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문제 정의
- 12 그러나 이는 dufuor gland에서 발견된 것이며, 분비된 페로몬에서의 성분은 아직 확인되지 않았다. 따라서 본 연구에서는 HS-SPME GC/MS를 이용하여 분비된 페로몬의 구성성분에 대해서 밝히고자 한다.
- 따라서 개미의 의사소통에 대한 연구에는 적합하지 않다. 이 논문에서는 살아있는 생물의 분비물에 대해 분석이 가능한 HS-SPME GC/MS를 이용하여 개미가 분비하는 페로몬에 대한 연구를 진행하였다. 이 실험에서 사용하는 C.
제안 방법
- 16 먹이로는 1 M sucrose를 사용하였으며 10 µL를 넣은 바이알에 개미를 넣고 10 분간 방치한 후 새로운 바이알에 개미를 옮긴 뒤 분비된 페로몬을 HS-SPME GC/MS법으로 분석하였다.
- 2 이를 통해 확인한 결과 분비된 페로몬에서는 n-decane, n-undecane, n-tridecane 만이 검출됨을 확인하였고, 따라서 세 가지의 성분에 대하여 최적화를 수행하였다.
- GC/MS 자료의 수집과 처리에 Chemstation (Agilent technologies, DE, USA) 를 사용하였고, 또한 데이터를 통한 정량 및 mass spectrum의 확인에는 DataAnalysis 4.0 (Bruker daltonik GmbH, Bremen, Germany)을 사용하였다.
- HS-SPME GC/MS를 이용하여 살아있는 C. japonicus가 분비하는 페로몬을 분석하였고, 가장 최적화된 조건을 설정하였다. HS-SPME를 살아있는 시료에 적용할 경우, 각 시료의 생존이 가능한 범위 내에서 조건을 최적화해야 한다.
- 실제 살아있는 개미의 페로몬을 분석하기 전에 세 가지의 페로몬 표준물질(n-decane, n-undecane, ntridecane)에 대해 추출 조건을 최적화하는 실험을 하였다. SPME fiber의 종류(Fig. 3), 추출 시간(Fig. 4),탈착 시간(Fig. 5)에 대해 최적화를 실시하였다.
- 구체적인 GC/MS의 조건은 Table 1에 기록하였다. Solid phase-micro extraction은 GERSTELs Solid Phase Micro Extraction (GERSTEL Inc., 701 Digital drive, Suite J Linthicum, MD 21090, USA)를 사용하였다. 또한 SPME fiber polyacrylate (PA) 85 µm, polydimethylsiloxane(PDMS) 100 µm, carboxen/polydimethylsiloxane (CAR/PDMS) 75 µm, polydimethylsiloxane/divinylbenzene (PDMS/DVB) 65 µm, divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane (DVB/CAR/PDMS) 모두 Supelco (trademarks of Sigma-Aldrich, St.
- 개미의 학명은 Camponotus japonicus이며 이는 Biobiba Ant Kingdom(대구, 한국)에서 구매하였다. 개미를 바이알에 담았을 경우 바이알에 잔존하고 있는 휘발성 유기화합물을 제거하여 개미의 생존율을 높이기 위해서 압축공기발생기(OF302-25MD2, JUN-AIR,Benton harbor, MI, USA)를 이용하여 실제 공기와 유사한 상태를 만들어 주었다. 무게 범위 60 mg-80 mg의 개미를 포획하여 개미 개체군간의 차이를 최소화하였다.
- 두 번째로 추출 시간과 온도에 대해서 최적값을 설정하였다. 위와 동일한 혼합물을 사용하여 각각 15, 30 분, 1, 2, 3, 4, 5 시간으로 추출 시간을 설정한 뒤 가장 적합한 값을 정하였다.
- 3 시간을 최적화된 추출 시간으로 해서 실제 살아있는 개미를 대상으로 예비 실험 결과 밀폐된 바이알 안에 개미가 3 시간 이상 오래 방치 될 경우 죽거나 비활동적으로 변하는 경우가 많았다. 따라서 살아있는 시료를 대상으로 하는 본 실험의 특성상 최대 추출효율보다 추출하는 동안 개미를 생존시켜 다수의 개미를 실험하는 조건에 초점을 맞춰 시료 추출 시간을 30 분으로 줄여서 실시하였다.
- 또한 50 µg/L의 혼합 용액을 사용하여 질량 분석의 정밀도를 확인하였다.
