국내에 자생 중인 큰엉겅퀴(Cirsium pendulum)를 강원도의 홍천, 원주, 평창, 양양 및 경기도 가평과 충청북도의 충주에서 채취하고, 고려엉겅퀴(Cirsium setidens)를 강원도의 태백 및 경상북도의 봉화에서 채취하였다. 채취된 식물들의 genomic DNA를 분리하여서 18S rDNA, ITS1, 5.8S rDNA, ITS2 및 28S rDNA의 일부를 증폭하고, 그 염기서열을 분석하였다. 이렇게 얻어진 염기서열을 GenBank에 등록하고, 서로 비교해 보았다. 그 결과 큰엉겅퀴는 6개체 모두에서 18S rDNA 및 5.8S rDNA의 염기서열은 서로 완전히 일치하고 있으나, ITS1과 ITS2의 염기서열에서는 약간의 차이를 보였다. 고려엉겅퀴의 경우에는 18S rDNA, ITS1 및 ITS2에서 2개체가 서로 비교적 큰 차이를 보였다. 일본의 홋카이도에서 채취된 큰엉겅퀴와 중국의 안휘성에서 채취된 엉겅퀴(Cirsium japonicum)를 포함하여서 ITS1과 ITS2 염기서열을 비교한 결과, 엉겅퀴, 큰엉겅퀴, 고려엉겅퀴는 확연하게 서로 다른 그룹을 형성하는 것으로 나타났다. 또한 채취된 큰엉겅퀴 및 고려엉겅퀴들의 silymarin 함량을 분석해 본 결과, 모두에서 그 함량이 2 mg/ml가 넘는 것으로 나타났다. 따라서 엉겅퀴뿐만 아니라 큰엉겅퀴나 고려엉겅퀴도 여러 가지 약리작용을 가진 것으로 보고된 silymarin을 상당히 높은 농도로 함유하고 있는 것으로 나타났다.
국내에 자생 중인 큰엉겅퀴(Cirsium pendulum)를 강원도의 홍천, 원주, 평창, 양양 및 경기도 가평과 충청북도의 충주에서 채취하고, 고려엉겅퀴(Cirsium setidens)를 강원도의 태백 및 경상북도의 봉화에서 채취하였다. 채취된 식물들의 genomic DNA를 분리하여서 18S rDNA, ITS1, 5.8S rDNA, ITS2 및 28S rDNA의 일부를 증폭하고, 그 염기서열을 분석하였다. 이렇게 얻어진 염기서열을 GenBank에 등록하고, 서로 비교해 보았다. 그 결과 큰엉겅퀴는 6개체 모두에서 18S rDNA 및 5.8S rDNA의 염기서열은 서로 완전히 일치하고 있으나, ITS1과 ITS2의 염기서열에서는 약간의 차이를 보였다. 고려엉겅퀴의 경우에는 18S rDNA, ITS1 및 ITS2에서 2개체가 서로 비교적 큰 차이를 보였다. 일본의 홋카이도에서 채취된 큰엉겅퀴와 중국의 안휘성에서 채취된 엉겅퀴(Cirsium japonicum)를 포함하여서 ITS1과 ITS2 염기서열을 비교한 결과, 엉겅퀴, 큰엉겅퀴, 고려엉겅퀴는 확연하게 서로 다른 그룹을 형성하는 것으로 나타났다. 또한 채취된 큰엉겅퀴 및 고려엉겅퀴들의 silymarin 함량을 분석해 본 결과, 모두에서 그 함량이 2 mg/ml가 넘는 것으로 나타났다. 따라서 엉겅퀴뿐만 아니라 큰엉겅퀴나 고려엉겅퀴도 여러 가지 약리작용을 가진 것으로 보고된 silymarin을 상당히 높은 농도로 함유하고 있는 것으로 나타났다.
Cirsium pendulum plants were collected from Hongcheon, Pyeongchang, Wonju, Yangyang in Kangwondo, Gapyeong in Gyeongkido, and Choongju in Choongcheongbukdo. Cirsium setidens plants were collected from Taebaek in Kangwondo and Bonghwa in Kyeongsangbukdo. Genomic DNA was prepared from those plants and...
