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문제 정의
- 본 연구에서는 토양으로부터 단백질 분해효소를 생산하는 미생물을 새로이 분리하여 동정함으로써, 새로운 단백질 분해효소 공급원을 확보하고자 하였다. 그 결과, 단백질을 효과적으로 분해할 수 있는 활성을 가진 균주 FBL-1을 토양으로부터 분리하였으며, 본 논문에서는 FBL-1 균주의 동정 및 특성에 대하여 서술하였다.
- 본 연구에서는 토양으로부터 단백질 분해효소를 생산하는 미생물을 새로이 분리하여 동정함으로써, 새로운 단백질 분해효소 공급원을 확보하고자 하였다. 그 결과, 단백질을 효과적으로 분해할 수 있는 활성을 가진 균주 FBL-1을 토양으로부터 분리하였으며, 본 논문에서는 FBL-1 균주의 동정 및 특성에 대하여 서술하였다.
제안 방법
- B. subtilis FBL-1의 protease 생산과 균체 성장에 적합한 질소원을 알아보기 위하여 질소원 종류에 따른 protease 활성과 건조균체량을 비교하였다. Fig.
- B. subtilis FBL-1의 발효가 진행되는 동안 protease의 생산에 가장 큰 영향을 미치고, 보다 높은 수준의 protease를 생산할 수 있는 탄소원을 알아보기 위하여 총 9가지의 탄소원 종류에 따른 protease 활성과 건조균체량을 비교하였다. Fig.
- 경상북도 경산시에 위치한 영남대학교 내 토양에 서식하는 protease 생산 미생물 한 종을 선발하여 FBL-1으로 명명하여 실험을 진행하였다. 균주 FBL-1은 skim milk를 포함한 TSB 고체배지에서 하얀색을 띄며 약간 울퉁불퉁한 표면을 갖는 colony를 형성하였고(Fig.
- 분석된 16S rDNA 염기서열은 NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 BlastN program의 GeneBank database의 정보로부터 균주 염기서열의 상동성을 확인하였다. 또한 EzTaxon database (http://www.ezbiocloud.net/)로부터 표준균주의 16S rDNA 염기서열들을 조사하여 계통발생적 연관성을 분석하였다[10]. 수집된 염기 서열들 간의 Multiple alignment는 Clustal X (2.
- 분리 균주의 배양학적 특성을 조사하기 위하여 TSB와 skim milk를 포함한 평판고체배지에서 생육한 colony의 색깔, 크기, 모양 등의 특성을 조사하였다.
- 탄소원 이용성 및 발효특성 등 분리 균주의 생리학적 특성은 Biolog test와 API 50CHB kit (Biomerieux, France)를 통하여 제조사의 지침에 따라 수행하였으며, API 50CHB kit test 결과는 API 50CHB database V4.0을 이용하여 동정하였다.
- 분리 미생물의 protease 생산에 질소원이 미치는 영향을 알아보기 위하여 탄소원 20 g/l, 질소원 5 g/l로 배지를 조성하여 배양하였다. 탄소원은 fructose로 고정하고 질소원은 beef extract, yeast extract, malt extract, tryptone, peptone, urea, ammonium sulfate, ammonium chloride, corn steep liquor 총 9가지 종류를 각각 이용하여 250 ml 삼각플라스크에서 100 ml 조업부피로 37℃, 200 rpm, 24시간 동안 진탕배양 하였다.
- 분리 미생물의 protease 생산에 탄소원이 미치는 영향을 알아보기 위하여 탄소원 20 g/l, 질소원 5 g/l로 배지를 조성하여 배양하였다. 탄소원은 glucose, maltose, xylose, starch, fructose, glycerol, galactose, sucrose, lactose 총 9가지 종류를 각각 이용하였고 질소원은 beef extract로 고정하고 250 ml 삼각플라스크에서 100 ml 조업부피로 37℃, 200 rpm, 24시간 동안 진탕배양 하였다.
대상 데이터
- 토양에 서식하는 protease 생산 미생물을 분리하기 위하여 경상북도 경산시 소재 영남대학교 내의 토양을 채취하여 멸균식염수(0.85% NaCl) 9 ml에 현탁한 후, 10-5−10-7으로 희석하여 분리용 평판고체배지(TSB 3.0 g/l, skim milk 2.0 g/l, agar 2.0 g/l)에 도말하였다. 도말한 평판고체배지는 37℃에서 24시간 동안 배양한 후 미생물 집락의 크기가 크면서 skim milk를 분해하여 집락 주변으로 투명환(clear zone)을 강하게 형성한 colony를 선별하였다.