- 또한 땅 속에서 안정감을 갖는 개미들을 위해 바이알에 알루미늄 호일(롯데알미늄㈜, 경기도, 한국)를 감싸 암실로 만들어 주었다. 또한 개미가 군집하여있을 때의 영향을 최소화 하기 위하여 실험하고자 하는 개미는 1 시간 전에 미리 포획하여 바이알에 한 마리씩 독립시켜 놓았다.
- 무게 범위 60 mg-80 mg의 개미를 포획하여 개미 개체군간의 차이를 최소화하였다. 또한 땅 속에서 안정감을 갖는 개미들을 위해 바이알에 알루미늄 호일(롯데알미늄㈜, 경기도, 한국)를 감싸 암실로 만들어 주었다. 또한 개미가 군집하여있을 때의 영향을 최소화 하기 위하여 실험하고자 하는 개미는 1 시간 전에 미리 포획하여 바이알에 한 마리씩 독립시켜 놓았다.
- 먹이 자극을 가한 후 검출된 페로몬의 3가지 성분을 크로마토그램을 바탕으로 하여 피크 넓이로 각각 정량하였다(n=20)(Fig. 7). n-Decane, n-undecane, n-tridecane 각각 약 0.
- japonicus worker 한 마리를 포획한 뒤 screw-type GC 바이알에 넣고 HS-SPME GC/MS로 상온에서 추출하여 분석하였으나, 이 때 분비된 페로몬의 양이 극미량이라서 검출되지 않았다. 살아있는 상태에서 개미가 방출하는 페로몬의 농도를 높여 정량 가능한 범위로 만들기 위해 한 개의 바이알에 포획한 개미 3마리를 넣고 실험을 진행하였다. 또한 페로몬의 분비를 유도하기 위한 자극으로 먹이를 사용하였다.
- 세 번째로 탈착 시간을 설정하였다. 위와 마찬가지 방법으로 하여 1, 5, 10, 20, 30 분으로 추출 시간을 설정한 뒤 가장 적합한 값을 정하였다.
- 실제 살아있는 개미의 페로몬을 분석하기 전에 세 가지의 페로몬 표준물질(n-decane, n-undecane, ntridecane)에 대해 추출 조건을 최적화하는 실험을 하였다. SPME fiber의 종류(Fig.
- 두 번째로 추출 시간과 온도에 대해서 최적값을 설정하였다. 위와 동일한 혼합물을 사용하여 각각 15, 30 분, 1, 2, 3, 4, 5 시간으로 추출 시간을 설정한 뒤 가장 적합한 값을 정하였다. 추출 시간 설정 시 PDMS/DVB fiber를 사용하였고 온도는 25 ℃, 탈착 시간은 10 분으로 일정하게 맞추었다.
- 세 번째로 탈착 시간을 설정하였다. 위와 마찬가지 방법으로 하여 1, 5, 10, 20, 30 분으로 추출 시간을 설정한 뒤 가장 적합한 값을 정하였다. 이 때 fiber는 PDMS/DVB를 사용하였고 추출 시간은 30 분, 온도는 25 로 일정하게 하였다.
- 첫 번째로 5가지 종류의 coated fiber중 우리 실험 target 물질의 검출에 가장 적합한 fiber를 찾기 위해 10 mg/L까지는 아세톤으로 희석하고 다음 단계부터는 HPLC grade water로 희석한 400 µg/L 혼합 용액(decane, undecane, tridecane, C. japonicus 페로몬 주성분 3가지) 을 분석하여 각 fiber 별로 흡착비율을 확인하였다.
- 첫째로, 위에서 최적화된 SPME 법과 GC/MS 조건을 사용하여 50, 25, 12.5, 5, 2.5, 1.25, 0.5 µg/L의 표준물질 혼합용액(주성분인 n-decane, n-undecane, ntridecane의 혼합물)을 측정하고 직선성과 검출한계, 정량한계를 확인하였다.
- 최적화에 앞서 개미의 페로몬 분비를 유도한 뒤 HS-SPME GC/MS로 검출한 뒤 GC/MS에서 성분의 규명에 쓰이는 NIST database를 활용하여 target 물질을 정하였다.2 이를 통해 확인한 결과 분비된 페로몬에서는 n-decane, n-undecane, n-tridecane 만이 검출됨을 확인하였고, 따라서 세 가지의 성분에 대하여 최적화를 수행하였다.