Cirsium pendulum plants were collected from Hongcheon, Pyeongchang, Wonju, Yangyang in Kangwondo, Gapyeong in Gyeongkido, and Choongju in Choongcheongbukdo. Cirsium setidens plants were collected from Taebaek in Kangwondo and Bonghwa in Kyeongsangbukdo. Genomic DNA was prepared from those plants and used for the amplification of 18S rDNA, ITS1, 5.8S rDNA, ITS2, and part of 28S rDNA. The PCR products were sequenced, and the sequence was deposited in the GenBank. The comparison of those sequences has revealed that the rDNA sequences are identical for all six C. pendulum plants, but that the ITS1 and ITS2 sequences contain variable nucleotides. The two C. setidens plants had different nucleotides in 18S rDNA, ITS1, and ITS2. The comparison of the DNA sequences of C. pendulum and C. setidens collected in this study with C. pendulum of Hokkaido in Japan and C. japonicum of Anhui in China indicated that the plants of those three species are clearly divided into three distinct groups. The silymarin content of the collected plants was analyzed and turned out to be quite high. Therefore, it has been found that both C. pendulum and C. setidens plants are producing large amounts of silymarin, which has been reported to have various medicinal effects.
Cirsium pendulum plants were collected from Hongcheon, Pyeongchang, Wonju, Yangyang in Kangwondo, Gapyeong in Gyeongkido, and Choongju in Choongcheongbukdo. Cirsium setidens plants were collected from Taebaek in Kangwondo and Bonghwa in Kyeongsangbukdo. Genomic DNA was prepared from those plants and used for the amplification of 18S rDNA, ITS1, 5.8S rDNA, ITS2, and part of 28S rDNA. The PCR products were sequenced, and the sequence was deposited in the GenBank. The comparison of those sequences has revealed that the rDNA sequences are identical for all six C. pendulum plants, but that the ITS1 and ITS2 sequences contain variable nucleotides. The two C. setidens plants had different nucleotides in 18S rDNA, ITS1, and ITS2. The comparison of the DNA sequences of C. pendulum and C. setidens collected in this study with C. pendulum of Hokkaido in Japan and C. japonicum of Anhui in China indicated that the plants of those three species are clearly divided into three distinct groups. The silymarin content of the collected plants was analyzed and turned out to be quite high. Therefore, it has been found that both C. pendulum and C. setidens plants are producing large amounts of silymarin, which has been reported to have various medicinal effects.
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문제 정의
우리나라에서는 통상 엉겅퀴 아족에 속하는 식물들을 모두 엉겅퀴라고 부르기도 하지만, 구체적인 종(species)을 지칭할 때에는 Cirsium japonicum 종에 속하는 식물을 엉겅퀴라고 하고 나머지 종들을 다른 이름으로 부르기도 한다. 따라서 본 논문에서는 혼선을 피하기 위해서 C. japonicum 종의 식물들만을 엉겅퀴로 지칭하기로 한다.
이러한 식물들의 국내 분포에 대해서도 특정 지역에서 국지적으로 발견되었다는 보고는 있으나, 전국적 분포에 대해서 체계적인 설명을 제공하는 자료는 발견할 수 없었다[3,13,14,18,19]. 따라서 본 연구에서는 국내에 자생하는 큰엉겅퀴와 고려엉겅퀴의 분포에 대한 연구를 시도해 보았다. 그 결과, 강원도의 홍천, 평창, 원주, 양양과 강원도에 인접한 경기도 가평, 충청북도 충주에서 큰엉겅퀴를 채집할 수 있었다.
엉겅퀴 추출물의 항미생물 활성에 대해서도 보고된 적이 있는데, silymarin 중에서 silybin이 Bacillus subtilis와 Staphylococcus epidermidis와 같은 그람(Gram) 양성 세균에 대해서 강력한 증식억제능이 있다는 보고가 있었고[11], 지느러미엉겅퀴의 추출물이 역시 그람 양성 세균인 Mycobacterium fortuitum과 Mycobacterium smegmatis에 대한 증식억제능이 있다는 보고가 있었다[2]. 따라서 본 연구에서는 큰엉겅퀴 및 고려엉겅퀴에서도 silymarin이 존재하는 지를 시험하기 위해서 화학적 분석도 수행하였다.
