멜라닌 생합성은 tyrosinase의 효소적 산화반응에 의해 일어난다. 톳(Hizikia fusiformis)의 미백효과를 검증하기 위하여 메탄올, 헥산, 부탄올 및 물을 용매로 이용한 분획과정을 통해 톳 에탄올 추출물로부터 분획물을 제조하였다. 에탄올 추출물과 분획물들을 대상으로 B16F10 흑색종 세포에서 tyrosinase 활성 저해효과 및 멜라닌 생합성 억제효과를 평가하였다. 생쥐의 에탄올 추출물 및 수층 분획물은 미백효과를 나타냈지만, 세포독성은 나타내지 않았다. 에탄올 추출물은 시료들 중에서 가장 높은 미백활성을 보였다. 에탄올 추출물은 $100{\mu}g/ml$의 농도에서 arbutin $10{\mu}g/ml$의 활성보다 높은 저해활성을 보였으나, kojic acid$10{\mu}g/ml$의 활성보다는 낮은 저해활성을 보였다. 또한, 메탄올, 헥산, 부탄올 및 수층 분획물은 $100{\mu}g/ml$의 농도에서 arbutin $10{\mu}g/ml$의 활성과 유사한 저해활성을 보였다. 항산화 활성은 L-ascorbic acid를 양성 대조군으로 하여 수치를 비교하여 나타냈다. 에탄올 추출물 및 수층 분획물의 DPPH 라디칼 소거활성은 다른 시료들보다 비교적 높게 나타났다. 또한, 에탄올 추출물및 수층 분획물은 $500{\mu}g/ml$의 농도에서 LPS에 의해 유도된 iNOS 발현을 각각 82와 80% 감소시켰다. 이러한 결과들로 톳의 에탄올 추출물과 수층 분획물은 미백효과 및 피부 보호효과를 가지는 화장품 소재로 이용 가능할 것으로 기대된다.
멜라닌 생합성은 tyrosinase의 효소적 산화반응에 의해 일어난다. 톳(Hizikia fusiformis)의 미백효과를 검증하기 위하여 메탄올, 헥산, 부탄올 및 물을 용매로 이용한 분획과정을 통해 톳 에탄올 추출물로부터 분획물을 제조하였다. 에탄올 추출물과 분획물들을 대상으로 B16F10 흑색종 세포에서 tyrosinase 활성 저해효과 및 멜라닌 생합성 억제효과를 평가하였다. 생쥐의 에탄올 추출물 및 수층 분획물은 미백효과를 나타냈지만, 세포독성은 나타내지 않았다. 에탄올 추출물은 시료들 중에서 가장 높은 미백활성을 보였다. 에탄올 추출물은 $100{\mu}g/ml$의 농도에서 arbutin $10{\mu}g/ml$의 활성보다 높은 저해활성을 보였으나, kojic acid $10{\mu}g/ml$의 활성보다는 낮은 저해활성을 보였다. 또한, 메탄올, 헥산, 부탄올 및 수층 분획물은 $100{\mu}g/ml$의 농도에서 arbutin $10{\mu}g/ml$의 활성과 유사한 저해활성을 보였다. 항산화 활성은 L-ascorbic acid를 양성 대조군으로 하여 수치를 비교하여 나타냈다. 에탄올 추출물 및 수층 분획물의 DPPH 라디칼 소거활성은 다른 시료들보다 비교적 높게 나타났다. 또한, 에탄올 추출물및 수층 분획물은 $500{\mu}g/ml$의 농도에서 LPS에 의해 유도된 iNOS 발현을 각각 82와 80% 감소시켰다. 이러한 결과들로 톳의 에탄올 추출물과 수층 분획물은 미백효과 및 피부 보호효과를 가지는 화장품 소재로 이용 가능할 것으로 기대된다.
