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문제 정의
- 본 연구에서는 우엉 뿌리의 생리활성 탐색을 위해 methanol 추출물과 용매별 분획물을 대상으로 polyphenol과 flavonoid 함량, DPPH radical 소거능과 tyrosinase 저해활성을 측정하였다. 활성 성분의 함량이나 활성 실험의 결과에서 우엉 추출물의 ethylacetate 분획물이 가장 우수한 것으로 나타났으며, n-butanol 분획물이 다음으로 높은 수준을 보여주었다.
- 이에 본 연구에서는 아직까지 보고된 바 없는 우엉의 미백 기능성과 관련된 활성이나 성분에 대한 연구를 위해 그동안 주로 식용으로 이용되어 왔던 우엉 뿌리의 methanol 추출물과 용매분획별 시료를 대상으로 실험을 진행하였다. 활성에 대한 연구로서 항산화활성과 피부 미백관련 기능성으로 tyrosinase 저해 활성을 조사하였으며, 활성 성분에 대한 정성 분석과 정량적 비교를 통한 활성과의 연관 관계 파악을 위해 액체크로마토그래피-질량분석기(LC-MS/MS)를 이용한 분석을 실시하였다.
가설 설정
- 3)Values are mean±SD (n=3) without relative activity.
제안 방법
- DPPH Radical 소거능 측정 −우엉 뿌리 추출물 및 분획물 시료의 항산화활성을 비교하기 위해 DPPH를 사용하여 radical 소거능을 측정하였다.
- Flavonoid 함량 측정 −페놀성 화합물중 특히 여러 가지 기능성을 나타내는 것으로 알려진 flavonoid 함량을 알아보기 위해 Moreno 등의 방법을 변형하여 다음과 같이 측정하였다.
- LC-MS/MS를 활용한 Phenolic Compound 분석 −우엉 뿌리에 존재하는 주요 활성 성분에 대한 분석을 위해 (-)ESI 장치가 부착된 LC-MS/MS 분석을 실시하여 얻어진 chromatogram을 Fig. 1에 제시하였다.
- LC-MS/MS를 활용한 phenolic compound 분석 −우엉의 뿌리 부위에서 발견될 수 있는 활성 성분들의 분석을 위해 negative electrospray ionization((-) ESI) mode로 설정된 LC-MS/MS를 활용하였다.
- Nebulizer 압력, N2 gas 유속 및 온도는 각각 35 psi, 10 l/min, 320°C로 설정하였으며, capillary voltage는 4 kV를 유지하였다.
- 시료 주입량은 10 μl로 하였으며, 각 성분별로 Table I과 같은 multiple reaction monitoring(MRM) 조건에서 분석을 실시 하였다.
- Nebulizer 압력, N2 gas 유속 및 온도는 각각 35 psi, 10 l/min, 320°C로 설정하였으며, capillary voltage는 4 kV를 유지하였다. 이동상으로서 A 용액은 5 mM ammonium acetate가 혼합된 0.1% formic acid 수용액이었고 B 용액은 0.1% formic acid가 함유된 acetonitrile을 사용하였으며, 0.5 ml/min의 유속으로 20% B로 시작하여 15분까지 순차적으로 100% B로 올려준 후 다시 20% B로 낮춰서 총 30분 동안 분석을 실시하였다. 시료 주입량은 10 μl로 하였으며, 각 성분별로 Table I과 같은 multiple reaction monitoring(MRM) 조건에서 분석을 실시 하였다.
- 추출 및 분획 −동결건조한 우엉 뿌리 시료 130 g을 blender를 사용하여 마쇄한 후 99.4% methanol을 추출 용매로 하여 상온에서 24시간 3회 반복하여 추출을 실시하였다.
- 4% methanol을 추출 용매로 하여 상온에서 24시간 3회 반복하여 추출을 실시하였다. 추출액은 여과와 농축 및 동결건조를 실시하여 추출물 48.2 g을 획득하였으며, 이중 20 g을 증류수에 분산시킨 후 n-hexane, ethylacetate, n-butanol을 사용하여 순차적으로 용매 분획을 실시하였다. 분획된 시료는 여과와 농축 및 동결건조 후 추출물과 함께 4oC 이하로 냉장보관하면서 실험에 사용하였으며, 최종 분획수율은 n-hexane, ethylacetate, n-butanol 및 aqueous 분획이 각각 1.