대상 데이터
- Decane (≥99.8%, analytical grade)과 tridecane (≥99.5%, analytical grade), 그리고 먹이로 사용된 sucrose (reagent grade)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구매하였다.
- GC-MS는 Agilent 7890A GC system과 연동된 5975C triple axis detector를 장착한 inert XL mass spectrometer(Agilent technologies, DE, USA)를 사용하였다. 구체적인 GC/MS의 조건은 Table 1에 기록하였다.
- Baker (NJ, USA)에서, Water (HPLC grade)는 덕산약품(경기도, 한국)에서 구매하였다. GC/MS 시료를 담는 screw-top 20 mL 바이알 capped with PTFE/silicone septa는 Agilent Technologies에서 구매하여 사용하였다.
- Undecane (≥99.5%, analytical grade)는 Tokyo Chemical Industry (Kita-ku, Tokyo, Japan)에서 구매하였다.
- 개미의 학명은 Camponotus japonicus이며 이는 Biobiba Ant Kingdom(대구, 한국)에서 구매하였다. 개미를 바이알에 담았을 경우 바이알에 잔존하고 있는 휘발성 유기화합물을 제거하여 개미의 생존율을 높이기 위해서 압축공기발생기(OF302-25MD2, JUN-AIR,Benton harbor, MI, USA)를 이용하여 실제 공기와 유사한 상태를 만들어 주었다.
- 또한 SPME fiber polyacrylate (PA) 85 µm, polydimethylsiloxane(PDMS) 100 µm, carboxen/polydimethylsiloxane (CAR/PDMS) 75 µm, polydimethylsiloxane/divinylbenzene (PDMS/DVB) 65 µm, divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane (DVB/CAR/PDMS) 모두 Supelco (trademarks of Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)에서 구매하였다.
- 5%, analytical grade)는 Tokyo Chemical Industry (Kita-ku, Tokyo, Japan)에서 구매하였다. 표준품 희석액을 만들 때 사용된 acetone (HPLC grade)은 J.T. Baker (NJ, USA)에서, Water (HPLC grade)는 덕산약품(경기도, 한국)에서 구매하였다. GC/MS 시료를 담는 screw-top 20 mL 바이알 capped with PTFE/silicone septa는 Agilent Technologies에서 구매하여 사용하였다.
성능/효과
- C. japonicus worker 한 마리를 포획한 뒤 screw-type GC 바이알에 넣고 HS-SPME GC/MS로 상온에서 추출하여 분석하였으나, 이 때 분비된 페로몬의 양이 극미량이라서 검출되지 않았다. 살아있는 상태에서 개미가 방출하는 페로몬의 농도를 높여 정량 가능한 범위로 만들기 위해 한 개의 바이알에 포획한 개미 3마리를 넣고 실험을 진행하였다.
- n-Decane, n-undecane, n-tridecane 세 가지 물질 모두 65 µm PDMS/DVB 가 다른 fiber에 비해 흡착량과 정밀도가 월등히 높게 나타났다.
- n-Decane, n-undecane의 경우 검출되지 않은 개체는 없었다. 개미가 분비하는 페로몬의 표준 편차가 n-decane, n-undecane, n-tridecane 각각 약 0.015, 0.018, 0.009로 재현성이 뛰어나게 좋다고는 할 수 없었으나, 자극을 가했을 경우 모든 개체에서 이들 성분이 검출되었다는 점은 확인할 수 있었다.
- HS-SPME에 있어 또 한 가지 중요한 점은 시료 전처리 과정에서 용매를 거의 쓸 필요가 없지만 표준품을 희석할 때 쓰는 희석용매가 목적성분보다 휘발성이 크면서 해당 fiber에 흡착이 잘될 경우 목적성분의 검출을 크게 방해하게 된다. 따라서 우리는 물에 잘 녹지 않는 탄화수소류를 우선 아세톤으로 10 mg/L까지 희석시킨 후 그 뒤 농도는 모두 물로 희석하여 제조함으로써 재현성과 민감성을 높였다.
