 이를 튜브에 모아 1,500 rpm으로 5분 동안 원심 분리시켜 튜브바닥에 세포들을 모은다. 세포를 깨끗하게 하기 위해 Cold-PBS를 사용하여 다시 원심분리 한다.
세포사멸과 세포주기는 모두 유세포분석기(BD Biosciences)를 사용하여 측정한다. 특히 세포사멸은 DNA contents histogram을 이용하고 세포주기는 ModFit LT V2.0 프로그램을 사용하여 확인하였다. 또한 오가피에 의한 세포사멸과 세포주기의 변화를 농도 별로 확인하기 위해 세포를 분주한 후 24시간 배양시킨 후에 오가피를 100, 200, 400 ㎍/㎖ 처리하였다.
0 프로그램을 사용하여 확인하였다. 또한 오가피에 의한 세포사멸과 세포주기의 변화를 농도 별로 확인하기 위해 세포를 분주한 후 24시간 배양시킨 후에 오가피를 100, 200, 400 ㎍/㎖ 처리하였다. 24시간 동안 약 처리를 한 후에 위의 방법과 동일하게 세포를 수집하였다.
가시오가피가 AGS 위암세포주에서 항암효과가 있는지 확인하기 위해 가시오가피에 대한 세포주의 증식억제여부를 MTT assay를 통하여 확인하였다. 결과 DMSO군(가시오가피를 녹인 negative·vehicle group)에 비해 가시오가피를 농도별로(10, 50, 100, 250, 500 ㎍/㎖) 처리했을 때, 위암 세포주의 증식이 억제되는 것을 확인할 수 있었다.
세포증식 억제에 효과가 있는 가시오가피 400㎍/㎖ 농도를 AGS 세포주에 시간별(12, 24, 36시간)로 처리하였을 때, 세포형태에 변화가 있는지 현미경으로 관찰하였다(Fig 2). 결과 아무것도 처리하지 않은 control군과 DMSO 0.
가시오가피에 의한 위암 세포주의 증식억제와 세포사멸과의 관련성을 확인하기 위해 AGS 세포주에 400 ㎍/㎖ 농도로 시간별(12, 24, 36시간)로 처리 후, 유세포분석기를 이용하여 subG1의 DNA contents를 확인하였다(Fig 3A). 가시오가피가 AGS 세포주의 증식을 억제함에도 불구하고, sub-G1은 아무것도 처리하지 않은 그룹(Con)과 vehicle을 처리한 그룹(DMSO)에 비해 그리 크게 증가하지 않았다.
가시오가피가 AGS 세포주의 증식을 억제함에도 불구하고, sub-G1은 아무것도 처리하지 않은 그룹(Con)과 vehicle을 처리한 그룹(DMSO)에 비해 그리 크게 증가하지 않았다. 또한 가시오가피 농도에 의한 영향을 확인하기 위해 농도별(100, 200, 400 ㎍/㎖)로 24시간 동안 처리 후, sub-G1의 DNA contents를 확인하였다(Fig 3B). 결과 농도 의존적으로 sub-G1 약간 증가하기는 하지만, Con, DMSO에 비해 위암 세포주의 세포사멸에 가시오가피에 의한 영향이 경미함을 확인할 수 있었다(Fig 3B).
다음으로는 가시오가피에 대한 위암세포주의 증식억제와 세포주기와의 관련성을 확인하기 위해 AGS 세포주에 가시오가피를 400 ㎍/㎖ 농도로 시간별(12, 24, 36시간)로 처리 한 후, 유세포분석기를 이용하여 DNA contents histogram을 측정하고, ModFit LT V2.0 프로그램을 사용하여 세포주기를 분석하였다. 결과 시간 의존적으로 가시오가피에 의해 위암세포주의 S기가 32.