- 1~10 mg/ml의 다양한 농도로 용해시킨 시료액 20 μl와 200 μM로 용해시킨 DPPH 용액 180 μl를 혼합하여 15분간 암실에서 반응시킨 후 microplate reader(BIO-TEK, USA)를 사용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도를 바탕으로 50%의 DPPH radical을 소거하는데 필요한 농도(SC50)를 계산하였다. Positive control로 ascorbic acid (vitamin C)를 사용하였다.
- 표준물질로 chlorogenic acid를 0~500 μg/ml의 농도로 제조하여 시료와 동일한 방법으로 표준 검량선을 작성하고 총 polyphenol 함량을 mg/g로 나타내었다.
- 이에 본 연구에서는 아직까지 보고된 바 없는 우엉의 미백 기능성과 관련된 활성이나 성분에 대한 연구를 위해 그동안 주로 식용으로 이용되어 왔던 우엉 뿌리의 methanol 추출물과 용매분획별 시료를 대상으로 실험을 진행하였다. 활성에 대한 연구로서 항산화활성과 피부 미백관련 기능성으로 tyrosinase 저해 활성을 조사하였으며, 활성 성분에 대한 정성 분석과 정량적 비교를 통한 활성과의 연관 관계 파악을 위해 액체크로마토그래피-질량분석기(LC-MS/MS)를 이용한 분석을 실시하였다.
대상 데이터
- 분석용 이동상으로서 JT Baker사의 LC grade 용매를 사용하였으며, 추출 및 분획에 사용된 용매는 동양제철화학에서 생산된 것을 이용하였다. Ascorbic acid, arbutin, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH), tyrosinase (mushroom), chlorogenic acid, rutin 등의 시약은 Sigma- Aldrich(USA)에서 구입한 것을 사용하였다.
- 기기 및 시약 − LC-MS/MS로서 Agilent Technology(USA)의 6410A triple quadrupole 질량분석기를 사용하였으며, 분석용 column은 GL science(Japan)의 Inertsil C8(4.6×150mm, 5 μm)을 사용하였다.
- 6×150mm, 5 μm)을 사용하였다. 분석용 이동상으로서 JT Baker사의 LC grade 용매를 사용하였으며, 추출 및 분획에 사용된 용매는 동양제철화학에서 생산된 것을 이용하였다. Ascorbic acid, arbutin, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH), tyrosinase (mushroom), chlorogenic acid, rutin 등의 시약은 Sigma- Aldrich(USA)에서 구입한 것을 사용하였다.
- 식물재료 −본 실험에 사용된 우엉 뿌리는 2013년 3월 경북 안동에서 구입한 것으로 수세 후 두께 1 cm 이하의 절편으로 하여 동결건조를 실시한 후 4°C 이하로 냉장보관하면서 실험에 사용하였으며, 표품은 동신대학교 생물자원산업화지원센터에 보관되어 있다.
이론/모형
- Tyrosinase 저해 활성 측정 − Tyrosinase의 작용 결과 생성되는 DOPA chrome을 비색법에 의해 측정하는 방법으로 tyrosinase 저해 활성을 측정하였다.
- 총 Polyphenol 함량 측정 − Folin-Denis법을 이용하여 우엉 뿌리 추출물 및 분획물 시료의 polyphenol 함량을 측정하였다.
성능/효과
- 2에 나타내었다. Chlorogenic acid는 n-butanol 분획물에서 가장 높은 함량을 가지는 것으로 나타났고 cynarin은 ethylacetate 분획물에 주로 존재하는 것으로 확인되었다. 이와 같은 함량은 Table III와 IV의 DPPH radical 소거능과 tyrosinase 저해활성에서 ethylacetate 분획물이 다른 시료에 비해 월등히 높은 수준의 활성을 나타낸 것과 관련성이 높은 것으로 판단되는데, chlorogenic acid의 함량보다는 cynarin 함량이 활성의 수준에 결정적인 영향을 미치는 것을 확인할 수 있었다.
- 추출물에서는 확인하기 어려웠던 저해 활성이 ethylacetate 분획물과 n-butanol 분획물에서 일정 수준 이상 확인되었다. