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문제 정의
- 최근 들어 이러한 배당체 (glycoside) 형태의 물질을 무배당체(aglycone) 형태로 전환시키는 연구가 이루어지고 있으며, Choi et al(1999)은 대두 요구르트제조에서 이소플라본 배당체의 가수분해를 연구하였고, Kang et al(2005)은 산 분해를 이용하여 헛개나무 열매 추출물의 생리활성을 증가시켰다. 본 연구에서는 알코올 분해 효과가 있는 것으로 알려져 있는 헛개나무 열매 추출물을 당 분해 효소를 이용하여 효소처리 함으로써 기존 헛개나무 열매 추출물에 비해 당 분해 효소 처리한 헛개나무 열매 추출 물의 알코올 분해 효과가 증대되는지는 알아보고자 하였다.
- 본 연구에서는 헛개나무 열매 추출물을 당 분해효소를 이용하여 효소처리 시 알코올 분해능에 미치는 영향을 알아보았다. 당분해효소인 Maxinvert(invertase), Optidex L-400(glucoamylase), Rohament CL(cellulase & pectinase)를 각각 농도별(0.
제안 방법
- Park et al(1998)이 실시한 실험 방법을 응용하여 총 3회에 걸쳐 임상실험을 실시하였다. 1회 때는 음주 30분 전 물을 섭취하였고, 2회 때는 헛개나무 열매 추출물, 3회 때는 당 분해 효소 처리한 헛개나무 열매 추출물을 각각 200 mL씩 음용하게 하였다. 각각의 시료 음용 30분 후 알코올(19.
- 6시간 간격으로 샘플을 채취하여 Autoclave(DH. WACS 1060, Daihan Scientific Co., Korea)에서 100℃, 1시간 처리하여 효소를 불활성화 시킨 후 in vitro 실험에 사용하였다.
- HPLC(Waters 410, USA)를 이용하여 효소처리 전후의 당 성분 변화를 확인하였으며, 조건은 Table 2와 같은 조건으로 분석하였다.
- Park et al(1998)이 실시한 실험 방법을 응용하여 총 3회에 걸쳐 임상실험을 실시하였다. 1회 때는 음주 30분 전 물을 섭취하였고, 2회 때는 헛개나무 열매 추출물, 3회 때는 당 분해 효소 처리한 헛개나무 열매 추출물을 각각 200 mL씩 음용하게 하였다.
- 1회 때는 음주 30분 전 물을 섭취하였고, 2회 때는 헛개나무 열매 추출물, 3회 때는 당 분해 효소 처리한 헛개나무 열매 추출물을 각각 200 mL씩 음용하게 하였다. 각각의 시료 음용 30분 후 알코올(19.5%) 360 mL를 일정한 속도로 나누어 마시도록 하였으며, 소량의 안주(오징어채와 과자)를 제공하였다. 모든 피실험자는 실험이 진행되는 동안 담배를 피우지 못하게 하였고, 물도 마실 수 없었으며, 화장실은 자유로이 출입할 수 있도록 하였다.
- 건조 시료 100 g당 증류수 10배를 첨가하여 환류 냉각관을 부착한 100℃의 Heating mantle(MS-DM605, Mtops Co., Korea)에서 5시간 추출한 후 여과(Whatman No. 2)하여 얻은 액을 1차 추출액으로 하고, 상기 방법에 따라 2,3차 추출액을 얻어 모두 혼합한 후 rotatory vacuum evaporator(R-210, Buchi Co., Swiss)로 농축하여 최종 Brix 6°로 하였다.
- 당 분해 효소를 농도별(0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1)로 첨가한 뒤 48시간 효소처리하면서 6시간 간격으로 ADH 효소 활성을 측정한 결과는 Fig. 1～3과 같다.
- 당분해효소인 Maxinvert(invertase), Optidex L-400(glucoamylase), Rohament CL(cellulase & pectinase)를 각각 농도별(0.01, 0.05, 0.1, 0,5, 1%)로 첨가하여 48시간 효소처리 하면서 6시간 간격으로 sample을 채취해 ADH 효소 활성을 측정하였다.