또한 항알레르기, 항산화, 항염증의 효능, 류마티즘, 고혈압 등의 치료제로도 사용되고 있으며, 항암 효능도 가지고 있는 것으로 알려져 있다.^{8, 32)} 그러나 아직까지 위암에 대한 가시오가피의 항암활성 기초 실험 연구가 많이 되어 있지 않아, 본 연구에서는 이러한 근거를 바탕으로 위암 세포주를 사용하여 80% 에탄올 가시오가피 추출물의 구체적인 항암효과 및 기전을 확인하였다.
다음 결과로부터 가시오가피 에탄올 추출물이 위암세포에 대한 증식억제와 관련된 항암 효능을 나타내고, 결국 가시오가피는 위암과 관련하여 증식억제 항암 효능을 타나낼 수 있는 약물로써의 가능성을 확인하였다. 다음으로 이러한 증식억제 기전을 확인하기 위해 가시오가피에 대한 세포사멸과 세포주기를 확인하였다. 세포사멸(apoptosis)의 경우 조직의 항상성을 유지하거나 발생 과정에서 개체를 보호하기 위한 일련의 진화적 과정으로 세포표면의 죽음 수용체(death receptor)를 통하는 외재적 경로(extrinsic pathway)와 미토콘드리아를 경유하는 내재적 경로(intrinsic pathway)로 나뉘고 이들 두 경로 모두 여러 종류의 caspase에 의해 조절된다.
1% Tween 20이 포함된 1X-PBS(1XPBST)로 15분 동안 washing(15분⨉3회)하고, 2차 항체를 1시간 정도 상온에서 반응시킨다. 그 후 0.1% Tween 20이 포함된 1X-PBS(1XPBST)로 1시간 washing(10분⨉6회)을 하고 chemiluminescence detection system(Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, England)을 사용하여 X-ray film으로 결과를 확인하였다.
(A) AGS cells were exposed to 400 ㎍/㎖ of ASH or 0.2% DMSO for 12, 24, and 36 h, fixed in ethanol, and stained with propidium iodide, and cell cycle distribution was analyzed using a FACStar flow cytometer(Becton-Dickinson). The percentage of cells in each phase of the cell cycle was obtained by MODFIT software.

대상 데이터

실험에 사용한 α-actin, Bax, Bcl-2, CDK2, cleaved caspase-9, cyclin A, cyclin D, cyclin E, ERK, p16, phospho-ERK(Tyr-204), procaspase-9의 1차 항체는 Santa Cruz Biotechnology, Inc(Santa Cruz, CA, USA)에서 cleaved caspase-3, cleaved caspase-8, Fas, PARP, phospho-PI3K, procaspase-3, EGFR, phosphoEGFR(Y1068 & Y1173) 1차 항체는 Cell Signaling Technology, Inc(Danvers, MA, USA)에서 구입하였다.
위암 AGS세포주를 well 당 배지 100 ㎕ 안에 각각 5×103cells의 초기세포 농도로 96-well pate에 분주하였다.
본 실험에 사용한 AGS 세포주(a human gastric carcinoma epithelial cell line)는 점액분비 표피세포를 포함하는 인간 위 선암종에서 유래되었고,²⁷⁾ 이 세포주는 까다로운 특징들을 지니고 있지 않아 널리 실험에 사용되고 있다.^28-31) 실험에 사용하기 위해서 미국 세포주은행(American Type Culture Collection, USA)을 통하여 구입하였고, RPMI-1640(Welgene, Korea) 배지를 사용하여 각각 10%(v/v) 우태혈청 [heat-inactivated fetal bovine serum(Welgene)]과 1% 항생제 [antibiotic-antimycotic(Welgene, Korea)]를 넣어 5% CO₂가 든 37℃ humidified incubator(Sanyo, model MCO96, Japan)에 키운다.
