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문제 정의
- 한편, 갱년기 장애를 유도하였을 때 나타나는 estrogen 분비 감소로 인한 심혈관계 질환 발병 위험률에 대한 갈조류인 대황의 영향은 연구된 바가 없다. 따라서 본 연구에서는 실험동물로써 흰쥐를 이용하여 인위적으로 난소를 절제하여 갱년기 장애를 유도한 후, 대황 추출물에 의한 혈 중 지질 함량 변화에 대한 효과를 검토하고자 하였다. 또한 동물실험에 이용하기 위한 추출물 제조 방법으로는 열수와 에탄올을 이용하는 것이 일반적이므로, 이러한 추출 방법으로 추출물을 제조한 후 항산화 활성을 측정하여 활성이 우수한 추출물을 본 실험에 이용하고자 하였다.
- 따라서 본 연구에서는 실험동물로써 흰쥐를 이용하여 인위적으로 난소를 절제하여 갱년기 장애를 유도한 후, 대황 추출물에 의한 혈 중 지질 함량 변화에 대한 효과를 검토하고자 하였다. 또한 동물실험에 이용하기 위한 추출물 제조 방법으로는 열수와 에탄올을 이용하는 것이 일반적이므로, 이러한 추출 방법으로 추출물을 제조한 후 항산화 활성을 측정하여 활성이 우수한 추출물을 본 실험에 이용하고자 하였다.
가설 설정
- 3)Initial slope is ohm change for the first on minute.
제안 방법
- 1주일 동안 주위환경에 적응시켜 체중에 따라 난괴법에 의해 군을 나누어 난소절제 수술을 실시하였다. 수술은 에테르로 마취하여 심마취기에 이르면 복부를 절개하여 난소를 제거하고 절개부는 봉합하였다.
- Washed platelet는 suspending buffer로 희석하여 혈소판 수가 5×108/ml이 되도록 하였고, 응집유도제로 collagen을 2.5 μl 가하여 5분간 반응시켜, Whole blood lumi-aggregometer (Chrono-log, U.S.A)를 사용하여 37℃에서 혈소판 응집을 측정하였다.
- 본 실험에서 사용한 대황(Eisenia bicyclis)은 2010년 4월 울릉도 해안일대에서 채취된 것을 울릉도몰에서 구입하여 물로 7～8회 씻어 염분과 불순물을 제거하고 동결 건조, 분쇄하여 실험에 사용하였다. 건조된 대황은 추출방법에 따른 최적 추출조건을 선정하기 위해 각 건조된 시료 100 g을 80% 에탄올로 80℃에서 추출하였고, 동량의 증류수로 같은 방법으로 추출하였다(Table 1). 위의 과정을 2회 반복하여 얻은 추출물을 감압 하에 건조하여, 각각의 폴리페놀 함량 및 DPPH radical scavenging 활성을 측정하였고, 동물실험은 체중 kg 당 투여량 1 ml 중 에탄올 추출물을 50 mg 및 200 mg 되도록 용해하여 사용하였다.
- 혈청 중 중성지방, 총 콜레스테롤, HDL-콜레스테롤 농도는 자동 측정용 slide (FUJI FILM, JAPAN)를 이용하여 Dry chemistry analyzer 3500i (Fuji, Japan)로 400~600 nm 파장에서 측정하였다. 고밀도 지단백(HDL-cholesterol)의 경우 침전제를 이용하여 유미지립(chylomicron), 저밀도 지단백(low density lipoprotein, LDL) 및 초저밀도 지단백(very low density lipoprotein, VLDL)을 침전시킨 후 상층액에 있는 HDL콜레스테롤을 측정하였다. LDL-콜레스테롤은 Friedewald 공식에 의해 산출하였다.
- 실온에서 30분을 방치한 후 540 nm에서 microplate reader로 흡광도를 측정하여 DPPH의 환원에 의한 흡광도를 조사하였다. 대조군은 기존의 항산화제인 L-ascorbic acid와 비교 하였다. 시료 첨가구와 대조군의 흡광도차를 백분율로 표시하였다.
- 대황 추출물이 난소를 절제한 흰 쥐의 항 혈전능에 미치는 영향을 검토하기 위해 난소절제로 인하여 혈 중 지질 함량이 증가한 상태에서 washed platelet을 분리하고 콜라겐 2 μg으로 혈소판 응집을 유도하였다.
- 동물실험실의 사육조건은 온도 24±2℃, 습도 50-55%를 유지시켰고, 물과 식이는 제한을 두지 않고 제공하였으며, 실험 시료는 증류수로 용해하거나 현탁시켜 대조군은 동일 용량의 증류수를 투여하였다.
- 수술 후 일주일간 일반 식이로 상처를 회복시킨 후 각 추출물 시료를 증류수에 용해하여 경구 투여하였다. 또한 대조군 설정을 위하여 비 난소절제군은 복막 절개까지 난소절제 수술과 같은 방법으로 시행하고, 양측의 난소를 노출 하였다가 절제하지 않고 복막 속으로 다시 넣어 난소절제와 같은 스트레스를 주고 다시 봉합하는 모의수술(sham operation)을 시행하여, 이들을 대조군으로 사용하였다.
- 수술은 에테르로 마취하여 심마취기에 이르면 복부를 절개하여 난소를 제거하고 절개부는 봉합하였다. 수술 후 일주일간 일반 식이로 상처를 회복시킨 후 각 추출물 시료를 증류수에 용해하여 경구 투여하였다. 또한 대조군 설정을 위하여 비 난소절제군은 복막 절개까지 난소절제 수술과 같은 방법으로 시행하고, 양측의 난소를 노출 하였다가 절제하지 않고 복막 속으로 다시 넣어 난소절제와 같은 스트레스를 주고 다시 봉합하는 모의수술(sham operation)을 시행하여, 이들을 대조군으로 사용하였다.
- 1주일 동안 주위환경에 적응시켜 체중에 따라 난괴법에 의해 군을 나누어 난소절제 수술을 실시하였다. 수술은 에테르로 마취하여 심마취기에 이르면 복부를 절개하여 난소를 제거하고 절개부는 봉합하였다. 수술 후 일주일간 일반 식이로 상처를 회복시킨 후 각 추출물 시료를 증류수에 용해하여 경구 투여하였다.
- 실험동물은 체중이 200-205 g인 7주령의 암컷(SpragueDawley) 쥐 40마리를 (주)오리엔트바이오에서 분양 받아 1주일간 적응시킨 후, 난소절제 수술(ovariectomy)을 하였고 비 난소절제 대조군에게는 sham-operation을 실시하였다. 수술후 1주일간 고형 사료를 주어 상처가 회복되면, 난괴법(randomized complete block design)에 의해 군을 나누었다. 즉 실험동물은 비 난소절제 대조군(SHAM), 난소절제 대조군(OVX-CON), 난소절제 후 대황 추출물 50 mg/kg 투여군(OVX-EB50), 난소절제 후 대황 추출물 200 mg/kg 투여군(OVX-EB200)으로 각 10마리씩 4군으로 나누어 1 ml의 시료를 매일 경구 투여하며, 6주간 사육하였다.
- 또한 control에는 추출물 대신에 MeOH 100 μl를 seeding한 다음 DPPH 100 μl를 첨가하고 blank에는 DPPH 대신에 EtOH 100 μl를 첨가하였다. 실온에서 30분을 방치한 후 540 nm에서 microplate reader로 흡광도를 측정하여 DPPH의 환원에 의한 흡광도를 조사하였다. 대조군은 기존의 항산화제인 L-ascorbic acid와 비교 하였다.
- 즉 실험동물은 비 난소절제 대조군(SHAM), 난소절제 대조군(OVX-CON), 난소절제 후 대황 추출물 50 mg/kg 투여군(OVX-EB50), 난소절제 후 대황 추출물 200 mg/kg 투여군(OVX-EB200)으로 각 10마리씩 4군으로 나누어 1 ml의 시료를 매일 경구 투여하며, 6주간 사육하였다. 실험기간 동안 식이 섭취량과 체중은 매일 일정한 시간에 측정하였다. 동물실험실의 사육조건은 온도 24±2℃, 습도 50-55%를 유지시켰고, 물과 식이는 제한을 두지 않고 제공하였으며, 실험 시료는 증류수로 용해하거나 현탁시켜 대조군은 동일 용량의 증류수를 투여하였다.
- 건조된 대황은 추출방법에 따른 최적 추출조건을 선정하기 위해 각 건조된 시료 100 g을 80% 에탄올로 80℃에서 추출하였고, 동량의 증류수로 같은 방법으로 추출하였다(Table 1). 위의 과정을 2회 반복하여 얻은 추출물을 감압 하에 건조하여, 각각의 폴리페놀 함량 및 DPPH radical scavenging 활성을 측정하였고, 동물실험은 체중 kg 당 투여량 1 ml 중 에탄올 추출물을 50 mg 및 200 mg 되도록 용해하여 사용하였다.
- 수술후 1주일간 고형 사료를 주어 상처가 회복되면, 난괴법(randomized complete block design)에 의해 군을 나누었다. 즉 실험동물은 비 난소절제 대조군(SHAM), 난소절제 대조군(OVX-CON), 난소절제 후 대황 추출물 50 mg/kg 투여군(OVX-EB50), 난소절제 후 대황 추출물 200 mg/kg 투여군(OVX-EB200)으로 각 10마리씩 4군으로 나누어 1 ml의 시료를 매일 경구 투여하며, 6주간 사육하였다. 실험기간 동안 식이 섭취량과 체중은 매일 일정한 시간에 측정하였다.
- 추출물의 시료를 제조한 후에 96-well plate에 실험군과 blank에 추출물을 농도별(500, 100, 50, 25, 10 μg/ml)로 100μl씩 각각 6개씩 seeding한 다음 실험군에는 60 μM DPPH 100 μl를 첨가하였다.
- 폴리페놀성 물질은 활성 프리라디칼(reactive free radical)에 수소원자를 제공하여 안정한 비라디칼(non-radical)을 만들어 줌으로써 항산화효과를 나타내며, 해조류 중의 polyphenol성 물질은 에스트로겐의 활성이 있는 것으로 보고된 바 있다[16,22]. 폴리페놀 함량이 높은 추출 방법을 이용하는 것이 에스트로겐의 활성이 높을 것으로 예상되어 용매에 따른 폴리페놀 함량을 측정하였다(Table 2). 그 결과 대황의 열수 추출물보다 에탄올 추출물에서 총 폴리페놀 함량이 높은 것으로 나타났다.
- 혈류 측정은 전혈을 사용 하였고, 채취한 혈액을 헤파린 처리된 튜브를 사용하여 응고를 방지한 후, Micro Channel Array Flow Analyzer KH-6 (MC Lab, Japan)을 이용하여 채취한 혈액 100 μl를 주입하여 측정하였다.
- 혈액은 실험동물을 해부 전 24시간 절식시킨 후 에테르 마취 하에 개복한 후 복대동맥에서 채취하여 혈류 측정을 위해 헤파린 처리된 튜브를 사용하고, 혈액응고 실험을 위해 3.2% sodium citrate를 1:9의 비율로 혼합하여 분석에 사용하였다. 또한 혈액의 생화학적 분석을 위해 상온에서 30분간 방치 한후, 3,000 rpm에서 10분간 원심 분리하여 혈청을 분리하여 사용하였다.
- 혈액의 유동성에 미치는 대황 추출물의 영향을 검토하기 위해 SHAM, OVXCON, OVX-EB50, OVX-EB200군의 혈액을 각각 채취하여 항응고제인 헤파린 처리 후, 일정한 압력으로 인해 혈액이 모세관을 25, 50, 75, 100 μl 통과하f는 시간을 Micro channel array flow analyzer (MC-FAN)를 이용하여 측정하였다.
- 혈청 중 중성지방, 총 콜레스테롤, HDL-콜레스테롤 농도는 자동 측정용 slide (FUJI FILM, JAPAN)를 이용하여 Dry chemistry analyzer 3500i (Fuji, Japan)로 400~600 nm 파장에서 측정하였다. 고밀도 지단백(HDL-cholesterol)의 경우 침전제를 이용하여 유미지립(chylomicron), 저밀도 지단백(low density lipoprotein, LDL) 및 초저밀도 지단백(very low density lipoprotein, VLDL)을 침전시킨 후 상층액에 있는 HDL콜레스테롤을 측정하였다.
대상 데이터
- 2% 보다 낮은 활성을 나타내고 있으나, 단일 물질이 아닌 ethanol 추출물임을 감안한다면 대황 에탄올 추출물의 항산화 활성은 매우 유용한 것으로 판단된다. 따라서, 총 폴리 페놀 함량이 높을 뿐만 아니라 항산화 활성도 더 높은 대황에탄올 추출물을 동물 실험에 사용하였다.
- 본 실험에서 사용한 대황(Eisenia bicyclis)은 2010년 4월 울릉도 해안일대에서 채취된 것을 울릉도몰에서 구입하여 물로 7～8회 씻어 염분과 불순물을 제거하고 동결 건조, 분쇄하여 실험에 사용하였다. 건조된 대황은 추출방법에 따른 최적 추출조건을 선정하기 위해 각 건조된 시료 100 g을 80% 에탄올로 80℃에서 추출하였고, 동량의 증류수로 같은 방법으로 추출하였다(Table 1).
- 실험동물은 체중이 200-205 g인 7주령의 암컷(SpragueDawley) 쥐 40마리를 (주)오리엔트바이오에서 분양 받아 1주일간 적응시킨 후, 난소절제 수술(ovariectomy)을 하였고 비 난소절제 대조군에게는 sham-operation을 실시하였다. 수술후 1주일간 고형 사료를 주어 상처가 회복되면, 난괴법(randomized complete block design)에 의해 군을 나누었다.
데이터처리
- 연구결과 얻어진 자료를 SPSS (statistical package for social science, version 12.0) 통계 프로그램을 사용하여 하위그룹 각각의 기술 통계치(mean, SD)를 산출하였다. 사후검증은 Tukey 방법을 적용하였다.
이론/모형
- 고밀도 지단백(HDL-cholesterol)의 경우 침전제를 이용하여 유미지립(chylomicron), 저밀도 지단백(low density lipoprotein, LDL) 및 초저밀도 지단백(very low density lipoprotein, VLDL)을 침전시킨 후 상층액에 있는 HDL콜레스테롤을 측정하였다. LDL-콜레스테롤은 Friedewald 공식에 의해 산출하였다. 또한 심혈관질환의 위험도 판정에 이용되는 동맥경화지수(atherogenic index)와 심혈관위험지수 (cardiac risk factor)는 다음 공식을 이용하였다.
- LDL-콜레스테롤은 Friedewald 공식에 의해 산출하였다. 또한 심혈관질환의 위험도 판정에 이용되는 동맥경화지수(atherogenic index)와 심혈관위험지수 (cardiac risk factor)는 다음 공식을 이용하였다.
- 0) 통계 프로그램을 사용하여 하위그룹 각각의 기술 통계치(mean, SD)를 산출하였다. 사후검증은 Tukey 방법을 적용하였다. 유의수준은 p<0.
- 총 페놀함량은 Folin-Denis법(1)으로 측정하였다. 시료 1 ml 에 95% 에탄올 1 ml, 정제수 5 ml 및 50% Folin-Ciocalteu reagent (Sigma) 0.
성능/효과
- 2)The results are mean±SD for 10 rats in each group.