이론/모형
- 0)를 사용하여 편집하였다. Mega (5.03) software를 이용하여 neighbor-joining method, maximum likelihood method, maximum parsimony method에 의해 염기서열간의 유전적 거리와 phylogenetic tree를 얻었다. 신뢰도(bootstrap value)는 1,000회의 재구성된 자료로부터 새로운 tree를 작성하여 계산하였다.
- 반응물은 Folin & Ciocalteu 방법을 이용하여 protease 활성을 분석하였다
- 3%) 등 Bacillus 속 균주들과 높은 상동성을 나타냈다. 이 결과를 바탕으로 Neighbor-Joining 법, Maximum likelihood 법, Maximum parsimony 법으로 각각 계통도를 작성하여 그 결과를 Fig. 2에 나타냈다.
성능/효과
- Fig. 3에서 보는 바와 같이 건조균체량은 탄소원을 첨가하지 않은 경우를 제외하고 모두 높은 결과를 보였으나, protease 활성은 특정 탄소원에서만 높게 나타났다. Fructose를 탄소원으로 첨가한 경우의 protease 활성이 201.
- Biolog test를 사용한 생리학적 특성 분석 결과, dextrin, inulin, N-acetyl-D-glucosamine, D-fructose, α-D-glucose, maltotriose, D-mannose, β-methyl-D-glucoside, palatinose, D-psicose, D-ribose, sucrose, D-trehalose, L-malic acid, pyruvic acid, L-alanyl-glycine, L-glutamic acid, L-pyroglutamic acid, inosine, thymidine, uridine, thymidine-5'-mono phosphate에 대한 assimilation 반응에서 양성으로 관찰되었다. API 50CHB kit를 사용한 생리학적 특성 분석 결과, Table 2에서 보는 바와 같이 FBL-1 균주는 glycerol, L-arabinose, ribose, galactose, glucose, fructose, inositol, mannitol, sorbitol, α-methyl-D-glucoside, N-acetyl-glucosamine, maltose, melibiose, sucrose, trehalose, inulin, raffinose, starch, D-turanose에 대한 assimilation 반응에서 양성으로 관찰되었으며, esculin hydrolysis (β-glucosidase) 효소반응에서 양성을 보였다. 비교 균주인 B.
- subtilis DSM 347 모두 양성임을 알 수 있었다. Biolog test 결과와 API 50CHB test 결과를 바탕으로 API 50CHB database V4.0을 이용하여 동정한 결과, 균주 FBL-1은 Bacillus megaterium과 73%, B. subtilis와 22.
- 균주 FBL-1의 표현형질에 대한 1차적인 동정을 위하여 Biolog test와 API 50CHB test를 수행하였으며 그 결과를 각각 Table 1과 Table 2에 나타냈다. Biolog test를 사용한 생리학적 특성 분석 결과, dextrin, inulin, N-acetyl-D-glucosamine, D-fructose, α-D-glucose, maltotriose, D-mannose, β-methyl-D-glucoside, palatinose, D-psicose, D-ribose, sucrose, D-trehalose, L-malic acid, pyruvic acid, L-alanyl-glycine, L-glutamic acid, L-pyroglutamic acid, inosine, thymidine, uridine, thymidine-5'-mono phosphate에 대한 assimilation 반응에서 양성으로 관찰되었다. API 50CHB kit를 사용한 생리학적 특성 분석 결과, Table 2에서 보는 바와 같이 FBL-1 균주는 glycerol, L-arabinose, ribose, galactose, glucose, fructose, inositol, mannitol, sorbitol, α-methyl-D-glucoside, N-acetyl-glucosamine, maltose, melibiose, sucrose, trehalose, inulin, raffinose, starch, D-turanose에 대한 assimilation 반응에서 양성으로 관찰되었으며, esculin hydrolysis (β-glucosidase) 효소반응에서 양성을 보였다.
- 3에서 보는 바와 같이 건조균체량은 탄소원을 첨가하지 않은 경우를 제외하고 모두 높은 결과를 보였으나, protease 활성은 특정 탄소원에서만 높게 나타났다. Fructose를 탄소원으로 첨가한 경우의 protease 활성이 201.436 U/ml로 가장 우수한 결과를 보였으며, 그 다음으로 maltose 117.681 U/ml, sucrose 90.116 U/ml, glucose 36.046 U/ml 등의 protease 활성을 나타내었다. 균체 성장의 경우 glucose를 탄소원으로 사용한 경우 건조균체량이 2.