또한 강원도 태백시와 이에 인접한 경상북도 봉화에서는 고려엉겅퀴를 채집할 수 있었다(Table 1). 본 연구에서는 이렇게 채집된 큰엉겅퀴와 고려엉겅퀴들의 정확한 동정(identification) 및 분자유전학적 분석을 위해서 18S rDNA, ITS1, 5.8S rDNA, ITS2의 전부 및 28S rDNA의 일부 염기서열을 밝혀서 서로 비교해 보았다.
가설 설정
A, Trees constructed based on ITS1 sequences. B, Trees constructed based on ITS2 sequences.
제안 방법
PCR products는 agarose gel에서 분자량에 따라 separation 시킨 후, 예상되는 크기의 DNA를 surgical blade로 잘라내고, Promega의 Gel and PCR purification system을 사용하여 gel slice로부터 DNA를 정제 하였다. 이렇게 정제된 PCR product는 SmaⅠ으로 절단된 pBluscript Ⅱ SK-와 섞어서 ligation 시키고, E.
PCR 반응을 위해서는 DNA template 200 ng, forward primer 2.5 pmol, reverse primer 2.5 pmol, dNTPs mixture 2 μl (10 nM each) 그리고 Pfu DNA polymerase 2 μl (6 U)를 포함하는 100 μl의 반응액에서 반응을 진행하였다.
8S rDNA 및 ITS2의 염기서열을 밝혔다. PCR에 사용된 primers는 18S rDNA, ITS1, 5.8S rDNA, ITS2의 전부, 그리고 26S rDNA의 일부를 증폭할 수 있도록 고안하여 사용하였다(Table 2). 이 경우에 예상되는 PCR 산물의 크기는 대략 2.
가평, 홍천, 충주, 평창 그리고 일본 홋카이도 큰엉겅퀴, 중국의 안휘성에서 채취된 엉겅퀴(C. japonicum) 및 태백, 봉화 고려엉겅퀴의 ITS1 및 ITS2 염기서열을 비교하여 neighbor-joining tree를 작성해 보았다(Fig. 2). 이러한 phylogenetic tree를 살펴보면, 비록 평창 큰엉겅퀴가 나머지 큰엉겅퀴들과 약간의 거리를 보여주더라도 여전히 큰엉겅퀴들은 엉겅퀴나 고려엉겅퀴와는 확연하게 구분되는 그룹에 같이 속한다는 것을 알 수 있다.
채집된 엉겅퀴들의 형태에 의한 동정을 위해서는 잎, 꽃, 화서, 총포 등의 기관별 형태학적 특징들에 대해서 식물도감 및 논문을 참고하였다[12,16]. 계통분류학적 분석을 위해서는 수집된 식물들의 genomic DNA를 추출하고, 이를 template로 하는 PCR을 수행하여 18S rDNA, internal transcribed spacer (ITS) 1, 5.8S rDNA 및 ITS2의 염기서열을 밝혔다. PCR에 사용된 primers는 18S rDNA, ITS1, 5.
흰색 colony들을 selection하여서 이들로부터 plasmid DNA를 추출한 후에, supercoiled plasmid DNA 및 PvuⅡ로 절단된 plasmid DNA를 agarose gel electrophoresis로 분석하였다. 그 결과, 예상되는 크기의 PCR 산물이 얻어졌으므로 이러한 DNA들의 염기서열분석을 (주)솔젠트에 의뢰하였다.
분석에 사용된 column은 Sunfire column 4.6×150 mm으로서 column의 온도는 40℃로 유지시켰고, 파장 288 nm에서 absorbance peak들을 확인하여 silymarin의 존재여부를 확인하였다.
이때에 식물들의 18S rDNA에서 존재하지 않는 제한효소 BglⅡ의 인식부위를 forward primer의 5'-말단에 첨가하여서 cloning시에 사용할 수 있도록 하였다.