- 총 콜레스테롤과 HDL-콜레스테롤의 수치로 계산한 동맥경화지수(AI) 와 심혈관위험지수(CRF)는 일반적으로 동맥경화 및 순환기계 질환의 발병의 위험도를 알리는 위험지수로서 널리 이용되고 있다[28]. AI와 CRF는 난소를 절제한 OVX-CON군이 난소를 절제하지 않은 SHAM군 보다 유의적으로 증가하는 결과가나타났으나, 대황 추출물의 투여에 의해 유의적으로 감소하였다. 따라서 이상과 같이 대황 추출물이 혈중 LDL-콜레스테롤 및 동맥경화 및 심혈관 위험 지수인 AI와 CRF의 감소시키는 결과로부터 심혈관 질환의 위험율을 저하시킬 수 있는 소재가될 것으로 기대가 되나, 앞으로 구체적인 투여량의 범위 및 조절 등의 구체적인 연구가 요구된다.
- Ascorbic acid를 positive control 로 하여 100 μg/ml 농도에서 대황 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성을 측정한 결과, 열수 추출물의 32.5%에 비해 에탄올 추출물에서 55.9%의 높은 활성이 나타났다.
- 대황 추출물 투여군의 경우 체중 kg 당 50 mg/day 투여한 OVX-EB50군에서 OVX-CON군과 비교하여 유의적으로 증가 하는 결과를 나타내었다(Table 4). LDL-콜레스테롤 함량은 난소절제로 인해 OVX-CON군이 SHAM군에 비해 증가되었으나, 대황 추출물의 투여로 인해 OVX-ES200군에서 유의적으로 감소하였다. 이는 대황 추출물이 에스트로겐 유사활성을 나타내어 혈 중 지질함량을 개선하는 것으로 사료된다.
- 대황 추출물이 난소를 절제한 흰 쥐의 항 혈전능에 미치는 영향을 검토하기 위해 난소절제로 인하여 혈 중 지질 함량이 증가한 상태에서 washed platelet을 분리하고 콜라겐 2 μg으로 혈소판 응집을 유도하였다. 그 결과 대황 추출물을 투여한 군이 OVX-CON군에 비해 혈소판 응집을 억제하는 것으로 나타났다(Table 5). Amplitude (%) 는 각 실험동물의 혈액에서 정제된 혈소판만을 분리하여 여기에 콜라겐 2 μg/ml을 넣었을 때 일어나는 최대 응집 정도를 나타내는 것으로, 난소절제를 한 OVX-CON군이 난소절제를 하지 않은 SHAM군과 비교하여 증가하였으나, 대황 추출물 투여군인 OVX-EB50 및 OVX-EB200군 모두에서 감소하는 경향을 나타내었다.
- 폴리페놀 함량이 높은 추출 방법을 이용하는 것이 에스트로겐의 활성이 높을 것으로 예상되어 용매에 따른 폴리페놀 함량을 측정하였다(Table 2). 그 결과 대황의 열수 추출물보다 에탄올 추출물에서 총 폴리페놀 함량이 높은 것으로 나타났다.
- Slop (Ω/min)은 응집 유도물질인 콜라겐을 넣은 직후부터 1분 동안의 응집곡선의 기울기를 말하며 혈소판의 콜라겐에 대한 민감성을 나타내는 것으로써, 응집의 진행과 함께 혈소판이 platinum electrodes에 부착됨으로써 발생하는 전기저항(impedance:Ω)의 크기를 혈소판 응집치로 나타낸다. 난소절제로 인해 OVX-CON군이 비 난소절제군인 SHAM군과 비교하여 Slop이 증가하여 혈소판 응집이 촉진되 었으나, 대황 추출물 투여에 의해 감소하였고 특히 OVX-EB50군에서 유의적으로 감소하여 혈소판 응집이 억제되었다. 응집 시간을 나타내는 lag time (sec)은 난소절제에 의해 반응이 일어나는 시간이 짧아져, 혈소판 응집이 촉진되는 결과가 나타났다.
- 9%의 높은 활성이 나타났다. 대조군인 ascorbic acid 의 80.2% 보다 낮은 활성을 나타내고 있으나, 단일 물질이 아닌 ethanol 추출물임을 감안한다면 대황 에탄올 추출물의 항산화 활성은 매우 유용한 것으로 판단된다. 따라서, 총 폴리 페놀 함량이 높을 뿐만 아니라 항산화 활성도 더 높은 대황에탄올 추출물을 동물 실험에 사용하였다.
