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문제 정의
- 전술한 바와 같이 여러 가지 작용기전에 따라 ACh성 신경세포의 기능을 강화시켜줄 수 있는 ACh성 약물들이 속속 개발되고 있고, 그 약리 작용 기전은 거의 AChE 저해 효과를 약효의 근간으로 삼고 있다(20). 본 연구에서는 시중에서 식용으로 가장 많이 사용되고 있는 생강과 식물 중 울금(C. longa L. 국산, 미얀마산), 강황(C. aromatica S. 인도산) 및 생강(Z. officinale Rosc.) 추출물의 GABA 함량, AChE 저해 활성 및 항산화 효과 등의 생리 활성의 상관관계를 살펴보고자 실험을 수행하였다.
가설 설정
- 1)Micrograms of GABA content/mg plants based on GABA as standard.
- 1)ND: not detected.
제안 방법
- 1 M KOH 160 μL를 eppendorf tube에 첨가한 다음 3～5분간 교반하고, 다시 13,000×g에서 5분간 원심분리한 후 상등액을 희석하여 GABA 함량 측정에 이용하였다. GABA 함량은 GABase를 이용하는 효소 방법을 사용하였고 생성되는 NADPH의 양을 ELISA reader(Molecular Deivce Co., Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 340 nm에서 측정하였다.
- 시료는 수세한 후 건조하여 실험에 사용하였다. 건조 시료 100 g에 10배(w/v)의 70% ethanol(Mallinckrodt Baker Inc., Philipsburg, MT, USA)을 첨가하여 24시간 동안 정치 추출하고, 이를 3회 반복하였다. 추출액은 여과지(Whatman No.
- 노인성 치매의 경우 신경세포의 사멸에 의한 것으로, 활성산소의 산화적 스트레스에 의하여 뇌조직에서 지질과산화의 증가, 단백질과 DNA 산화의 증가 및 신경세포 사멸 등에 의하여 유발된다고 보고 있다(35,36). 따라서 본 실험에서는 DPPH를 이용하여 라디칼 소거활성을 측정하였다. DPPH는 화학적으로 안정된 free radical을 가지고 있는 수용성 물질로 ascorbic acid, tocopherol, polyhydroxy 방향족 화합물 등에 의해 환원되어 짙은 자색이 탈색되는데, 이것은 다양한 천연 소재로부터 항산화 물질을 검색하는데 많이 이용되고 있다(37).
- DPPH는 화학적으로 안정된 free radical을 가지고 있는 수용성 물질로 ascorbic acid, tocopherol, polyhydroxy 방향족 화합물 등에 의해 환원되어 짙은 자색이 탈색되는데, 이것은 다양한 천연 소재로부터 항산화 물질을 검색하는데 많이 이용되고 있다(37). 본 실험에서는 4종의 생강과 식물의 ethanol 추출물을 이용하여 합성 항산화제인 BHA의 항산화 효과를 DPPH의 소거활성을 측정하여 비교하였으며 그 결과는 Fig. 1에 나타내었다. Control인 ethanol을 100%로 할 때, DPPH radical을 50% 소거하는 농도 RC50은 생강 추출물이 59.
- 본 실험에서는 생강과 4종의 추출물과 trolox의 ABTS radical의 소거활성을 측정하여 Fig. 1에 나타내었다. ABTS radical 소거활성 또한 DPPH radical 소거활성과 유사하게 국내산 울금 추출물의 경우 RC50 값이 105.
- 본 연구에서는 생강과 4종의 에탄올 추출물을 대상 시료로 하여 γ-ABAT와 SSADH 두 효소로 이루어진 GABase 효소를 이용하여 GABA 함량을 측정하였으며, 그 결과는 Table 3에 나타내었다.
- 생강과 4종 추출물에 함유된 6-gingerol, 8-gingerol, 10- gingerol, 6-shogaol, curcumin 함량을 HPLC(Jasco Co., Tokyo, Japan)를 이용하여 정량하였다. 분석표준물질은 6- gingerol, 8-gingerol, 10-gingerol, 6-shogaol은 Chromadex 사(Laguna Hills, CA, USA)에서 구입하여 사용하였다.
- 식품내의 지질이나 체내 생체막에 존재하는 지질은 활성산소의 존재 하에 유리기와 연쇄반응을 일으켜 산화되어 식품의 품질변화 및 생체노화의 원인이 되며(31), 이러한 산화 반응을 방지하기 위한 물질로 페놀성 화합물이 널리 이용되고 있어(32,33) 추출물에 함유된 페놀성 화합물의 함량을 조사하였다. 생강과 식물 ethanol 추출물에 존재하는 총 폴리 페놀 함량은 tannic acid를 기준물질로 하여 측정하였다(Table 2). 그 결과, 미얀마산 울금과 인도산 강황에서 각각 약 98.