- 1mL를 신속하게 혼합한 다음 5분후 340 nm에서 흡광도(UV/VIS spectrophotometer, UVmini 1240, Shimadzu, Japan)를 측정하였다. 대조군에는 ADH대신 0.1% bovine serum albumin을 첨가하여 흡광도를 측정하였다.
- 먼저 증류수 섭취군(control)과 헛개나무 열매 추출물 섭취군(HE), 효소 처리한 헛개나무 열매 추출물 섭취군(EHE)으로 나누어 실험 시작 30분전 각각의 시료를 체중 kg 당 8 mL 수준으로 1회 경구투여 하였다.
- 상기 방법으로 적출된 간 homogenate 0.1 mL를 0.2 mL ethanol과 0.5 M semicarbazide 0.02 mL, 0.1 M NAD 가 함유된 preincubation 된 반응액 2.0 mL에 혼합해 37℃에서 5분간 반응하여 생성되는 NADH의 흡광도를 측정하여 cytosol내 존재하는 ADH 효소 활성을 측정하였다.
- 숙취에 대한 주관적 느낌에 대해 평가하기 위하여 매 실험 종료 후 피실험자에게 숙취에 관한 설문조사를 실시하였다. 실험대상자는 신체 건강한 20대 남자 20명을 10명씩 나누어 실험하였으며, 조사 항목은 술을 마신 후 나타나는 대표적인 증상 4가지에 대해 7점 측도법(7점: 매우 그렇다, 1 점: 매우 안 그렇다)을 이용하였다.
- 시료 투여 30분 후 40% 술을 kg 당 8 mL 수준으로 1회 경구투여한 뒤 90분 간격으로 3회에 걸쳐 꼬리정맥에서 1 mL의 혈액을 채취하였다.
- , Korea)에 넣어 온도를 유지시켜 주었다. 이 반응액에 0.1% bovine serum albumin(pH 7.5)에녹인 alcohol dehydrogenase 용액(ADH, 0.75 unit/mL) 0.1mL를 신속하게 혼합한 다음 5분후 340 nm에서 흡광도(UV/VIS spectrophotometer, UVmini 1240, Shimadzu, Japan)를 측정하였다. 대조군에는 ADH대신 0.
- 인간을 대상으로 하는 실험에서는 동일인을 시간별로 혈액 채취가 어려워 시판되는 호흡용 알코올 측정기(DA5000, Datech Co., Korea)를 사용하여 호흡 중 알코올 농도를 측정하였다.
- 채취한 혈액을 EDTA tude에 넣어 보관한 후 알코올 자동분석기(Younglin, Korea)를 이용하여 측정하였다.
- 헛개나무 열매 추출물에 효소 Maxinvert, OptidexL-400, Rohament CL을 각각 농도별(0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1%)로 첨가하여 각 효소의 최적 온도(Table 1)에서 48시간 효소처리 하였다.
- 흰쥐를 난괴법으로 5마리씩 3개 군으로 나누었다. 먼저 증류수 섭취군(control)과 헛개나무 열매 추출물 섭취군(HE), 효소 처리한 헛개나무 열매 추출물 섭취군(EHE)으로 나누어 실험 시작 30분전 각각의 시료를 체중 kg 당 8 mL 수준으로 1회 경구투여 하였다.
대상 데이터
- 숙취에 대한 주관적 느낌에 대해 평가하기 위하여 매 실험 종료 후 피실험자에게 숙취에 관한 설문조사를 실시하였다. 실험대상자는 신체 건강한 20대 남자 20명을 10명씩 나누어 실험하였으며, 조사 항목은 술을 마신 후 나타나는 대표적인 증상 4가지에 대해 7점 측도법(7점: 매우 그렇다, 1 점: 매우 안 그렇다)을 이용하였다.
- 실험동물은 5주령의 수컷 흰쥐(Spargue-Dawley rat, male)를 대한실험동물센터(Seoul, Korea)에서 분양받아 1주일간 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 적응기간 중 사료는 실험동물용 사료를 음수는 정제수를 자유로이 섭취하도록 하였다.
