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문제 정의
- 본 연구는 지자체에서 생산보급하고 있는 미생물 중 Bacillus subtilis를 채집한 후 국립농업과학원(농과원)이 보유하고 있는 B. subtilis R2-1 균주를 대조로 기능성을 분석하고, 이들을 활용한 고추 흰가루병의 방제 가능성을 검토하고자 수행하였다.
제안 방법
- 0 g, 증류수 1000 ml, Agar 20 g}을 샤레에 10 ml씩 분주하여 굳힌 후 샤레 정 중앙에 paper disc를 치상하고 그 위에 미생물 현탁액을 40 µl씩 접종하였다. 30℃에서 14일간 배양한 후 균총 주변에 투명환(Clear zone, halo zone) 형성여부를 조사하였다.
- B. subtilis R2-1균주의 농업현장에서의 활용 가능성을 구명하기 위하여 2009년도에 강원도 화천의 유기재배농가에서 오이 흰가루병 방제용 미생물 농약으로 등록되어 사용되고 있는 ‘큐펙트’와 ‘탑시드’를 대조로 하여 방제효과를 검정하였다.
- B. subtilis R2-1은 25℃ TSB 배지상에서 3일간 액체 배양하여 원액(108 cfu/ml)을 7일 간격으로 3회 처리하였고, 미생물농약(큐펙트 수화제, 탑시드 수화제)은 기준농도로 희석하여 B. subtilis R2-1 처리와 같은 방법으로 살포하였다.
-
고추 흰가루병에 대한 농업미생물 방제효과 검정(온실 검정).
- 농업미생물의 siderophore 생성여부를 확인하기 위하여 TSA(tryptic soy agar)와 CAS 배지(Milagres 등, 1999; Schwyn and Neilands, 1997)를 각각 조제하여 샤레에 분주한 후 Fig. 1과 같이 반으로 절단하여 중앙부분의 배지가 잘 맞닿도록 배지를 잘 붙인 후 TSA 배지 상에 농업미생물을 접종하고 28℃에서 14일 이상 배양하면서 변색여부를 조사하였다.
- 다기능 농업미생물 B. subtilis R2-1의 작용기작 구명을 위하여 고추 흰가루병 발생초기에 B. subtilis R2-1 포자현탁액을 살포한 후 7일에 처리된 잎을 채취하여 포자를 회수하여 0.1% PDB broth를 포함하는 홀글라스 내에 첨가하고, 24시간 25℃ 배양기내에 인큐베이션한 후 건전한 포자수를 조사하였다.
- 병 발생 정도는 1차 처리 후 7일과 최종 처리 후 5일에 각각 조사하였다. 다기능 농업미생물 B. subtilis R2-1의 포장 처리효과를 검증하기 위하여 2009년에 이어 2010년도에도 미생물 농약인 탑시드를 대조로 고추 흰가루병에 대한 처리효과를 조사하였다.
- 다기능 농업미생물 B. subtilis R2-1의 포장 처리효과를 검증하기 위하여 고추 유기재배농가에서 미생물 농약을 대조로 처리효과를 조사하였다. B.
- 변색정도에 따라 −, +, ++, +++로 구분하여 조사하였다.
- subtilis R2-1 처리와 같은 방법으로 살포하였다. 병 발생 정도는 1차 처리 후 7일과 최종 처리 후 5일에 각각 조사하였다. 다기능 농업미생물 B.
- 5 M FeCl3 1 ml) 4 ml을 넣고 실내에서 25분간 보관하면서 핑크색이 발현되면 530 nm에서 UV-spectrophotometer로 OD 값을 측정하였다. 순수 IAA를 이용한 standard curve를 산출한 다음 미생물 배양 결과 얻어진 OD 값을 산출식에 대입하여 오옥신 생성량을 측정하였다.
- 시험관에 KOH와 NaOH로 pH를 6.6−7.0으로 조정한 NFB배지{Malic acid 5.0 g, K2HPO4 0.6 g, KH2PO4 0.4 g, MnSO4 0.01 g, MgSO4 0.05 g, NaCl 0.02 g, Na2MoO4 0.002 g, Bromothymol blue (0.5% in alcohol) 2 ml, 증류수 1000 ml, Agar 1.75 g}를 시험관에 5 ml씩 분주하고 고압 멸균하여 식힌 후 Fig. 2와 같이 전 배양한 한 다음 미생물을 loop로 접종하여 배양하면서 변색여부를 관찰하였다.