28-31) 실험에 사용하기 위해서 미국 세포주은행(American Type Culture Collection, USA)을 통하여 구입하였고, RPMI-1640(Welgene, Korea) 배지를 사용하여 각각 10%(v/v) 우태혈청 [heat-inactivated fetal bovine serum(Welgene)]과 1% 항생제 [antibiotic-antimycotic(Welgene, Korea)]를 넣어 5% CO₂가 든 37℃ humidified incubator(Sanyo, model MCO96, Japan)에 키운다. 배양 된 각각의 세포는 일주일에 2～3회 DPBS(Welgene, Korea)로 세척한 후 0.
실험에 사용한 α-actin, Bax, Bcl-2, CDK2, cleaved caspase-9, cyclin A, cyclin D, cyclin E, ERK, p16, phospho-ERK(Tyr-204), procaspase-9의 1차 항체는 Santa Cruz Biotechnology, Inc(Santa Cruz, CA, USA)에서 cleaved caspase-3, cleaved caspase-8, Fas, PARP, phospho-PI3K, procaspase-3, EGFR, phosphoEGFR(Y1068 & Y1173) 1차 항체는 Cell Signaling Technology, Inc(Danvers, MA, USA)에서 구입하였다. PI3K, phospho-STAT3(Tyr 705)의 1차 항체는 Upstate Biotechnology, Inc (Lake Placid, NY, USA)에서 구입했으며 p271차 항체는 Transduction Laboratories(Lexington, KY, USA)에서 구입하였다. HRP가 결합되어 있는 mouse, rabbit의 2차 항체는 Calbiochem(San Diego, CA, USA)에서, goat는 Jackson ImmunoResearch(West Grove, PA, USA)에서 구입하였다.
PI3K, phospho-STAT3(Tyr 705)의 1차 항체는 Upstate Biotechnology, Inc (Lake Placid, NY, USA)에서 구입했으며 p271차 항체는 Transduction Laboratories(Lexington, KY, USA)에서 구입하였다. HRP가 결합되어 있는 mouse, rabbit의 2차 항체는 Calbiochem(San Diego, CA, USA)에서, goat는 Jackson ImmunoResearch(West Grove, PA, USA)에서 구입하였다.
실험에 사용된 한약재인 가시오가피(Acanthopanax senticosus(Rupr.etMaxim) Harms, ASH)는 옴니허브(Omniherb, Yeongcheon, Korea)에서 2010년에 구입하였다. 이것을 100g 정량 후 분쇄하여 80% 에탄올(1ℓ⨉2)을 가하여 30분씩 2회에 걸쳐 초음파진동을 이용하여 추출액을 획득하였다.
30분 동안 예비 동결을 시킨 후 동결건조기(Freezedryer, Matsushita, Japan)를 사용하여 48시간 동결건조 하였다. 최종적으로 분말 3.9g(수율 3.9%)의 ASH 분말을 얻어 DMSO(Dimethyl sulfoxide, sigma, USA)에 vortexing하여 녹인 후 syringe filter (0.20 ㎛, Sartorius, Germany)를 이용하여 여과한 후 실험에 사용하였다.

데이터처리

본 실험에서 얻은 결과의 측정값을 Mean(평균)±S.E(표준오차)로 처리했으며, student t-testmethod(unpaired)로 분석하여 p값이 0.05 이하일 때 통계적 유의성을 인정하였다.

이론/모형

또한 가시오가피를 농도별(100, 200, 400 ㎍/㎖)로 24시간동안 처리한 결과에서도 S 기의 증가가 관찰되었다(data not shown). 다음으로는 가시오가피를 처리했을 때, 세포주기와 관련된 단백질의 발현변화를 확인하기 위해 Western blotting을 수행하였다(Fig 4C and 4D). 그 결과 S기와 관련된 Cyclin A의 발현이 감소함을 확인하였고, cyclin의존적 인산화효소 억제제(Cyclin-dependent kinase inhibitor)로 알려진 p27과 p16의 발현도 증가함을 확인할 수 있었다.

성능/효과

^1-3) 우리나라에서도 남자에서 가장 많이 발생하는 암이며, 여자의 경우 갑상샘암, 유방암, 위암, 대장암의 순으로 발생된다.⁴⁾ 위암의 병기별 생존율은 1기 93.9%, 2기 74.1%, 3기 42.3%, 4기는 5.5%로 3기 이상 진행된 경우 여전히 사망률이 높은 실정이다.⁵⁾ 위암을 유발할 수 있는 위험요소로는 흡연, 염분, 아질산염이 풍부한 음식과 야채, 과일의 부족한 섭취, 헬리코박터 파일로리균 등이 보고되고 있다.
결과 DMSO군(가시오가피를 녹인 negative·vehicle group)에 비해 가시오가피를 농도별로(10, 50, 100, 250, 500 ㎍/㎖) 처리했을 때, 위암 세포주의 증식이 억제되는 것을 확인할 수 있었다.
결과 DMSO군(가시오가피를 녹인 negative·vehicle group)에 비해 가시오가피를 농도별로(10, 50, 100, 250, 500 ㎍/㎖) 처리했을 때, 위암 세포주의 증식이 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 또한 이러한 결과는 시간 의존적으로 48시간 보다 72시간에서 가시오가피에 의한 세포의 증식 억제정도가 큰 것을 확인하였다(Fig 1).
가시오가피에 의한 위암 세포주의 증식억제와 세포사멸과의 관련성을 확인하기 위해 AGS 세포주에 400 ㎍/㎖ 농도로 시간별(12, 24, 36시간)로 처리 후, 유세포분석기를 이용하여 subG1의 DNA contents를 확인하였다(Fig 3A). 가시오가피가 AGS 세포주의 증식을 억제함에도 불구하고, sub-G1은 아무것도 처리하지 않은 그룹(Con)과 vehicle을 처리한 그룹(DMSO)에 비해 그리 크게 증가하지 않았다. 또한 가시오가피 농도에 의한 영향을 확인하기 위해 농도별(100, 200, 400 ㎍/㎖)로 24시간 동안 처리 후, sub-G1의 DNA contents를 확인하였다(Fig 3B).
0 프로그램을 사용하여 세포주기를 분석하였다. 결과 시간 의존적으로 가시오가피에 의해 위암세포주의 S기가 32.21%(12시간)에서 57.39%(36시간)로 증가하여 세포주기를 억제시키는 것을 확인했다(Fig 4A and B). 또한 가시오가피를 농도별(100, 200, 400 ㎍/㎖)로 24시간동안 처리한 결과에서도 S 기의 증가가 관찰되었다(data not shown).
다음으로는 가시오가피를 처리했을 때, 세포주기와 관련된 단백질의 발현변화를 확인하기 위해 Western blotting을 수행하였다(Fig 4C and 4D). 그 결과 S기와 관련된 Cyclin A의 발현이 감소함을 확인하였고, cyclin의존적 인산화효소 억제제(Cyclin-dependent kinase inhibitor)로 알려진 p27과 p16의 발현도 증가함을 확인할 수 있었다. 이러한 결과로 볼 때, 가시오가피 의한 AGS 위암 세포주의 증식억제는 세포주기억제와 관련된다는 것을 알 수 있었다.
그 결과 S기와 관련된 Cyclin A의 발현이 감소함을 확인하였고, cyclin의존적 인산화효소 억제제(Cyclin-dependent kinase inhibitor)로 알려진 p27과 p16의 발현도 증가함을 확인할 수 있었다. 이러한 결과로 볼 때, 가시오가피 의한 AGS 위암 세포주의 증식억제는 세포주기억제와 관련된다는 것을 알 수 있었다.
가시오가피가 세포 증식에 관련된 PI3K, ERK, EGFR pathway 단백질의 발현에도 영향을 미치는지 확인한 결과, PI3K/phospho-PI3K와 ERK/phospho-ERK 단백질의 발현단계에는 아무런 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다(Fig 5A). 하지만 EGFR-STAT3 경로에서 가시오가피가 EGFR과 STAT3의 인산화(phosphorylation)를 억제시키는 것을 확인할 수 있었다(Fig 5B).
가시오가피 에탄올 추출물에 대한 항암작용을 확인하기 위해 AGS 위암세포주에 가시오가피를 처리한 결과 가시오가피가 위암 세포주의 증식을 농도와 시간 의존적으로 억제시킨다는 것을 확인하였다(Fig 1). 또한 현미경을 통한 세포형태 관찰 결과에서도 마찬가지로 가시오가피 에탄올 추출물을 처리한 실험군에서 아무것도 처리하지 않은 Control(Con) 그룹과 vehicle (DMSO) 그룹에 비해 위암 세포주의 증식을 억제시키는 것을 확인할 수 있었다(Fig 2).
가시오가피 에탄올 추출물에 대한 항암작용을 확인하기 위해 AGS 위암세포주에 가시오가피를 처리한 결과 가시오가피가 위암 세포주의 증식을 농도와 시간 의존적으로 억제시킨다는 것을 확인하였다(Fig 1). 또한 현미경을 통한 세포형태 관찰 결과에서도 마찬가지로 가시오가피 에탄올 추출물을 처리한 실험군에서 아무것도 처리하지 않은 Control(Con) 그룹과 vehicle (DMSO) 그룹에 비해 위암 세포주의 증식을 억제시키는 것을 확인할 수 있었다(Fig 2). 다음 결과로부터 가시오가피 에탄올 추출물이 위암세포에 대한 증식억제와 관련된 항암 효능을 나타내고, 결국 가시오가피는 위암과 관련하여 증식억제 항암 효능을 타나낼 수 있는 약물로써의 가능성을 확인하였다.
이는 가시오가피가 위암세포주에 대해 세포사멸을 유도하지 않는 것으로 사료되었다(Fig 3). 반면에, 가시오가피에 의한 세포주기 변화를 분석한 결과 가시오가피를 시간별로 처리하였을 때 S기가 증가하여 세포주기를 억제시키는 것을 확인하였고, 400 ㎍/㎖ 농도에서 12, 24시간에는 S기와 G₀/G₁기가 함께 증가하다가 36시간에 S기가 약 60%에 이르는 증가를 보여 가시오가피의 처리 농도와 시간에 따라 세포주기를 조절하는 양상이 다름을 유추해 볼 수 있다. 또한 세포주기와 관련된 단백질의 발현을 확인해본 결과, 가시오가피는 세포주기 각 단계에서 CDKs활성을 조절하는 세포내 CDKIs인 p27또는 p16의 발현을 증가시키고 cyclin A의 발현을 시간의존적으로 감소시켜 세포주기를 차단하고 결국 위암세포주의 증식을 억제한다는 것을 확인하였다(Fig 4).
반면에, 가시오가피에 의한 세포주기 변화를 분석한 결과 가시오가피를 시간별로 처리하였을 때 S기가 증가하여 세포주기를 억제시키는 것을 확인하였고, 400 ㎍/㎖ 농도에서 12, 24시간에는 S기와 G₀/G₁기가 함께 증가하다가 36시간에 S기가 약 60%에 이르는 증가를 보여 가시오가피의 처리 농도와 시간에 따라 세포주기를 조절하는 양상이 다름을 유추해 볼 수 있다. 또한 세포주기와 관련된 단백질의 발현을 확인해본 결과, 가시오가피는 세포주기 각 단계에서 CDKs활성을 조절하는 세포내 CDKIs인 p27또는 p16의 발현을 증가시키고 cyclin A의 발현을 시간의존적으로 감소시켜 세포주기를 차단하고 결국 위암세포주의 증식을 억제한다는 것을 확인하였다(Fig 4). 또한 가시오가피에 의한 세포증식에 관련된 여러 경로들의 변화를 확인해본 결과 PI3K/phospho-PI3K, ERK/phosphoERK 단백질들의 발현에는 변화가 없었지만(Fig 5A), EGFR-STAT3 경로에서 가시오가피에 의해 EGFR과 STAT3의 인산화(phosphorylation)을 감소시키는 것을 알 수 있었다(Fig 5B).