- 생강과 식물의 인지기능 관련 활성을 검토하고 종류와 산지에 따른 차이를 비교하기 위하여, 시중에서 많이 사용되고 고품질로 알려져 있는 국산 생강과 울금, 미얀마산 울금과 인도산 강황의 항산화 효과, GABA 함량, 활성성분 분석, 그리고 AChE 억제 활성을 측정하였다. 미얀마산 울금 에탄올추출물에서 총 폴리페놀(98 μg/mg), curcumin(97.
- 생강의 유용성분으로 알려진 6-gingerol, 8-gingerol, 10-gingerol, 6-shogaol 및 색소 성분인 curcumin의 각 추출물에 따른 함유량을 측정하기 위하여 ethanol 추출물을 HPLC로 분석하여 전체 피크 면적에 대한 해당 피크 비율로 표시하였다(Table 1). 생강 추출물의 주성분은 6-gingerol(16.
- 시료에서 GABA 정량분석은 Zhang과 Bown의 방법(24)을 96 well plate에 맞게 수정하여 실시하였다. Eppendorf tube에 시료 0.
- 시료의 free radical 소거활성은 Blois(22)의 방법을 변형하여 stable radical인 α,α-diphenyl-β-picrylhydrazyl(DPPH, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)에 대한 환원력을 측정한 것으로 99% methanol에 각 시료를 녹여 농도별로 희석한 희석액 160 μL와 메탄올에 녹인 0.15 mM DPPH 용액 40 μL를 가하여 실온에 30분 방치한 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 여기에 70 mM LaCl3 1 mL을 가하여 잘 섞고 13,000×g에서 5분간 원심분리한 후에 상등액 700 μL와 0.1 M KOH 160 μL를 eppendorf tube에 첨가한 다음 3～5분간 교반하고, 다시 13,000×g에서 5분간 원심분리한 후 상등액을 희석하여 GABA 함량 측정에 이용하였다.
- 저해 활성 측정은 Ellman과 Courtney법(25)과 Sandahl과 Jenkins법(26)을 변형하여 수행하였다. AChE(Sigma Chemical Co.
- 표준곡선의 tannic acid 최종농도가 5, 10, 25, 75, 100 μg/mL가 되도록 하여 위와 같은 방법으로 700 nm에서 흡광도를 측정하여 작성하였다.
- 희석된 ABTS용액 180 μL에 sample 20 μL를 가하여 잘 혼합하고 정확히 1분 동안 방치한 후 흡광도를 측정하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 생강과 4종은 생강(Z. officinale Rosc., Korea), 울금(C. longa L., Korea), 울금(C. longa L., Myanmar), 강황(C. aromatica Salisb., India)은 한약재시장(www.hanyakjae.net)에서 건조 상태의 것을 구입하여 사용하였다. 시료는 수세한 후 건조하여 실험에 사용하였다.
- , Tokyo, Japan)를 이용하여 정량하였다. 분석표준물질은 6- gingerol, 8-gingerol, 10-gingerol, 6-shogaol은 Chromadex 사(Laguna Hills, CA, USA)에서 구입하여 사용하였다. 생강과 4종 추출물을 5 mg/mL 농도로 메탄올에 녹인 후 0.
- )를 이용하여 412 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 대조물질로는 대표 약물로 알려져 있는 eserine hemisulfate salt를 이용하였으며, 결과는 control군에 대한 %로 표시하였다.
- , Philipsburg, MT, USA)을 첨가하여 24시간 동안 정치 추출하고, 이를 3회 반복하였다. 추출액은 여과지(Whatman No. 3, Whatman Internatinal Ltd., Maidstone, England)로 여과한 다음 rotary evaporator(UT-1000, EYELA, Tokyo, Japan)로 55℃에서 농축한 후 동결 건조하여 2.7 g(국산 생강), 14.9 g, 14.7 g(국산, 미얀마산 울금), 21.3 g(인도산 강황) ethanol 추출물로 사용하였다.
데이터처리
- 실험결과의 통계분석은 SPSS program(Version 18.0, Chicago, IL, USA)을 이용한 일원분산분석법을 실시하여 Duncan’s multiple range test에 의해 시료간의 유의적 차이(p<0.05)를 검정하였다.
이론/모형
- ABTS[2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)] radical을 이용한 항산화력 측정은 ABTS cation decolourisation assay 방법(23)에 의하여 실시하였다.
- 총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis법(21)을 응용하여 측정하였다. 70% 에탄올 추출물 시료 1 mg을 증류수 1 mL에 녹이고 10배 희석한 희석액 2 mL에 2배로 희석한 Folin 시약 2 mL을 첨가하고 잘 혼합한 후 3분간 방치하여 2 mL의 10% Na2CO3를 서서히 가한다.