채집된 엉겅퀴들의 형태에 의한 동정을 위해서는 잎, 꽃, 화서, 총포 등의 기관별 형태학적 특징들에 대해서 식물도감 및 논문을 참고하였다[12,16]. 계통분류학적 분석을 위해서는 수집된 식물들의 genomic DNA를 추출하고, 이를 template로 하는 PCR을 수행하여 18S rDNA, internal transcribed spacer (ITS) 1, 5.
큰엉겅퀴 6가지와 고려엉겅퀴 2가지의 18S rDNA, ITS1, 5.8S rDNA, ITS2 및 28S rDNA의 일부를 포함하는 DNA의 염기서열을 밝히고, ClustalW 1.83을 사용하여 서로 align 하였다[4]. 이렇게 align된 염기서열 중에서 ITS1과 ITS2 염기서열은 MEGA5.
현재까지 milk thistle에서 발견된 물질들 중에서 가장 주목을 받고 있는 것은 silymarin인데, 이 silymarin의 존재 여부를 확인하고, 만일 존재한다면 그 함량을 분석하고 서로 비교하기 위하여 채집된 큰엉겅퀴와 고려엉겅퀴들의 methanol 추출물을 HPLC로 분석하였다. 이때에 Sigma-Aldrich로부터 구입한 silymarin을 standard로 사용하였다.
이러한 transformants를 100 μg/ml의 ampicillin을 함유하는 MacConkey agar에 도말하고 37℃에서 배양하였다. 흰색 colony들을 selection하여서 이들로부터 plasmid DNA를 추출한 후에, supercoiled plasmid DNA 및 PvuⅡ로 절단된 plasmid DNA를 agarose gel electrophoresis로 분석하였다. 그 결과, 예상되는 크기의 PCR 산물이 얻어졌으므로 이러한 DNA들의 염기서열분석을 (주)솔젠트에 의뢰하였다.
대상 데이터
Reverse primer는 28S rDNA의 5' 부위를 target으로 하여 제조하였다.
국내의 여러 지역을 직접 답사하여 큰엉겅퀴와 고려엉겅퀴를 수집하였다. 이렇게 수집된 식물들을 형태에 따라 분류해 본 결과, Table 1에 나타낸 바와 같이 C.
본 연구에 사용할 큰엉겅퀴와 고려엉겅퀴를 여러 지점에서 채집하였다. 큰엉겅퀴와 고려엉겅퀴가 발견되면 사진을 촬영하고 잎을 채취하였다.
현재까지 milk thistle에서 발견된 물질들 중에서 가장 주목을 받고 있는 것은 silymarin인데, 이 silymarin의 존재 여부를 확인하고, 만일 존재한다면 그 함량을 분석하고 서로 비교하기 위하여 채집된 큰엉겅퀴와 고려엉겅퀴들의 methanol 추출물을 HPLC로 분석하였다. 이때에 Sigma-Aldrich로부터 구입한 silymarin을 standard로 사용하였다. 그 결과, HPLC profile이 거의 모든 시료에서 서로 비슷하게 나타났기 때문에, Fig.
성능/효과
Reverse primer는 28S rDNA의 5' 부위를 target으로 하여 제조하였다. PCR에는 error가 많이 발생하는 Taq DNA polymerase 대신에 error가 훨씬 적게 발생하는 Pfu DNA polymerase를 사용함으로써 반응 중에 DNA sequence가 변경되는 것을 최소화하였다.
따라서 본 연구에서는 국내에 자생하는 큰엉겅퀴와 고려엉겅퀴의 분포에 대한 연구를 시도해 보았다. 그 결과, 강원도의 홍천, 평창, 원주, 양양과 강원도에 인접한 경기도 가평, 충청북도 충주에서 큰엉겅퀴를 채집할 수 있었다. 또한 강원도 태백시와 이에 인접한 경상북도 봉화에서는 고려엉겅퀴를 채집할 수 있었다(Table 1).