- 구체적인 직선성 시험과 검량선의 확인 결과를 Table 2에 제시하였다. 또한 질량 스펙트럼의 확인을 통해서 질량 정밀도를 확인하여, n-decane, n-undecane, n-tridecane의 [M]+가 각각 142, 156,184로 계속 동일하게 나타남을 확인하였다(Fig. 6)
- 개미를 바이알에 담았을 경우 바이알에 잔존하고 있는 휘발성 유기화합물을 제거하여 개미의 생존율을 높이기 위해서 압축공기발생기(OF302-25MD2, JUN-AIR,Benton harbor, MI, USA)를 이용하여 실제 공기와 유사한 상태를 만들어 주었다. 무게 범위 60 mg-80 mg의 개미를 포획하여 개미 개체군간의 차이를 최소화하였다. 또한 땅 속에서 안정감을 갖는 개미들을 위해 바이알에 알루미늄 호일(롯데알미늄㈜, 경기도, 한국)를 감싸 암실로 만들어 주었다.
- SPME의 추출 능력은 시료의 headspace가 평형 상태일 때 가장 높으며 코팅 두께가 두꺼울 수록 시료 흡착 시간이 더 오래 걸리고 분석 효율이 떨어진다. 본 실험에서는 탄화수소류 물질을 목적성분으로 했으며 탄화수소를 HS-SPME로 추출할 경우에는 PDMS/DVB fiber가 가장 추출 효율이 좋은 것으로 나타났다. HS-SPME에 있어 또 한 가지 중요한 점은 시료 전처리 과정에서 용매를 거의 쓸 필요가 없지만 표준품을 희석할 때 쓰는 희석용매가 목적성분보다 휘발성이 크면서 해당 fiber에 흡착이 잘될 경우 목적성분의 검출을 크게 방해하게 된다.
- 추출 시간의 경우 n-decane과 n-undecane은 3 시간으로 하였을 때 피크 면적이 가장 넓었고 n-tridecane은 extraction time이 증가할수록 추출효율이 증가하였다. 3 시간을 최적화된 추출 시간으로 해서 실제 살아있는 개미를 대상으로 예비 실험 결과 밀폐된 바이알 안에 개미가 3 시간 이상 오래 방치 될 경우 죽거나 비활동적으로 변하는 경우가 많았다.
- 탈착 시간은 1, 5 분에서 증가하여 10 분 이후에서 비교적 일정한 피크면적이 나타나고 재현성도 우수했다. 본 실험에서 탈착 시간은 10 분으로 하였다.
- 피크 면적으로 흡착비율을 평가해 볼 때 n-undecane에 대한 50/30 µm DVB/CAR/PDMS, 100 µm PDMS, 75 µm CAR/PDMS,85 µm polyacrylate의 흡착비율은 65 µm PDMS/DVB에 비해 각각 82, 47, 37, 5%로 떨어졌다.
후속연구
- 현상이 일어나는 그 순간을 관찰한다는 의미에서, 본 실험에서 최적화한 HS-SPME GC/MS 분석방법은 현상 전후에 있을 수 있는 미지의 변수를 배제하는 좋은 방법이다. 그러나 현상 그 자체의 관찰에는 적합하나, 다만 그 현상을 보여주는 비휘발성 화합물은 검출하지 못한다는 한계점이 있다. 한마디로 VOC만을 관찰할 수 있기에 target 물질의 다양성은 떨어지는 편이다.
- 첫째로, 시료를 손실시키지 않고 다시 활용할 수 있으며, 시료가 살아있는 동안에만 발견할 수 있는 현상에 대한 연구를 진행할 수 있다는 장점을 갖고 있다. 둘째로, 유기용매를 전혀 사용하지 않기 때문에 연구 진행의 안정성과 환경친화적인 연구가 가능하다는 장점을 갖고 있다. 따라서 연구원들의 건강에 해를 끼치지 않는 연구가 다양하게 진행되고 있다.
- 한마디로 VOC만을 관찰할 수 있기에 target 물질의 다양성은 떨어지는 편이다. 따라서 독성이 없고, 기화 상태에서 유도체화 할 수 있는 물질이 개발된다면 그 현상을 연구케 해주는 물질을 발견하는데 있어 더욱 다양한 target을 바탕으로 살아있는 생물에 대한 연구가 더욱 수월해질 것이다.
- 살아 있는 시료에 대한 HS-SPME 법은 다양한 장점을 가지고 있다. 첫째로, 시료를 손실시키지 않고 다시 활용할 수 있으며, 시료가 살아있는 동안에만 발견할 수 있는 현상에 대한 연구를 진행할 수 있다는 장점을 갖고 있다. 둘째로, 유기용매를 전혀 사용하지 않기 때문에 연구 진행의 안정성과 환경친화적인 연구가 가능하다는 장점을 갖고 있다.
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