- 초기의 25 μl 주입 시 각 군간의 별다른 차이를 보이지 않았으나, 50 μl을 주입하였을 경우 SHAM군이 OVX-CON군에 비해 빠른 시간에 모세관을 통과 하였고 주입량이 증가할수록 모세관 통과 시간은 차이가 났다. 대황 추출물 투여군의 경우 OVX-CON군보다 빠른 시간에 통과하였고 SHAM군과 비슷한 혈액 유동성을 나타내어 대황 추출물이 혈류 개선에도 효과가 있을 것으로 사료된다.
- 난소절제로 인해 OVX-CON군이 비 난소절제군인 SHAM군과 비교하여 Slop이 증가하여 혈소판 응집이 촉진되 었으나, 대황 추출물 투여에 의해 감소하였고 특히 OVX-EB50군에서 유의적으로 감소하여 혈소판 응집이 억제되었다. 응집 시간을 나타내는 lag time (sec)은 난소절제에 의해 반응이 일어나는 시간이 짧아져, 혈소판 응집이 촉진되는 결과가 나타났다. 이에 반해 대황 추출물 투여군인 OVX-EB50 및 OVX-EB200군에서 응집시간이 지연되었으며, 특히 OVX-EB200군의 경우 정상군인 SHAM군과 같은 응집지연 효과를 보였다.
- 응집 시간을 나타내는 lag time (sec)은 난소절제에 의해 반응이 일어나는 시간이 짧아져, 혈소판 응집이 촉진되는 결과가 나타났다. 이에 반해 대황 추출물 투여군인 OVX-EB50 및 OVX-EB200군에서 응집시간이 지연되었으며, 특히 OVX-EB200군의 경우 정상군인 SHAM군과 같은 응집지연 효과를 보였다. 이상의 결과로부터 대황 추출물이 난소절제로 인한 혈소판 응집 억제 효과를 나타내어 혈관 관련성 질환에 효과가 있을 것으로 기대된다.
- 한편, 혈청 중의 중성 지질 함량 또한 난소절제에 의해 증가하였으나 난소 절제 후 대황 추출물 투여로 감소하였다. 특히 체중 kg 당 200 mg/day 투여한 OVX-EB200군에서는 OVX-CON군에 비해 유의적으로 감소하는 결과를 나타내었다.
- 혈청 중의 HDL-콜레스테롤의 농도는 난소절제로 인해 OVX-CON군이 SHAM군에 비해 증가하는 결과를 나타내었다. 대황 추출물 투여군의 경우 체중 kg 당 50 mg/day 투여한 OVX-EB50군에서 OVX-CON군과 비교하여 유의적으로 증가 하는 결과를 나타내었다(Table 4).
후속연구
- AI와 CRF는 난소를 절제한 OVX-CON군이 난소를 절제하지 않은 SHAM군 보다 유의적으로 증가하는 결과가나타났으나, 대황 추출물의 투여에 의해 유의적으로 감소하였다. 따라서 이상과 같이 대황 추출물이 혈중 LDL-콜레스테롤 및 동맥경화 및 심혈관 위험 지수인 AI와 CRF의 감소시키는 결과로부터 심혈관 질환의 위험율을 저하시킬 수 있는 소재가될 것으로 기대가 되나, 앞으로 구체적인 투여량의 범위 및 조절 등의 구체적인 연구가 요구된다.
- 이에 반해 대황 추출물 투여군인 OVX-EB50 및 OVX-EB200군에서 응집시간이 지연되었으며, 특히 OVX-EB200군의 경우 정상군인 SHAM군과 같은 응집지연 효과를 보였다. 이상의 결과로부터 대황 추출물이 난소절제로 인한 혈소판 응집 억제 효과를 나타내어 혈관 관련성 질환에 효과가 있을 것으로 기대된다.
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