비록 소백산맥에 의해서 서로 분리가 되었다고는 하지만 태백 고려엉겅퀴와 봉화 고려엉겅퀴를 채취한 지점은 직선거리로 12 km 정도 밖에 떨어져 있지 않다. 따라서 고려엉겅퀴의 서식지가 돌연변이 유발물질의 농도가 특별히 높거나 하지 않는다면 고려엉겅퀴는 큰엉겅퀴에 비해서 독립된 종으로 분화한 지 대단히 오랜 시간이 지났다는 것을 알 수 있다.
8S rDNA, ITS2 및 28S rDNA를 증폭하여 그 염기서열을 분석하고, 그 결과를 GenBank에 등록하였다(accession numbers JX274255, JX274256, JX274257, JX274258, JX274259, JX274260). 염기서열 분석 결과, 큰엉겅퀴들의 PCR 산물은 모두 그 길이가 2,509-bp였으나, 고려엉겅퀴들은 모두 2,513-bp였다. 염기서열을 서로 비교해 본 결과, 고려엉겅퀴들이 ITS1에서 1-bp, 그리고 ITS2에서 3-bp의 염기를 더 가지고 있었다(Fig.
국내의 여러 지역을 직접 답사하여 큰엉겅퀴와 고려엉겅퀴를 수집하였다. 이렇게 수집된 식물들을 형태에 따라 분류해 본 결과, Table 1에 나타낸 바와 같이 C. pendulum 6개체 및 C. setidens 2개체가 채집되었다. 특히 큰엉겅퀴는 강원도에서는 홍천, 원주, 평창, 양양의 4개 지점에서 채집되었고, 강원도에 인접한 경기도 가평과 충청북도 충주에서도 채집되었다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
엉겅퀴 아족의 큰 분류 군은 어떻게 되는가?
국화과의 엉겅퀴족(Cardueae)에는 대략 83속 2,500여 종의 식물들이 포함되어 있는데, 이중에서도 36속 1,600여 종의 식물들이 다시 엉겅퀴 아족(Carduinae)으로 분류되고 있다. 엉겅퀴 아족 중에서는 Carduus 속(약 90여 종), Cirsium 속(200-300여 종) 그리고 Onopordum 속(약 60여 종)이 큰 분류군으로 되어 있다[6]. 국내에 자생하는 엉겅퀴의 종에 대해서는 많은 논란이 있어왔으나, 최근에 정리된 바에 의하면 한국산 엉겅퀴들 중에서 Cirsium 속에 속하는 것들로는 Cirsium japonicum(엉겅퀴)을 비롯하여 C.
GenBank의 자료에 나와있는 Cirsium 속 식물에 대한 정보는 무엇이 있는가?
그러나 제주도에 자생하는 바늘엉겅퀴와 울릉도에 자생하는 물엉겅퀴를 제외하고는 국내에 자생하는 Cirsium 속 식물들의 분포에 대해서는 체계적으로 연구된 적이 없고, 이러한 식물들의 분류 또한 전적으로 형태에 의존하고 있기 때문에 분자유전학적(molecular phylogenetic) 자료는 전혀 알려져 있지 않다. GenBank의 자료를 찾아보아도 전 세계적으로 중국의 안휘성에서 채집된 C. japonicum 한 종류(accession EU592014)와 일본의 홋카이도에서 채집된 C. pendulum 한 종류(accession AB035977, AB035998)의 ITS1 및 ITS2의 염기서열이 등록되어 있을 뿐, 그 외의 지역에서 자생 중인 C. japonicum 종 또는 C.
고려엉겅퀴의 특징은 무엇인가?
강원도 지역에서 “곤드레”라는 귀한 나물로 알려져 있는 고려엉겅퀴(Cirsium setidens Nakai) 역시 산야에서 자라는 다년초로서 높이가 1 m에 달하고 뿌리가 곧으며 가지가 사방으로 퍼지는 것으로 알려져 있을 뿐, 그 분포에 대해서는 설명이 없다[12]. 고려엉겅퀴의 ITS1이나 ITS2의 염기서열은 GenBank에 아직까지 보고된 적이 없다.
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