Melanin synthesis is catalyzed by tyrosinase. To investigate the whitening effect of Hizikia fusiformis, fractions from ethanol extract of H. fusiformis were prepared by a systematic fractionation procedure with solvents such as methanol, hexane, butanol, and $H_2O$. The ethanol extract a...
Melanin synthesis is catalyzed by tyrosinase. To investigate the whitening effect of Hizikia fusiformis, fractions from ethanol extract of H. fusiformis were prepared by a systematic fractionation procedure with solvents such as methanol, hexane, butanol, and $H_2O$. The ethanol extract and its fractions were then subjected to evaluate the inhibitory effects on the tyrosinase activity and melanin synthesis in murine B16F10 melanoma cells. The ethanol extract and aqueous fraction exhibited a whitening effect with no cytotoxicity. The ethanol extract showed the highest whitening effect among the samples. The inhibitory effect of $100{\mu}g/ml$ of ethanol extract was higher than that of $10{\mu}g/ml$ of arbutin, but it was lower than that of $10{\mu}g/ml$ of kojic acid. Furthermore, the inhibitory effects of $100{\mu}g/ml$ of methanol, hexane, butanol, and aqueous fractions were similar to those of $10{\mu}g/ml$ of arbutin. The antioxidant activities were examined by comparing the results with that of ascorbic acid as a positive control. The ethanol extract and aqueous fraction showed relatively higher DPPH radical-scavenging activities compared with the other samples. Furthermore, $500{\mu}g/ml$ of ethanol extract and aqueous fraction diminished LPS-induced iNOS expression to 82 and 80%, respectively. These results suggest that ethanol extract and aqueous fraction of H. fusiformis could be used as cosmetic ingredients for whitening and skin protection effects.
Melanin synthesis is catalyzed by tyrosinase. To investigate the whitening effect of Hizikia fusiformis, fractions from ethanol extract of H. fusiformis were prepared by a systematic fractionation procedure with solvents such as methanol, hexane, butanol, and $H_2O$. The ethanol extract and its fractions were then subjected to evaluate the inhibitory effects on the tyrosinase activity and melanin synthesis in murine B16F10 melanoma cells. The ethanol extract and aqueous fraction exhibited a whitening effect with no cytotoxicity. The ethanol extract showed the highest whitening effect among the samples. The inhibitory effect of $100{\mu}g/ml$ of ethanol extract was higher than that of $10{\mu}g/ml$ of arbutin, but it was lower than that of $10{\mu}g/ml$ of kojic acid. Furthermore, the inhibitory effects of $100{\mu}g/ml$ of methanol, hexane, butanol, and aqueous fractions were similar to those of $10{\mu}g/ml$ of arbutin. The antioxidant activities were examined by comparing the results with that of ascorbic acid as a positive control. The ethanol extract and aqueous fraction showed relatively higher DPPH radical-scavenging activities compared with the other samples. Furthermore, $500{\mu}g/ml$ of ethanol extract and aqueous fraction diminished LPS-induced iNOS expression to 82 and 80%, respectively. These results suggest that ethanol extract and aqueous fraction of H. fusiformis could be used as cosmetic ingredients for whitening and skin protection effects.
멜라닌 생성에 중요한 역할을 하는 효소인 tyrosinase에 대한 저해 활성은 mushroom tyrosinase를 효소원으로 하여 기질인 L-DOPA와의 반응으로 생성된 L-dopaquinone의 흡광도로 측정하였다[25]. 측정결과, 톳 에탄올 추출물은 100 μg/ml의 농도에서 음성 대조군에 비해 통계적으로 유의하게 mushroom tyrosinase의 활성을 44% 억제하였다(Fig.
세포 추출물의 luciferase 활성 측정은 luciferase assay kit (Promega, WI, USA)를 사용하여 제조사의 manual을 토대로 행하였으며, TD-20/20 Luminometer (Turner Design, Sunnyvale CA, USA)를 이용하여 측정하였다. 모든 luciferase 활성측정 결과는 BCA protein assay reagent (Pierce, Rockford, IL, USA)로 측정한 세포 추출물의 단백질 함량으로 표준화하였다.
배지를 제거하고 배양 세포를 PBS로 세정한 후 LPS (최종농도 1 μg/ml)를 첨가한 다음 검증 시료용액 5 µl를 첨가하여 37℃, 5% CO2에서 24시간 배양하였다. 세포 추출물의 luciferase 활성 측정은 luciferase assay kit (Promega, WI, USA)를 사용하여 제조사의 manual을 토대로 행하였으며, TD-20/20 Luminometer (Turner Design, Sunnyvale CA, USA)를 이용하여 측정하였다. 모든 luciferase 활성측정 결과는 BCA protein assay reagent (Pierce, Rockford, IL, USA)로 측정한 세포 추출물의 단백질 함량으로 표준화하였다.
톳(Hizikia fusiformis)의 건조분말시료에 10배량(w/v)의 80% ethanol을 첨가하여 80℃에서 8시간 동안 추출을 행하였으며, 추출액을 지름 150 mm의 여과지(Advantec, Japan)로 2회 여과하고 동결건조하여 에탄올 추출시료를 제조하였다. 에탄올 추출시료를 다시 methanol, hexane, butanol, H2O 등을 이용하여 Fig. 1에 나타낸 방법으로 분획을 행한 후, speed vacuum evaporation으로 농축하고 동결건조하여 각각의 용매에 대한 분획물을 제조하였다.
톳 추출 및 분획 시료의 면역 활성을 검증하기 위하여 양성대조군인 saponin (Sigma, USA)과 비교하여 LPS 유도성 iNOS 발현 저해효과를 측정하였다. RAW264.
DPPH는 517 nm에서 최대 흡수를 나타내며, 환원되면 517 nm에서 흡수가 없어지므로 DPPH의 환원정도는 환원제의 환원력에 달려있다[26]. 톳 추출 및 분획 시료의 항산화 활성을 검증하기 위하여 양성대조군인 BHT (butyl hydroxy toluen, Sigma, USA), Gallic acid (Sigma, USA), Ascorbic acid (Sigma, USA)와 비교하여 DPPH의 수소 공여능을 측정하였다. 그 결과, 톳 에탄올 추출물의 5,000 μg/ml의 농도에서 93%의 라디칼 소거능을 나타냈다(Fig.
톳(Hizikia fusiformis)의 건조분말시료에 10배량(w/v)의 80% ethanol을 첨가하여 80℃에서 8시간 동안 추출을 행하였으며, 추출액을 지름 150 mm의 여과지(Advantec, Japan)로 2회 여과하고 동결건조하여 에탄올 추출시료를 제조하였다. 에탄올 추출시료를 다시 methanol, hexane, butanol, H2O 등을 이용하여 Fig.
톳의 추출물과 분획물이 B16F10 세포에 대해 독성을 나타내는지의 여부를 조사하기 위하여 시료를 다양한 농도로 1일 동안 세포에 처리하고 MTT법으로 세포의 생존율을 조사하였다. 그 결과, 톳 에탄올 추출물은 1, 10, 100 μg/ml의 모든 농도에서 통계적으로 유의한 세포 독성을 나타내지 않았고, 톳 수층 분획물 역시 모든 농도에서 통계적으로 유의한 세포 독성을 나타내지 않았다(Fig.
대상 데이터
본 실험에서 사용한 해조류인 톳을 흐르는 물에 세척하고 건조시킨 후 분쇄기로 분쇄하였다. 건조된 분말시료 500 g을 ethanol로 80℃에서 8시간 동안 추출하고 농축시킨 후 동결건조시켜 108.5 g의 톳 에탄올 추출물을 획득하였다. 얻어진 추출물의 성분을 그림 1과 같이 극성과 비극성으로 분획하고 농축시킨 후 동결건조시켜 메탄올 분획물 5.
본 실험에 사용한 톳은 국내에서 자생 또는 양식되는 생시료를 구입하여 부착물을 제거하고 수세 및 건조시킨 후 분쇄한 다음 밀봉하여 보관하면서 사용하였다.
본 연구에 사용된 생쥐의 B16F10 흑색종(melanoma) 세포는 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank, KCLB, Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였다. B16F10 세포를 10% feal bovine serum (FBS, BioWhittaker, Walkersville, MD, USA)과 penicillin-streptomycin (100 units/ml, BioWhittaker)을 포함하는 DMEM (BioWhittaker) 배지를 이용하여 37℃, 5% CO2에서 배양하였다.
농도별로 희석한 검증 시료용액 50 μl와 DPPH 용액 200 µl를 균일하게 혼합한 다음 실온에서 30분간 방치한 후 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군으로 ascorbic acid (Sigma, USA)를 사용하였다.
8) buffer 155 μl에 50 mM L-DOPA (Sigma, USA) 기질액 25 μl와 검증 시료용액 10 μl를 첨가하고 잘 혼합한 후, mushroom tyrosinase (50 units/ml, Sigma, USA) 10 μl를 첨가하고 25℃에서 2분간 반응시켜 생성된 DOPA chrome을 475 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성대조군으로 kojic acid (Sigma, USA)와 arbutin (Sigma, USA)을 사용하였다.
8) buffer 155 μl에 50 mM L-DOPA (Sigma, USA) 기질액 25 μl와 검증 시료용액 10 μl를 첨가하고 잘 혼합한 후, mushroom tyrosinase (50 units/ml, Sigma, USA) 10 μl를 첨가하고 25℃에서 2분간 반응시켜 생성된 DOPA chrome을 475 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성대조군으로 kojic acid (Sigma, USA)와 arbutin (Sigma, USA)을 사용하였다.
5 g의 톳 에탄올 추출물을 획득하였다. 얻어진 추출물의 성분을 그림 1과 같이 극성과 비극성으로 분획하고 농축시킨 후 동결건조시켜 메탄올 분획물 5.1 g, 헥산 분획물 3.7 g, 부탄올 분획물 3.8 g, 수층 분획물 4.1 g을 획득하였다. 톳 에탄올 추출물의 수율은 21.
이론/모형
배양이 끝난 세포의 생존율은 Chung 등이 사용한 3-[4,5-dimethylthiazole-2yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide(MTT, Sigma, USA) 환원 방법을 이용하여 측정하였다[4]. B16F10 세포를 96 well plate에 well당 1×104개의 세포를 접종하고 24시간 동안 37℃, 5% CO2 세포배양기에서 배양한 후 검증 시료용액 10 μl를 첨가하고 24시간 동안 배양하였다.
성능/효과
B16F10 세포에 각 시료를 처리한 후, 멜라닌생성 저해활성을 측정한 결과, 톳 에탄올 추출물은 100 μg/ml의 농도에서 음성 대조군에 비해 통계적으로 유의하게 멜라닌 생성을 26% 저해하는 것으로 나타났고, 톳 수층 분획물은 100 μg/ml의 농도에서 통계적으로 유의하게 18% 저해하였다(Fig. 4).
B16F10 세포의 세포내 tyosinase 저해활성을 측정한 결과, 톳 에탄올 추출물은 100 μg/ml의 농도에서 음성 대조군에 비해 통계적으로 유의하게 40%의 저해활성을 나타냈으며, 10 μg/ml의 농도에서도 통계적으로 유의하게 20%의 저해활성을 나타냈다(Fig. 5).
RAW264.7/pGL2 Neo-miNOS_pro11 세포에 LPS를 처리하여 iNOS 발현을 유도한 후 톳 에탄올 추출물 및 용매 분획물을 처리하여 활성을 측정한 결과, LPS 만을 처리하여 iNOS 발현을 유도시킨 대조 군에 비해 톳 에탄올 추출물을 500 μg/ml의 농도로 처리하였을 때 iNOS 발현이 82% 저해되어 표준물질인 saponin 50 μg/ml 농도와 유사한 저해효과를 나타냈고, 50 μg/ml의 농도로 처리하였을 때 iNOS 발현이 42% 저해되어 saponin 0.5 μg/ml의 농도보다 높은 저해효과를 나타냈다(Fig. 7).