- cfu/ml)하여 저농도로 조제한 길항균 현탁액을 고추 흰가루병 발생 초 및 7일 후에 분무처리하고 최종처리 후 7일에 병 발생 정도를 병반면적률로 조사하였다. 시험은 각 처리당 고추 3주씩 3반복으로 공시하여 수행하였다.
- 실험에 쓰일 시험관(test tube)은 70% 알코올에 헹궈서 미리 준비하고, 각각의 tube에 10 mM phosphoric acid를 100 µl씩 넣은 다음 상기한 배지액의 상등액 2 ml을 넣고, Salkovasky reagent (35% HClO4 50 ml + 0.5 M FeCl3 1 ml) 4 ml을 넣고 실내에서 25분간 보관하면서 핑크색이 발현되면 530 nm에서 UV-spectrophotometer로 OD 값을 측정하였다.
- 지자체 농업기술센터와 농과원에서 수집한 18개의 Bacillus subtilis 균주들이 보유하고 있는 기능성을 구명하기 위하여 항균활성을 비롯한 사이데로포아 생산, 질소고정능력, 인산가용화 능력 및 오옥신 생성능력을 조사하였다. B.
- 채집한 Bacillus 속 세균의 식물병원균에 대한 항균활성을 농과원이 보유한 Bacillus subtilis R2-1균주를 대조로 하여 다음과 같이 조사하였다. 채소류 시들음병균(Fusarium oxysporum), 벼 도열병균(Magnaporthe oryzae), 입고병균(Rhizoctonia solani), 채소류 잿빛곰팡이병균(Botrytis cinerea) 및 고추 탄저병균(Colletotrichum acutatum)은 Potato dextrose agar(PDA) 배지 상에서, 고추 역병균(Phytophthora capsici)은 V8주스배지 상에서 대치배양(dual culture)을 통해서 검정하였다.
- 채집한 Bacillus 속 세균의 식물병원균에 대한 항균활성을 농과원이 보유한 Bacillus subtilis R2-1균주를 대조로 하여 다음과 같이 조사하였다. 채소류 시들음병균(Fusarium oxysporum), 벼 도열병균(Magnaporthe oryzae), 입고병균(Rhizoctonia solani), 채소류 잿빛곰팡이병균(Botrytis cinerea) 및 고추 탄저병균(Colletotrichum acutatum)은 Potato dextrose agar(PDA) 배지 상에서, 고추 역병균(Phytophthora capsici)은 V8주스배지 상에서 대치배양(dual culture)을 통해서 검정하였다.
- 채집한 농업미생물의 고추 횐가루병 방제효과를 구명하기 위하여 각각의 농업미생물을 25℃ TSB 배지상에서 3일간 액체 배양한 다음 5배로 희석(105−106 cfu/ml)하여 저농도로 조제한 길항균 현탁액을 고추 흰가루병 발생 초 및 7일 후에 분무처리하고 최종처리 후 7일에 병 발생 정도를 병반면적률로 조사하였다.
- 항균활성을 보이는 농업미생물 B. subtilis R2-1균주의 현장 적용가능성을 구명하기 위하여 2009년도에 강원도 화천의 유기재배농가에서 오이 흰가루병 방제용 미생물 농약으로 등록되어 사용되고 있는 ‘큐펙트’와 ‘탑시드’를 대조로 하여 방제효과를 검정하였다.
이론/모형
- 농업미생물의 질소 고정능력을 확인하기 위하여 Kanimozhi와 Panneerselvam(2010)의 질소고정능력 측정법을 응용한 방법을 사용하였다. 시험관에 KOH와 NaOH로 pH를 6.
성능/효과
- subtilis R2-1균주는 두 가지 미생물농약 비하여 다소 낮은 방제효과를 보였으나, 2차 조사 시에는 ‘탑시드’보다는 약간 낮은 방제효과를 보였고 ‘큐펙트’에 비해서는 다소 높은 방제효과를 보였다(Table 4). 1년차 실험에서는 B. subtilis R2-1균주의 고추 흰가루병 방제효과는 1차 조사에서 38.7%, 2차 조사에서 37.7%로 친환경 고추재배농가에서 병 방제를 위해 사용하기에는 효과가 다소 저조하다고 판단되었다.
- 1차 조사시 B. subtilis R2-1균주는 두 가지 미생물농약 비하여 다소 낮은 방제효과를 보였으나, 2차 조사 시에는 ‘탑시드’보다는 약간 낮은 방제효과를 보였고 ‘큐펙트’에 비해서는 다소 높은 방제효과를 보였다(Table 4).