- 헛개나무 열매는 2007년 10월 경북 안동에서 채취하여 건조한 것을 사용하였으며, 당분해 효소는 (주)비전바이오켐(Seongnam, Korea)의 Maxinvet(invertase), Optidex L-400(glucoamylase), Rohament CL(cellulase & pectinase)를 사용하였다.
데이터처리
- 5) Means with the same letter in a column are not significantly different by Duncan's multiple range test (p<0.05).
- 본 연구의 결과는 평균으로 나타내었고, 각 실험 군 간의 비교분석은 SPSS를 이용하여 분석한 후 α<0.05에서 Duncan's multiple range test를 사용하여 유의성을 검증하였다.
이론/모형
- Alcohol dehydrogenase activity assay 방법(Lebsack et al 1976)을 이용하여 측정하였다. 50 mM sodium pyrophosphate 완충액(pH 8.
- 간 조직 중 cytosolic alcohol dehydrogenase(ADH) 활성도는 Bermeyer의 방법(1974)으로 측정하였다. 적출한 간은 그 중 일정량에 4배의 0.
- 활성도 단위는 단백질 1 mg이 1분간 생성한 NADH의 양을 nmole로 표시하였다. 단백질 함량은 Lowry et al(1951)의 방법에 따라 측정하였으며, bovine albumin을 표준품으로 사용 하였다.
성능/효과
- 각 실험쥐군의 혈중 알코올 농도를 측정한 결과, Table 3과 같았다. Control에 비해 HE 섭취군과 EHE 섭취군의 혈중 알코올 농도가 감소한 것으로 나타났다. HE 섭취군의 경우, 처음 90분까지는 control군에 비해 그 수치는 적게 나타났으나 유의적 차이는 보이지 않았으며, 180분대에는 control군과 유의적인 차이를 나타내 알코올 감소 효과가 있는 것으로 나타났다.
- HE 섭취군의 경우, 처음 90분까지는 control군에 비해 그 수치는 적게 나타났으나 유의적 차이는 보이지 않았으며, 180분대에는 control군과 유의적인 차이를 나타내 알코올 감소 효과가 있는 것으로 나타났다. EHE 섭취군의 경우는 HE군과는 달리 90분대에도 control군에 비해 유의적 차이를 보이며, 혈중 알코올 농도가 낮은 것으로 나타났으며, 180분대에서도 유의적인 차이를 보이는 낮은 수치를 나타냈다. 270분대의 경우 EHE, HE, control 순으로 낮게 나왔으나 각 군간의 유의적인 차이는 보이지 않았다.
- Control에 비해 HE 섭취군과 EHE 섭취군의 혈중 알코올 농도가 감소한 것으로 나타났다. HE 섭취군의 경우, 처음 90분까지는 control군에 비해 그 수치는 적게 나타났으나 유의적 차이는 보이지 않았으며, 180분대에는 control군과 유의적인 차이를 나타내 알코올 감소 효과가 있는 것으로 나타났다. EHE 섭취군의 경우는 HE군과는 달리 90분대에도 control군에 비해 유의적 차이를 보이며, 혈중 알코올 농도가 낮은 것으로 나타났으며, 180분대에서도 유의적인 차이를 보이는 낮은 수치를 나타냈다.
- 모든 군에서 ADH 효소 활성이 높아지는 것을 볼 수 있었으며, 효소농도가 높아질수록 시간이 지날수록 활성이 증가 하는 추세를 보였다. Maxinvert 처리군은 최대 10% 정도 상승하여 다른 효소에 비하여 가장 적은 상승률을 나타냈으며, Rohament CL 1% 처리군에서 약 67% 상승하여 가장 높은 상승률을 나타냈었다. Rohament CL 1% 처리 시 시간이 지남에 따라 활성이 증가하다가 30시간 때부터 활성 증가 폭이 적어졌으며, 이로 보아 36시간 때까지 효소 처리시가 가장효율적일 것으로 사료된다.