또한 세포주기와 관련된 단백질의 발현을 확인해본 결과, 가시오가피는 세포주기 각 단계에서 CDKs활성을 조절하는 세포내 CDKIs인 p27또는 p16의 발현을 증가시키고 cyclin A의 발현을 시간의존적으로 감소시켜 세포주기를 차단하고 결국 위암세포주의 증식을 억제한다는 것을 확인하였다(Fig 4). 또한 가시오가피에 의한 세포증식에 관련된 여러 경로들의 변화를 확인해본 결과 PI3K/phospho-PI3K, ERK/phosphoERK 단백질들의 발현에는 변화가 없었지만(Fig 5A), EGFR-STAT3 경로에서 가시오가피에 의해 EGFR과 STAT3의 인산화(phosphorylation)을 감소시키는 것을 알 수 있었다(Fig 5B). 특히 EGFR/ErbB1은 receptor tyrosine kinases (RTKs)의 ErbB family에 속하는 것으로 인간 암세포에서 발현이 현저히 증가해 있는 것으로 알려져 있고,^33-36) 이들 수용체(epithermal growth factor receptor, EGFR)에 성장인자(epithermal growth factor, EGF)가 결합하면 이 경로에 의해 활성화 될 수 있는 타겟분자의 DNA에 STAT3 전사인자(transcription factor)가 결합하여 타켓 분자의 발현을 조절하게 된다.
1. 가시오가피 에탄올 추출물이 위암세포주의 증식 농도와 시간 의존적으로 억제시켰다.
2. 가시오가피 에탄올 추출물의 위암세포주 증식억제기전과 관련하여 세포사멸과 상관없이, cyclin A의 감소, p16 및 p27의 증가를 통해 세포주기의 이행을 억제시키는 것을 확인하였다.
3. 가시오가피 에탄올 추출물은 세포증식에 관련된 EGFR-STAT3 경로에서 EGFR과 STAT3의 인산화(phosphorylation)을 억제하였다.
세포증식 억제에 효과가 있는 가시오가피 400㎍/㎖ 농도를 AGS 세포주에 시간별(12, 24, 36시간)로 처리하였을 때, 세포형태에 변화가 있는지 현미경으로 관찰하였다(Fig 2). 결과 아무것도 처리하지 않은 control군과 DMSO 0.2%를 처리한 대조군에서는 36시간이 되었을 때 세포가 증식하였으며, 둥근 형태의 세포모양에도 변화가 없었다. 반면, 가시오가피 400 ㎍/㎖ 농도를 처리한 실험군에서는 대조군과 비교했을 때, 12시간부터 생존세포 수에 차이가 보였으며, 36시간이 되었을 때는 생존세포 수 차이 뿐 아니라 세포형태도 길쭉한 모양의 세포가 관찰되었다.
또한 가시오가피 농도에 의한 영향을 확인하기 위해 농도별(100, 200, 400 ㎍/㎖)로 24시간 동안 처리 후, sub-G1의 DNA contents를 확인하였다(Fig 3B). 결과 농도 의존적으로 sub-G1 약간 증가하기는 하지만, Con, DMSO에 비해 위암 세포주의 세포사멸에 가시오가피에 의한 영향이 경미함을 확인할 수 있었다(Fig 3B). 다음으로는 가시오가피를 처리했을 때, 세포사멸과 관련된 단백질의 발현이 어떻게 변화하는지를 Western blotting으로 확인하였다(Fig.
