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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 딱총나무의 추출 조건별 phenol 성분 용출량의 최적 조건과 그에 따른 생리활성을 규명하는 작업의 일환으로써 각각 다른 종류의 용매를 이용하여 추출수율을 비교하였으며, 또한 추출물의 항산화능을 살펴봄으로써 기능성식품 소재로의 사용 가능성을 검토하였다.
- 본 연구에서는 딱총나무의 항산화 활성을 조사해 보았다. 딱총나무 잎과 줄기의 물추출물에는 6.
제안 방법
- 경기도산림환경연구소 내 전시포지에서 채취한 딱총나무 (S. williamsii var. coreana) 잎과 가지를 공시재료로 사용하여, 원재료에 증류수와 에탄올을 시료 중량의 10배 양을 가하여 실온에서 24시간 침지하여 상층액과 침전물을 분리한 후 동일한 방법으로 3회 반복 추출하였다. 각 추출물을 여과, 농축 후 -80℃ deep freezer에 보관하여 본 실험의 시료로 사용하였다.
대상 데이터
- 즉, 7 mM ABTS와 140 mM K2S2O8을 5 mL : 88 μL로 섞어 어두운 곳에 14~16시간 방치시킨 후, 이를 absolute ethanol과 1:88비율로 섞어 734 nm에서 대조구의 흡광도 값이 0.7 ± 0.002가 되도록 조절한 ABTS solution을 사용하였다.
이론/모형
- ABTS radical cation decolorization의 측정은 Pellegrin et al.(1998)의 방법에 의해 측정하였다. 즉, 7 mM ABTS와 140 mM K2S2O8을 5 mL : 88 μL로 섞어 어두운 곳에 14~16시간 방치시킨 후, 이를 absolute ethanol과 1:88비율로 섞어 734 nm에서 대조구의 흡광도 값이 0.
- DPPH radical에 대한 소거활성은 Blois(1958)의 방법을 이용하여 측정하였다. 각 시료 0.
- PF는 Andarwulan과 Shetty(1999)의 방법으로 측정하였다. 10 mg의 β-carotene을 50 mL의 chloroform에 녹인용액 1 mL를 evaporator용 수기에 넣고 40℃ water bath 에서 chloroform을 증류시킨 후 20 μL linoleic acid, 184 μL Tween 40과 50 mL H2O2를 가하여 emulsion을 만들고, 5 mL의 emulsion에 시료용액 100 μL를 혼합하여 vortex로잘 섞어준 뒤 50℃에서 30분간 반응 시켜 냉각시킨 다음, 470 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- TBARS는 Blurge와 Aust(1978)의 방법에 따라 측정하였다. 1% linoleic acid와 1% Tween 40으로 emulsion을만들고 emulsion 0.
- 총 폴리페놀 화합물은 Folin-Denis 방법(Folin and Denis, 1912)으로 측정하였으며, 시료 1 mL에 95% ethanol 1 mL와 증류수 5 mL를 첨가하고 1N Folin-ciocalteu reagent 0.5 mL를 넣어 잘 섞어주고, 5분간 방치한 후, Na2CO3 1 mL를 가한 후, 흡광도 725 nm에서 1시간 이내에 측정하여 gallic acid를 이용한 표준곡선으로부터 양을 환산하였다.
성능/효과
- Positive control인 BHT와 vitamin C를 200 μg/mL 처리하였을 때의 87.7%와 82.7%에 비해 딱총나무 잎과 줄기 추출물이 더 높은 전자공여능을 가지고 있음이 확인되어 천연 항산화제로서의 활용가능성이 매우 높을 것으로 판단되었다.
- Thiobarbituric acid reaction substance 측정에서도 딱총나무 잎의 물과 에탄올 추출물 phenolic 200 μg/mL의 함량에서는 88.7%, 98.1%, 줄기의 물과 에탄올 추출물 phenolic 200 μg/mL의 함량에서는 93.6%, 90.6%로 positive control인 BHT 및 vitamin C보다 우수한 항산화 효과를 나타내었다.
- 이러한 결과로 볼 때 딱총나무 추출물의 첨가 농도가 높아질수록 농도의존적으로 항산화 효과도 증가함을 알 수 있었다. 대조구인 BHT 및 vitamin C와 비교한 결과 지용성 물질에 대하여서도 매우 높은 항산화력을 가졌음을 알 수 있었다. Chae et al.