- 3%로 미생물 농약인 탑시드보다도 높게 나타났다. B. subtilis R2-1균주의 발병억제기작을 구명하기 위하여 B. subtilis R2-1균주와 미생물 농약(탑시드, 큐펙트)을 경엽 처리한 후 포자발아율을 계수한 결과, 미생물 농약인 큐펙트는 97.9%, 탑시드는 94.7% 억제하는데 비해서 B. subtilis R2-1균주는 84.2% 억제하는 것으로 나타났다. 앞으로 B.
- B. subtilis R2-1균주의 병 방제 효과를 재확인하기 위하여 2010년도에도 2009년도와 동일한 포장에서 방제효과 시험을 수행한 결과, 2009년도에 비하여 처리효과가 높게 나타났다. 고추 흰가루병 방제효과는 1차 조사에서 72.
- 3). B. subtilis R2-1균주의 포자발아 억제효과는 미생물농약인 큐펙트나 탑시드에 비해 다소 낮았으나 고추 흰가루병균의 포자발아를 현저히 억제하는 것으로 나타났다. 따라서 고추 흰가루병에 대한 B.
- 지자체 농업기술센터와 농과원에서 수집한 18개의 Bacillus subtilis 균주들이 보유하고 있는 기능성을 구명하기 위하여 항균활성을 비롯한 사이데로포아 생산, 질소고정능력, 인산가용화 능력 및 오옥신 생성능력을 조사하였다. B. subtilis 균주들은 대부분 입고병균(R. solani), 고추 탄저병균(C. acutatum), 채소류 시들음병균(F. oxysporum), 벼 도열병균(M. oryzae), 고추 역병균(P. capsici)에 대하여 항균활성을 보였다. 대부분의 균주가 Siderophore와 오옥신생성능력을 보였으며 질소고정능력도 함께 보유하고 있는 것으로 나타났다.
- 결론적으로 지자체에서 활용하고 있는 대부분의 B. subtilis는 폭넓은 항균활성을 보이며, 질소고정과, 오옥신 생성능력을 지닌 것으로 판명되었다. Woo 등(2008)은 고추역병 방제효과를 보이는 B.
- subtilis R2-1균주의 병 방제 효과를 재확인하기 위하여 2010년도에도 2009년도와 동일한 포장에서 방제효과 시험을 수행한 결과, 2009년도에 비하여 처리효과가 높게 나타났다. 고추 흰가루병 방제효과는 1차 조사에서 72.0%, 2차 조사에서 83.3%로 미생물 농약 탑시드보다도 높게 나타났다(Table 5). 2010년도에 병 방제효과가 높은 것은 2009년도에 B.
- 고추 흰가루병에 효과적인 B. subtilis 균주를 선발하고자 저농도(105−106 cfu/ml)로 살포하여 병 방제효과를 조사한 결과 B. subtilis 18균주를 제외한 모든 균주의 병방제효과가 인정되었으나 균주 간에는 차이를 보이지 않았다(Table 3).
- 농업미생물 처리에 의한 병원균 억제효과를 조사하고자 B. subtilis R2-1균주와 미생물 농약(탑시드, 큐펙트) 처리후 포자발아율을 계수한 결과, 큐펙트는 97.9%, 탑시드는 94.7%의 억제율을 보였으나, B. subtilis R2-1균주는 84.2% 억제율을 나타냈다(Table 6, Fig. 3). B.
- 인산가용화능은 조사한 Bacillus 속 균주 중 단 한 균주에서 활성을 보였다. 대부분의 B. subtilis 균주가 고추 흰가루병 억제효과를 보였으나, 균주 간에는 방제효과에 있어서 큰 차이를 보이지 않았다. B.
- capsici)에 대하여 항균활성을 보였다. 대부분의 균주가 Siderophore와 오옥신생성능력을 보였으며 질소고정능력도 함께 보유하고 있는 것으로 나타났다. 인산가용화능은 조사한 Bacillus 속 균주 중 단 한 균주에서 활성을 보였다.
- subtilis R2-1균주의 포자발아 억제효과는 미생물농약인 큐펙트나 탑시드에 비해 다소 낮았으나 고추 흰가루병균의 포자발아를 현저히 억제하는 것으로 나타났다. 따라서 고추 흰가루병에 대한 B. subtilis R2-1균주 처리효과는 항균활성에기인하는 것으로 판단되었다.