- 효소 농도가 높을수록 효소 활성이 증가하였으며, 시간이 지남에 따라 활성이 높아졌다. Maxinvert 효소 처리 시기존의 활성보다 약 10% 증가하여 가장 낮은 활성 증가를 보였고, Rohament CL 효소를 1% 첨가하여 효소처리할 경우, 기존의 활성에 비해 효소 활성이 67% 증가한 것으로 가장 많은 효소 활성 증가를 보였다. Rohament CL 효소를 1% 첨가할 경우, 시간이 지남에 따라 활성이 증가하다가 30시간대부터 활성의 증가가 변화가 거의 없었다.
- Maxinvert 처리군은 최대 10% 정도 상승하여 다른 효소에 비하여 가장 적은 상승률을 나타냈으며, Rohament CL 1% 처리군에서 약 67% 상승하여 가장 높은 상승률을 나타냈었다. Rohament CL 1% 처리 시 시간이 지남에 따라 활성이 증가하다가 30시간 때부터 활성 증가 폭이 적어졌으며, 이로 보아 36시간 때까지 효소 처리시가 가장효율적일 것으로 사료된다. 이는 Ahn et al(2005)이 cellulase 효소를 이용하였을 때 가장 높은 flavonoid 무배당체 함량을 나타내었다는 연구 결과와 일치하였다.
- 이로 보아 36시간까지 효소 처리하는 것이 가장 효율적일 것이라 사료된다. Rohament CL 효소 1% 첨가하여 36시간 효소 처리한 헛개나무 열매 추출물을 이용하여 동물 실험 및 임상 실험을 실시한 결과, control 군 및 헛개나무 열매 추출물 군에 비해 알코올 농도가 줄어드는 것을 볼 수 있었으며, 특히 알코올 섭취 초기에 그 효과가 가장 뛰어난 것으로 나타났다. 이로 보아 효소 처리한 헛개나무 열매 추출물이 기존의 헛개나무 열매 추출물에 비해 더 많은 체내 알코올 농도 감소를 나타낼 것으로 생각되며, 음주 초기에 더 많은 영향을 줄 것으로 사료되어 진다.
- 상기 알코올 분해 속도 촉진이 실제 생체 내에서 어떤 기작에 의해 작용하는지에 대한 생화학적인 분석을 위해 체내 알코올의 1차 대사에 관여하는 ADH의 활성 증진 정도를 측정한 결과는 Table 4와 같았다. control군에 비해 HE의 ADH 활성이 9.2% 정도 증가하였으며, EHE는 15.3% 정도 증가하였다. 이는 헛개나무 추출물의 섭취로 알코올 분해 효소인 ADH 의 활성이 상승되었다(An et al 1999)는 연구 결과와 유사한 결과이다.
- 이는 HE 및 EHE가 체내 알코올 분해에 작용하였기 때문으로 사료된다(Hwang et al 2004). 동물 실험 결과와 비슷하게 HE와 EHE 모두 알코올 농도 감소에 도움을 주는 것으로 나타났으며, EHE가 HE보다 알코올 농도를 더 많이 감소하는 것으로 나타났다. 특히 EHE의 경우, 알코올 섭취 초기에 더 많은 효과가 있는 것으로 나타났다.
- 모든 군에서 ADH 효소 활성이 높아지는 것을 볼 수 있었으며, 효소농도가 높아질수록 시간이 지날수록 활성이 증가 하는 추세를 보였다. Maxinvert 처리군은 최대 10% 정도 상승하여 다른 효소에 비하여 가장 적은 상승률을 나타냈으며, Rohament CL 1% 처리군에서 약 67% 상승하여 가장 높은 상승률을 나타냈었다.
- 메스꺼움을 묻는 질문에서도 유사한 결과를 보였으며, 열기가 느껴지는가에 대한 질문은 HE군이 EHE군에 비해 낮은 수치를 보였으나, 유의적인 차이는 없었다. 어지럼증을 묻는 질문에서는 control군에 비해 HE군과 EHE군이 수치는 적었으나 유의적인 차이는 없는 것으로 나타났다. 이로 미루어보아 HE 및 EHE가 숙취에 효과가 있는 것으로 사료되어진다.