- 2-A, B에서와 같이 딱총나무의 잎과 줄기 모두 추출 6시간 때 까지 추출수율이 급격하게 상승하다가 12시간 이후부터는 완만해지는 경향을 나타내었으며, 추출 18시간 이후에는 더 이상 상승곡선을 나타내지 않았다. 따라서 딱총나무의 phenolic compound를 추출하기 위한 최적조건은 잎의 경우 70% ethanol을 용매로 18시간 추출이 최적이었으며, 줄기의 경우 80% ethanol을 용매로 하여 18시간 추출하였을 때가 최적의 조건으로 확인되었다.
- 따라서 시료로부터 유용성분으로 판단되는 phenolic compound를 상기의 최적조건에서 추출하여 그 함량을 측정한 결과 Table 1과 같이 딱총나무 잎에서는 물추출물이 6.6 ± 0.7 mg/g의 함량을 나타내었으며, 에탄올 추출물에서는 5.2 ± 0.6 mg/g의 함량을 나타내었다.
- 딱총나무 줄기 물추출물에서도 phenolic 50∼200 μg/mL의 첨가농도에서 56.6∼93.6%의 높은 항산화효과가 확인되어 BHT 및 vitamin C의 억제율 보다 더 높은 산화억제효과가 확인되었다.
- 또한 ABTS radical cation decolorization 측정에서도 딱총나무 잎의 물과 에탄올 추출물 phenolic 200 μg/mL의 함량에서는 79.8%, 99.1%, 줄기의 물과 에탄올 추출물 phenolic 200 μg/mL의 함량에서 90.8%, 97.2%의 매우 높은 항산화 효과를 나타내었다.
- 또한 딱총나무 줄기 물추출물에서도 phenolic 50 μg/mL 함량에서 62.3%의 활성을 나타냈으며, phenolic 200 μg/ mL의 함량에서는 90.8%의 우수한 효과를 나타내었고, 에탄올 추출물에서는 잎의 경우와 같이 phenolic 50∼100 μg/mL의 농도에서는 26∼33%의 낮은 활성을 나타내었으나, phenolic 150과 200 μg/mL의 고농도에서 각각 94.1과 97.2%의 매우 높은 항산화 효과를 나타내었다.
- 또한 딱총나무 줄기 물추출물의 phenolic 50 μg/mL 함량에서 60.8%의 전자공여능을 나타냈으며, phenolic 200 μg/mL의 함량에서는 92.2%의 우수한 효과를 나타내었고, 에탄올 추출물에서는 잎의 경우와는 다르게 물추출물보다 효과가 더 우수한 결과를 나타내었으며, phenolic 50 μg/mL 함량에서 71.6%, 200 μg/mL의 함량에서 94.3%의 매우 우수한 항산화 효과를 나타내었다.
- 또한 딱총나무 줄기에서는 물추출물이 2.0 ± 1.2 mg/g의 함량을 나타내었으며, 에탄올 추출물에서는 1.9 ± 0.4 mg/g 의 함량을 나타내어 줄기보다 잎에서 더 많은 phenolic compound가 존재함을 알 수 있었다.
- 4%였다고 보고한 것과 비교하면 본 실험 재료인 딱총나무 추출물의 항산화능이 매우 우수한 것을 알 수 있었다. 또한 딱총나무의 잎과 줄기를 비교하면 phenolic 함량이 높은 잎 추출물에 의한 항산화 효과도 높지만 상대적으로 phenolic 함량이 낮은 줄기 추출물에 의해서도 항산화활성이 부분적으로 잎 추출물보다 더 우수한 결과를 나타내었다. 이는 각 시료에 함유된 phenolic compound 종류의 차이에 기인한 것이라 추측하였으며, 향후 연구 방향을 제시하는 결과라 할 수 있을 것이다.
- 1-A, B에서와 같이 딱총나무 잎과 줄기 모두 물을 용매로 사용하였을 때 추출수율이 가장 높게 나타났으나, 에탄올 농도별로는 잎이 70% 추출물에서 줄기가 80% 추출물에서 추출수율이 가장 높게 나타났다. 또한 추출시간별 추출수율을 살펴본 결과 Fig. 2-A, B에서와 같이 딱총나무의 잎과 줄기 모두 추출 6시간 때 까지 추출수율이 급격하게 상승하다가 12시간 이후부터는 완만해지는 경향을 나타내었으며, 추출 18시간 이후에는 더 이상 상승곡선을 나타내지 않았다. 따라서 딱총나무의 phenolic compound를 추출하기 위한 최적조건은 잎의 경우 70% ethanol을 용매로 18시간 추출이 최적이었으며, 줄기의 경우 80% ethanol을 용매로 하여 18시간 추출하였을 때가 최적의 조건으로 확인되었다.
- 6%의 높은 항산화효과가 확인되어 BHT 및 vitamin C의 억제율 보다 더 높은 산화억제효과가 확인되었다. 이러한 결과로 볼 때 딱총나무 추출물의 첨가 농도가 높아질수록 농도의존적으로 항산화 효과도 증가함을 알 수 있었다. 대조구인 BHT 및 vitamin C와 비교한 결과 지용성 물질에 대하여서도 매우 높은 항산화력을 가졌음을 알 수 있었다.
- 지질과산화의 연쇄반응에 관여하여 free radical의 전자를 공여하여 산화를 억제시키는 DPPH 전자공여능 실험에서 딱총나무 잎과 줄기 추출물을 phenolic 50~200 μ g/mL 농도로 조절, 첨가하여 측정한 결과 Table 2에서와같이 딱총나무잎 물추출물의 phenolic 50 μg/mL 함량에서 70.4%의 전자공여능을 나타냈으며, phenolic 200 μg/mL의 함량에서는 99.5%의 우수한 효과를 나타내었고, 에탄올 추출물에서는 물추출물보다는 효과가 약간 낮으나 phenolic 200 μg/mL의 함량에서 89.7%의 높은 항산화 효과를 나타내었다.
- 지질의 산화 억제효과를 측정하는 지표로(Bluege and Aust, 1978) TBARs 생성의 감소 정도를 다양한 농도의 딱총나무 추출물을 첨가하여 thiobarbituric acid reactive substance를 측정한 결과 Table 5에서와 같이 딱총나무 잎 물추출물 phenolic 50 μg/mL 함량에서 32.5%의 활성을 나타냈으며, phenolic 200 μg/mL의 함량에서는 88.7%의 우수한 효과를 나타내었고, phenolic 50∼200 μg/mL의 농도의 에탄올 추출물에서 54.5∼91.6% 산화억제율로 물추출물의 32.5∼88.7%, positive control인 BHT와 vitamin C의 16.2∼85.3%, 16.6∼82.9%의 억제율 보다 더 높은 산화억제효과가 확인되었다.
- 추출물들의 상대적인 항산화 측정은 hydrogen donating antioxidant와 chain breaking antioxidant 모두를 측정할 수 있고 aqueous phase와 organic phase 모두에 적용이 가능하며, potassium persulfate와의 반응에 의해 생성된 ABTS+ free radical이 추출물속의 항산화 물질에 의해 제거되어 radical 특유의 색인 청록색이 탈색되는 방식 (Pellegrin et al., 1998)을 이용하여 딱총나무 추출물의 ABTS radical cation decolorizaton을 측정한 결과 Table 2와 같이 딱총나무 잎 물추출물 phenolic 50 μg/mL 함량에서 36.1%의 활성을을 나타냈으며, phenolic 200 μg/mL의 함량에서는 79.8%의 우수한 효과를 나타내었고, 에탄올 추출물에서는 phenolic 150과 200 μg/mL의 고농도에서 각각 95.3과 99.1%의 매우 높은 항산화 효과를 나타내었다.
- 추출물의 항산화 활성 실험에서 전자공여능은 딱총나무 잎의 물과 에탄올 추출물 phenolic 200 μg/mL의 함량에서는 99.5%, 89.7%, 줄기의 물과 에탄올 추출물 phenolic 200 μg/mL의 함량에서는 92.2%, 94.3%의 높은 항산화 효과를 나타내었다.
- 특히 줄기의 물추출물의 경우 phenolic 200 μg/mL의 첨가 농도에서 positive control인 vitamin C의 1.6 PF보다는 다소 낮으나 BHT의 1.2 PF보다 더 높게 나타나 지용성물질에 대한 항산화력도 높음을 알 수 있 었다.
- 페놀성 물질 추출을 위한 최적조건을 규명하기 위하여 물과 에탄올을 추출용매로 사용하여 용매농도별, 추출시간별로 추출수율을 살펴본 결과 Fig. 1-A, B에서와 같이 딱총나무 잎과 줄기 모두 물을 용매로 사용하였을 때 추출수율이 가장 높게 나타났으나, 에탄올 농도별로는 잎이 70% 추출물에서 줄기가 80% 추출물에서 추출수율이 가장 높게 나타났다. 또한 추출시간별 추출수율을 살펴본 결과 Fig.
후속연구
- 이는 positive control인 BHT와 vitamin C와 비교해서도 더 우수한 결과를 나타내어 앞의 DPPH 효과와 같이 생각한다면 수용성 물질에 대한 천연 항산화제로서의 산업화 적용 가능성은 매우 높다고 할 수 있을 것이다. 또한 phenolic 함량이 잎추출물보다 상대적으로 낮았던 줄기추출물에서 ABTS의 효과가 다소 높았던 것은 함량은 낮으나 항산화활성에 관여하는 phenolic compound profile이 딱총나무줄기에 높게 분포되어 있는 것으로 추측하였으며, 향후 정제와 물질 동정 과정을 거쳐 확인이 필요한 사항이라고 판단되었다. Chae et al.
- 6%로 positive control인 BHT 및 vitamin C보다 우수한 항산화 효과를 나타내었다. 본 연구의 결과로 딱총나무의 항산화 활성을 이용한 천연 기능성 식품소재로서의 활용이 가능할 것으로 판단되었다.
- 2%의 매우 높은 항산화 효과를 나타내었다. 이는 positive control인 BHT와 vitamin C와 비교해서도 더 우수한 결과를 나타내어 앞의 DPPH 효과와 같이 생각한다면 수용성 물질에 대한 천연 항산화제로서의 산업화 적용 가능성은 매우 높다고 할 수 있을 것이다. 또한 phenolic 함량이 잎추출물보다 상대적으로 낮았던 줄기추출물에서 ABTS의 효과가 다소 높았던 것은 함량은 낮으나 항산화활성에 관여하는 phenolic compound profile이 딱총나무줄기에 높게 분포되어 있는 것으로 추측하였으며, 향후 정제와 물질 동정 과정을 거쳐 확인이 필요한 사항이라고 판단되었다.
- 또한 딱총나무의 잎과 줄기를 비교하면 phenolic 함량이 높은 잎 추출물에 의한 항산화 효과도 높지만 상대적으로 phenolic 함량이 낮은 줄기 추출물에 의해서도 항산화활성이 부분적으로 잎 추출물보다 더 우수한 결과를 나타내었다. 이는 각 시료에 함유된 phenolic compound 종류의 차이에 기인한 것이라 추측하였으며, 향후 연구 방향을 제시하는 결과라 할 수 있을 것이다. 이상의 결과로 볼 때 딱총나무 추출물은 수용성 물질과 지용성 물질 모두에 대하여 항산화활성이 우수한 것으로 나타나 추출물을 이용한 천연항산화 기능성소재로서 응용할 수 있으리라 판단되었다.
- 3%의 매우 우수한 항산화 효과를 나타내었다. 이는 물추출물과 에탄올 추출물의 phenolic compound profile 이 다르기 때문인 것으로 판단되며, 이에 대한 연구는 향후 진행이 되어야 할 것으로 판단되었다. Positive control인 BHT와 vitamin C를 200 μg/mL 처리하였을 때의 87.
- 이는 각 시료에 함유된 phenolic compound 종류의 차이에 기인한 것이라 추측하였으며, 향후 연구 방향을 제시하는 결과라 할 수 있을 것이다. 이상의 결과로 볼 때 딱총나무 추출물은 수용성 물질과 지용성 물질 모두에 대하여 항산화활성이 우수한 것으로 나타나 추출물을 이용한 천연항산화 기능성소재로서 응용할 수 있으리라 판단되었다.
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