- 따라서 병원균을 효과적으로 억제하기 위해서는 병원균의 밀도가 낮을 때 즉, 병이 진전되기 전인 발병초기에 길항균을 처리하는 것이 좋다. 본 시험에서도 B. subtilis R2-1균주를 발병초기에 처리한 2010년도 시험에서 병 진전기에 처리한 2009년에 비해 높은 방제효과를 얻을 수 있었다. 또한 미생물의 처리효과를 높이기 위해서는 적기에 적절한 농도로 처리하는 것이 매우 중요한데, B.
- 대부분의 균주가 Siderophore와 오옥신생성능력을 보였으며 질소고정능력도 함께 보유하고 있는 것으로 나타났다. 인산가용화능은 조사한 Bacillus 속 균주 중 단 한 균주에서 활성을 보였다. 대부분의 B.
- 지자체 생산공급 농업미생물의 기능성 조사결과, 2009년도 채집 균주의 경우 모두 킬레이트물질인 siderophore를 생성하고 강한 오옥신 활성을 보였으나 활성에는 차이를 보였다. 질소고정능력도 대부분의 Bacillus 속 균주가 보유하고 있는 것으로 나타났다.
- 지자체 생산공급 농업미생물의 항균활성을 입고병균(R. solani), 고추 탄저병균(C. acutatum), 채소류 시들음병균(F. oxysporum), 벼 도열병균(M. oryzae), 고추 역병균(P. capsici)을 대상으로 검정한 결과 공시한 모든 균에 대하여 항균활성을 보였다(Table 1). 이는 일반적으로 Bacillus속 세균은 여러 식물병원균에 항균활성을 보인다는 보고와 일치한다(Feio 등, 2004; Jeong 등, 2010; Sgroy 등, 2001; Swain 등, 2009; Swain 등, 2008b; Zonzheng 등, 2009).
- 지자체 생산공급 농업미생물의 기능성 조사결과, 2009년도 채집 균주의 경우 모두 킬레이트물질인 siderophore를 생성하고 강한 오옥신 활성을 보였으나 활성에는 차이를 보였다. 질소고정능력도 대부분의 Bacillus 속 균주가 보유하고 있는 것으로 나타났다. 인산가용화능력은 Bacillus 속 균주 중 단 한 균주 만이 활성을 보였다(Table 2).
후속연구
- subtilis R2-1균주의 경우에도 균 농도 및 처리시기를 고려하여 처리할 경우 보다 높은 방제효과를 얻을 수 있을 것으로 사료되며 이에 대한 심도있는 검토가 필요하다. 또한 길항균 처리에 의한 병 방제효과를 높이기 위해서 길항균이 처리부위에 잘 정착하여 증식할 수 있도록 양질의 영양분을 제공해 주는 것도 검토할 필요가 있다. Hoitink 등(1999)은 적절한 퇴비(compost) 첨가할 경우 생물방제제가 잘 정착되어 생물적 방제효과를 증진시킬 수 있음을 보고한 바 있다.
- subtilis R2-1균주를 발병초기에 처리한 2010년도 시험에서 병 진전기에 처리한 2009년에 비해 높은 방제효과를 얻을 수 있었다. 또한 미생물의 처리효과를 높이기 위해서는 적기에 적절한 농도로 처리하는 것이 매우 중요한데, B. subtilis R2-1균주의 경우에도 균 농도 및 처리시기를 고려하여 처리할 경우 보다 높은 방제효과를 얻을 수 있을 것으로 사료되며 이에 대한 심도있는 검토가 필요하다. 또한 길항균 처리에 의한 병 방제효과를 높이기 위해서 길항균이 처리부위에 잘 정착하여 증식할 수 있도록 양질의 영양분을 제공해 주는 것도 검토할 필요가 있다.
- 상기한 바와 같이 B. subtilis는 다양한 기능을 가지고 있기 때문에 균주별 특성을 잘 파악하여 농업현장에서 활용하면 병 방제, 작물생육 촉진, 염류장해 제거 등 다양한 효과를 얻을 수 있을 것으로 사료된다.
- 고추 재배지에서 흰가루병 피해가 심각함에도 불구하고 이를 방제할 수 있는 생물방제 제가 아직 개발된 바 없다(Raudales 등, 2008). 앞으로 B. subtilis R2-1을 고농도로 배양할 수 있는 대량배양기술을 개발하고 항균활성 기능이 잘 발현되도록 제형화하면 생물농약으로의 개발이 가능할 것으로 사료된다.
- 2% 억제하는 것으로 나타났다. 앞으로 B. subtilis R2-1을 고농도로 배양할 수 있는 대량배양기술을 개발하고 항균활성 기능이 잘 발현되도록 제형화한다면 생물농약으로의 개발이 가능할 것으로 사료된다.
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