- 이로 미루어 보아 효소 처리를 함으로써 기존의 추출물에 비해 알코올 분해능이 향상되는 것을 알 수 있으며, 알코올 섭취 초기에 더 많은 효과를 볼 수 있는 것으로 나타났다. 이는 동물 실험 결과와 유사한 결과로 EHE 섭취 시 HE에 비해 알코올 섭취 초기에 더 많은 알코올 분해력을 볼 수 있을 것으로 사료된다.
- 특히 EHE의 경우, 알코올 섭취 초기에 더 많은 효과가 있는 것으로 나타났다. 이로 미루어 보아 효소 처리를 함으로써 기존의 추출물에 비해 알코올 분해능이 향상되는 것을 알 수 있으며, 알코올 섭취 초기에 더 많은 효과를 볼 수 있는 것으로 나타났다. 이는 동물 실험 결과와 유사한 결과로 EHE 섭취 시 HE에 비해 알코올 섭취 초기에 더 많은 알코올 분해력을 볼 수 있을 것으로 사료된다.
- Rohament CL 효소를 1% 첨가할 경우, 시간이 지남에 따라 활성이 증가하다가 30시간대부터 활성의 증가가 변화가 거의 없었다. 이로 보아 36시간까지 효소 처리하는 것이 가장 효율적일 것이라 사료된다. Rohament CL 효소 1% 첨가하여 36시간 효소 처리한 헛개나무 열매 추출물을 이용하여 동물 실험 및 임상 실험을 실시한 결과, control 군 및 헛개나무 열매 추출물 군에 비해 알코올 농도가 줄어드는 것을 볼 수 있었으며, 특히 알코올 섭취 초기에 그 효과가 가장 뛰어난 것으로 나타났다.
- 이로 보아 효소 처리한 헛개나무 열매 추출물이 기존의 헛개나무 열매 추출물에 비해 더 많은 체내 알코올 농도 감소를 나타낼 것으로 생각되며, 음주 초기에 더 많은 영향을 줄 것으로 사료되어 진다.
- Hase et al(1997)은 쥐에 간염을 유발한 후에 헛개나무 추출물을 첨가하였을 경우, 간염 치료 효과를 보고하였고, Sakai et al(1987)은 헛개나무 추출물이 알코올 투여한 쥐의 혈중 알코올 농도를 저하시키는 효과가 있음을 보고하였다. 이처럼 헛개 열매 추출물은 알코올 분해 및 간기능 회복에 뛰어난 효과가 있는 것으로 나타났다. 예부터 사람들은 숙취를 해소하는 데 많은 관심을 갖게 되었고, 한국에서는 전통적으로 콩나물, 미나리, 무, 부추 등 식탁을 통해 숙취 해소에 이용되어 왔다.
- 1, 0,5, 1%)로 첨가하여 48시간 효소처리 하면서 6시간 간격으로 sample을 채취해 ADH 효소 활성을 측정하였다. 효소 농도가 높을수록 효소 활성이 증가하였으며, 시간이 지남에 따라 활성이 높아졌다. Maxinvert 효소 처리 시기존의 활성보다 약 10% 증가하여 가장 낮은 활성 증가를 보였고, Rohament CL 효소를 1% 첨가하여 효소처리할 경우, 기존의 활성에 비해 효소 활성이 67% 증가한 것으로 가장 많은 효소 활성 증가를 보였다.
후속연구
- 경구를 통해 섭취된 알코올의 혈중 농도는 위장 관을 경유한 흡수율이 저해되거나(Kim & Park 1997), 알코올 대사율이 촉진됨으로써(Sakai et al 1989) 감소되는 것으로 알려져 있다. 본 연구 결과, HE 및 EHE는 알코올 대사율이 촉진됨에 따라 알코올 농도가 감소하는 것으로 사료되어지나 감소기전을 정확하게 판단하기 위해 추후에 연구 검토해야 할 과제로 사료된다.
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