가장 높은 저해활성을 나타낸 톳 에탄올 추출물은 10 μg/ml의 농도에서 양성 대조군인 arbutin 및 kojic acid 10 μg/ml의 농도보다 낮은 저해활성을 나타냈지만, 100 μg/ml의 농도에서는 arbutin 10 μg/ml의 농도보다 높은 저해활성을 나타냈다(Fig. 5).
가장 높은 저해활성을 나타낸 톳 에탄올 추출물은 100 μg/ml의 농도에서 양성 대조군인 arbutin 100 μg/ml의 농도와 유사한 저해활성을 나타냈지만, 또 다른 양성 대조군인 kojic acid 10 μg/ml의 농도보다 낮은 저해활성을 나타냈다(Fig. 2).
가장 높은 저해활성을 나타낸 톳 에탄올 추출물은 100 μg/ml의 농도에서 양성 대조군인 arbutin 및 kojic acid 100 μg/ml의 농도보다 낮은 저해활성을 나타냈지만, arbutin 및 kojic acid 10 μg/ml의 농도보다는 높은 저해활성을 나타냈다(Fig. 4).
그 결과, 톳 에탄올 추출물은 1, 10, 100 μg/ml의 모든 농도에서 통계적으로 유의한 세포 독성을 나타내지 않았고, 톳 수층 분획물 역시 모든 농도에서 통계적으로 유의한 세포 독성을 나타내지 않았다(Fig. 3).
그 결과, 톳 에탄올 추출물의 5,000 μg/ml의 농도에서 93%의 라디칼 소거능을 나타냈다(Fig. 6).
6). 따라서 DPPH 자유 라디칼 소거능의 측정결과, 톳 에탄올 추출물 및 수층 분획물을 항산화 소재로 활용이 가능하다는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 톳의 메탄올, 헥산, 부탄올 및 수층 분획물들은 100 μg/ml의 농도에서 음성 대조군에 비해 통계적으로 유의하게 각각 18%, 22%, 20%, 23%의 저해활성을 나타냈다(Fig. 5).
또한, 톳의 부탄올, 헥산 및 메탄올 분획물들을 500 μg/ml의 농도로 처리하였을 때 iNOS 발현이 각각 70%, 62%, 65% 저해되어 표준물질인 saponin 50 μg/ml의 농도와 유사한 저해효과를 나타냈다(Fig. 7).
시료들 중에서 가장 높은 소거능을 나타낸 톳에탄올 추출물은 5,000 μg/ml의 농도에서는 양성대조군인 ascorbic acid 및 gallic acid의 동일 농도와 유사한 소거능을 나타냈지만, 500 μg/ml의 농도에서는 동일 농도의 양성 대조군보다 낮은 소거능을 나타냈다(Fig. 6).
7). 이 결과로, 톳 에탄올 추출물 및 수층 분획물이 LPS 유도성 iNOS 발현을 효과적으로 저해할 수 있는 것을 확인할 수 있었다.
측정결과, 톳 에탄올 추출물은 100 μg/ml의 농도에서 음성 대조군에 비해 통계적으로 유의하게 mushroom tyrosinase의 활성을 44% 억제하였다(Fig. 2).
1 g을 획득하였다. 톳 에탄올 추출물의 수율은 21.7%로 나타났고, 분획물의 수율은 3.4~4.7%의 범위였고 메탄올 분획물이 가장 높게 나타났다(Table 1).
한편, 톳의 메탄올, 헥산, 부탄올 및 수층 분획물들은 100 μg/ml의 농도에서 음성 대조군에 비해 통계적으로 유의하게 효소활성을 각각 25%, 27%, 23% 및 27% 억제하였다(Fig. 2).
후속연구
이 과정에서 중요하게 작용하는 효소가 tyrosinase이며, tyrosinase 효소의 활성억제로 멜라닌 생합성을 억제할 수 있는 것으로 알려져 있다. 따라서 톳 에탄올 추출물 및 수층 분획물은 tyrosinase 활성을 억제시킴으로서 피부 색소 침착 등을 방어할 수 있는 미백 기능성 화장품의 소재로 이용 가능할 것으로 기대된다(Fig. 5).
Yoon 등은 갈조류인 곰피로부터 phlorotannin 물질인 phloroglucinol, dioxinodehydroeckol 및 7-phloroeckol을 분리, 정제하였으며, 이 중 7-phloroeckol이 가장 높은 미백활성을 나타내어 100 μM의 농도에서 B16F10 세포의 세포내 멜라닌 생성을 52% 저해한다고 보고하였다[37]. 본 연구에서 사용한 톳 역시 갈조류에 속하는 해조류이므로 추가 실험을 통하여 톳으로부터 7-phloroeckol의 분리 정제 및 미백활성의 확인이 필요할 것으로 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
멜라닌이란?
따라서, 피부의 색소 침착 현상을 방지하지 위해서는 멜라닌 생성과정의 일부분을 저해하여 멜라닌 생성을 감소시켜야 한다. 멜라닌은 동․식물과 미생물계에 널리 존재하는 페놀류의 고분자 천연색소로 표피 기저층에 존재하는 melanocyte 내의 melanosome에서 합성된다[30]. 멜라닌은 L-tyrosine의 연속 적인 산화반응으로 합성되는데, L-tyrosine은 tyrosinase에 의해 3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA)으로 전환되고, L-DOPA는 phenylanine-3,4-quinone으로 산회되며, 중간 대사산물을 거쳐 최종적으로 멜라닌이 된다[32].
피부의 색소 침착 현상을 방지하기 위해서 필요한 것은?
멜라닌은 자외선으로부터 피부를 보호하는 역할을 하지만 과도하게 생성될 경우 피부에 색소가 침착되어 기미와 주근깨를 형성하며, 심할 경우 피부암의 원인이 되기도 한다[9]. 따라서, 피부의 색소 침착 현상을 방지하지 위해서는 멜라닌 생성과정의 일부분을 저해하여 멜라닌 생성을 감소시켜야 한다. 멜라닌은 동․식물과 미생물계에 널리 존재하는 페놀류의 고분자 천연색소로 표피 기저층에 존재하는 melanocyte 내의 melanosome에서 합성된다[30].
천연물을 활용한 화장품소재를 개발하게 된 기존의 미백 소재가 가지고 있는 문제점은?
따라서, 피부미백과 관련된 기능성 화장품의 소재를 개발하기 위해서는 그 물질이 tyrosinase의 활성을 저해하는지의 여부가 중요하다[7]. 현재까지 멜라닌 색소의 생합성을 저해하는 물질에 관한 연구는 주로 tyrosinase의 활성을 저해하는 수준에서 이루어져 왔으며 저해제로는 hydroquinone, ascorbic acid, 4-hydroxyanisole, kojic acid, azelaic acid, arbutin, corticosteroids 등이 보고되고 있으나, 안전성 및 경제성 등의 문제점으로 사용이 제한되고 있다[1,14,22,24,33]. 따라서, 화장품 업계에서는 기존의 미백소재가 가지고 있는 이러한 단점을 극복하기위해 최근에는 상백피, 짝자래나무, 포도씨 및 피트모스 추출물 등의 천연물을 활용한 화장품소재의 개발을 위한 연구가 활발히 진행되고 있으며, 피부에 안전하면서 미백효과가 뛰어난 소재의 개발에 대한 요구가 증가하고 있다[7,10,17,29].
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