성능/효과
- AChE 억제 활성을 500 μg/mL 농도에서 측정한 결과, 항산화 효과가 높았던 미얀마산 울금과 인도산 강황 추출물에서 각각 약 53%와 51%로 높게 나타났으며 국산 생강, 울금추출물은 이 농도에서는 약 7%로 낮은 억제 효과를 나타내었다(Table 4).
- 국내산 2가지 추출물의 GABA 함량(약 1.11 μg/ mg)은 미얀마산 울금과 비슷한 정도로 높게 검출되어 라디칼 소거능과 AChE 억제능은 GABA 함량과는 상관성이 없었다.
- 국산 생강과 울금 추출물의 경우 총 폴리페놀 함량은 비슷하였으나(39.7～42.5 μg/mg) 6-gingerol, 6-shogaol 등의 진저롤류를 함유하고 있는 생강 추출물에서 울금보다 높은 라디칼 소거능, 특히 강한 ABTS 라디칼 소거능을 나타내었으며, AChE 저해능은 두 추출물 모두 매우 낮은 것으로 나타났다.
- 그 결과, 미얀마산 울금과 인도산 강황에서 각각 약 98.4 μg/mg과 85.7 μg/mg으로 높은 폴리페놀 함량을 나타냈으며, 국산 울금과 생강의 경우 42.5 μg/mg, 39.7 μg/mg으로 각각 나타났다.
- 11 μg/ mg)은 미얀마산 울금과 비슷한 정도로 높게 검출되어 라디칼 소거능과 AChE 억제능은 GABA 함량과는 상관성이 없었다. 따라서 본 실험에 사용한 4가지 생강과 식물 추출물의 AChE 억제능은 총 폴리페놀 함량과 밀접한 관계가 있으며, curcumin 함량, 라디칼 소거능 및 GABA 함량과는 직접적인 상관관계가 없는 것으로 나타났다. 이상의 결과와 같이, 미얀마산 울금은 나머지 추출물과 비교하여 높은 항산화 활성과 curcumin 및 GABA 함량, 그리고 비교적 높은 AChE 저해활성을 갖는 강력한 인지능 개선 소재로 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
- 미얀마산 울금 에탄올추출물에서 총 폴리페놀(98 μg/mg), curcumin(97.1 μg/ mg), GABA 함량(1.31 μg/mg)이 가장 높았으며, DPPH, ABTS 라디칼 소거능 및 AChE 저해능도 비교적 높게 나타났다.
- 생강 추출물의 주성분은 6-gingerol(16.7μg/mg)이었으며, 나머지 성분들도 1.2～3.0 μg/mg 정도로 함유하고 있는 것으로 나타났다.
- 4 μg/mg으로 보고하였다. 이 결과와 비교하면 미얀마산 울금이 curcumin을 상당히 많이 함유하고 있는 것을 알 수 있다.
- 01 μg/mg으로 가장 높은 GABA 함량을 나타냈다. 이상의 결과로 GABA 함량과 생강과 식물의 라디칼 소거능과는 상관성이 없는 것으로 사료된다.
- 한편 울금과 강황 추출물에는 gingerol과 shogaol은 검출되지 않았으며 curcumin이 주요 성분인 것으로 나타났고, 특히 미얀마산 울금에서는 curcumin을 약 100 μg/mg 함유하고 있는 것으로 나타났다.
- 한편, 인도산 강황 추출물도 미얀마산 울금과 비슷한 항산화 효과와 AChE 저해 효과가 나타났으나, curcumin(12.2 μg/mg)과 GABA(0.04 μg/mg) 함량은 매우 낮게 나타났다.
후속연구
- Kim 등(20)은 340종의 생약재를 이용하여 100 μg/mL의 농도에서 AChE 저해 활성을 검색한 결과, 강황이 약 17%, 울금이 약 35%의 AChE 저해 활성을 보인다고 보고하였으며, 본 실험에서도 이와 유사한 결과를 얻을 수 있었다. 또한 총 폴리페놀 함량과 라디칼 소거능이 높았던 미얀마산 울금과 인도산 강황 추출물에서만 AChE 저해 활성을 나타내어 향후 항산화 활성 및 폴리페놀 함량과 AChE 억제 활성 간의 상관관계에 대해서 과학적으로 검증할 필요성이 있다고 사료된다.
- 따라서 본 실험에 사용한 4가지 생강과 식물 추출물의 AChE 억제능은 총 폴리페놀 함량과 밀접한 관계가 있으며, curcumin 함량, 라디칼 소거능 및 GABA 함량과는 직접적인 상관관계가 없는 것으로 나타났다. 이상의 결과와 같이, 미얀마산 울금은 나머지 추출물과 비교하여 높은 항산화 활성과 curcumin 및 GABA 함량, 그리고 비교적 높은 AChE 저해활성을 갖는 강력한 인지능 개선 소재로 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
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