- 4에서 보는 바와 같이 질소원이 포함되지 않은 배지에서는 전혀 protease 활성을 나타내지 않았기 때문에 질소원 또한 탄소원과 함께 protease 생산에 중요한 인자임을 알 수 있다. Protease 생산에 가장 우수한 영향을 미치는 질소원으로는 yeast extract (451.640 U/ml)로 확인되었으며, 그 다음으로는 beef extract (194.014 U/ml)와 tryptone (183.414 U/ml)을 사용한 경우에서 비교적 높은 활성을 보였다. 대부분의 유기 질소원의 경우에는 protease 활성이 높게 나타났으나, malt extract 및 peptone의 경우는 다른 유기 질소원에 비하여 상대적으로 낮은 protease 활성과 균체 성장을 보였다.
- subtilis NCIB 3610, B. subtilis DSM 347 모두 양성임을 알 수 있었다. Biolog test 결과와 API 50CHB test 결과를 바탕으로 API 50CHB database V4.
- 이 실험의 결과로부터 B. subtilis FBL-1을 이용한 protease 생산에 있어서 fructose가 가장 우수한 탄소원임을 알 수 있었다. 탄소원을 포함하지 않고 beef extract 5 g/l 만을 포함한 배지의 경우 protease 활성을 전혀 보이지 않았으나, 탄소원을 포함한 모든 배지에서 효소활성이 나타나는 것으로 보아 탄소원이 protease 생산에 중요한 영향을 미친다는 사실을 알 수 있었다.
- 따라서 B. subtilis FBL-1을 이용한 protease 생산에는 yeast extract가 가장 적합하다는 것을 알 수 있었다.
- 균주 FBL-1의 16S rDNA 염기서열을 분석하여 NCBI의 BlastN program으로 다른 미생물들과의 상동성을 조사한 결과, Bacillus 속 미생물들과 높은 상동성을 보였다. Table 3에서 보는 바와 같이 FBL-1 균주의 16S rDNA 염기서열은 B.
- 또한, ammonium sulfate, ammonium chloride, urea와 같은 무기 질소원을 사용한 경우 protease 활성이 매우 낮게 나타났다. 균체 성장의 경우 beef extract를 질소원으로 사용한 경우 건조균체량이 1.668 g/l로 가장 높게 나타났으나 protease 활성은 194.014 U/ml로서 상대적으로 낮은 결과가 관찰되었다. 반면, yeast extract를 질소원으로 사용한 경우 건조균체량은 1.
- 046 U/ml 등의 protease 활성을 나타내었다. 균체 성장의 경우 glucose를 탄소원으로 사용한 경우 건조균체량이 2.065 g/l로 가장 높게 나타났으나 protease 활성은 36.046 U/ml로서 상대적으로 낮은 결과가 관찰되었다. 반면, fructose를 탄소원으로 사용한 경우 건조균체량은 1.
- 414 U/ml)을 사용한 경우에서 비교적 높은 활성을 보였다. 대부분의 유기 질소원의 경우에는 protease 활성이 높게 나타났으나, malt extract 및 peptone의 경우는 다른 유기 질소원에 비하여 상대적으로 낮은 protease 활성과 균체 성장을 보였다. 또한, ammonium sulfate, ammonium chloride, urea와 같은 무기 질소원을 사용한 경우 protease 활성이 매우 낮게 나타났다.
- 046 U/ml로서 상대적으로 낮은 결과가 관찰되었다. 반면, fructose를 탄소원으로 사용한 경우 건조균체량은 1.580 g/l로 실험에 사용한 탄소원들 중 중간 정도의 균체 성장을 보였으나 protease 활성은 가장 높은 값을 나타냈다. 탄소원을 첨가하지 않은 경우에도 건조 균체량은 0.
- 1A), 평판고체배지 상에서 투명환을 크게 생성하여 강한 단백질 분해활성을 나타냈다. 주사전자현미경(SEM)으로 관찰한 결과, FBL-1 균주는 긴 막대 모양의 단일 세포이며 약 3 μm 길이의 간균 형태를 나타냈다(Fig. 1B).
- subtilis FBL-1을 이용한 protease 생산에 있어서 fructose가 가장 우수한 탄소원임을 알 수 있었다. 탄소원을 포함하지 않고 beef extract 5 g/l 만을 포함한 배지의 경우 protease 활성을 전혀 보이지 않았으나, 탄소원을 포함한 모든 배지에서 효소활성이 나타나는 것으로 보아 탄소원이 protease 생산에 중요한 영향을 미친다는 사실을 알 수 있었다.
후속연구
- 0을 이용하여 동정한 결과, 균주 FBL-1은 Bacillus megaterium과 73%, B. subtilis와 22.9% 특성이 유사한 것으로 판정되었으나 보다 더 정확한 동정을 위해서는 16S rDNA 염기서열 분석을 통한 비교가 필요할 것으로 판단되었다.
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