또한 현미경을 통한 세포형태 관찰 결과에서도 마찬가지로 가시오가피 에탄올 추출물을 처리한 실험군에서 아무것도 처리하지 않은 Control(Con) 그룹과 vehicle (DMSO) 그룹에 비해 위암 세포주의 증식을 억제시키는 것을 확인할 수 있었다(Fig 2). 다음 결과로부터 가시오가피 에탄올 추출물이 위암세포에 대한 증식억제와 관련된 항암 효능을 나타내고, 결국 가시오가피는 위암과 관련하여 증식억제 항암 효능을 타나낼 수 있는 약물로써의 가능성을 확인하였다. 다음으로 이러한 증식억제 기전을 확인하기 위해 가시오가피에 대한 세포사멸과 세포주기를 확인하였다.
암세포에 항암제를 처리하였을 때 인위적으로 세포사멸을 유도하거나, 세포주기 중 일정한 단계에 머무르게 하면서 세포의 증식을 억제시키는 것을 볼 수 있는데 이런 현상은 항암효과를 나타내는 대표적인 특징으로 알려져 있다. 가시오가피 에탄올 추출물의 세포사멸과 관련된 증식억제 기능을 확인하기 위해 가시오가피 400 ㎍/㎖를 시간별(12, 24, 36 h)로, 농도별로(100, 200, 400 ㎍/㎖) 처리한 결과 sub-G₁ fraction 비율은 아무것도 처리하지 않은 Control(Con) 그룹과 vehicle(DMSO) 그룹에 비해 크게 증가되지 않은 것을 확인할 수 있었고, 외재적 경로와 관련된 분자(Fas, caspase8)와 내재적 경로와 관련된 분자(Bax-Bcl2 ratio, caspase-9), 또한 이들 두 경로와 모두 관련된 capase-3, PARP의 발현에 아무런 영향을 미치지 못했음을 확인할 수 있었다. 이는 가시오가피가 위암세포주에 대해 세포사멸을 유도하지 않는 것으로 사료되었다(Fig 3).

후속연구

이러한 결과로부터 본 저자는 가시오가피에 의한 위암세포주의 세포주기 이행 억제 및 EGFRSTAT3 억제를 통해 항암효과에 대한 가능성을 발견하여 위암치료제나 개발에 가시오가피가 활용될 수 있을 것으로 기대한다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	위암은 어느 나라에서 발생하나?	위암은 일본, 중국, 한국 등의 아시아에서 높게 발생하며, 남아메리카, 동유럽 등에서도 다빈도로 발생한다.1-3) 우리나라에서도 남자에서 가장 많이 발생하는 암이며, 여자의 경우 갑상샘암, 유방암, 위암, 대장암의 순으로 발생된다.
	위암의 병기별 생존율은 어떻게 되는가?	1-3) 우리나라에서도 남자에서 가장 많이 발생하는 암이며, 여자의 경우 갑상샘암, 유방암, 위암, 대장암의 순으로 발생된다.4) 위암의 병기별 생존율은 1기 93.9%, 2기 74.1%, 3기 42.3%, 4기는 5.5%로 3기 이상 진행된 경우 여전히 사망률이 높은 실정이다.5) 위암을 유발할 수 있는 위험요소로는 흡연, 염분, 아질산염이 풍부한 음식과 야채, 과일의 부족한 섭취, 헬리코박터 파일로리균 등이 보고되고 있다.
	위암세포주인 AGS에 80% 에탄올 가시오가피 추출액을 처리하여 얻은 결론은 무엇인가?	1. 가시오가피 에탄올 추출물이 위암세포주의 증식 농도와 시간 의존적으로 억제시켰다. 2. 가시오가피 에탄올 추출물의 위암세포주 증식억제기전과 관련하여 세포사멸과 상관없이, cyclin A의 감소, p16 및 p27의 증가를 통해 세포주기의 이행을 억제시키는 것을 확인하였다. 3. 가시오가피 에탄올 추출물은 세포증식에 관련된 EGFR-STAT3 경로에서 EGFR과 STAT3의 인산화(phosphorylation)을 억제하였다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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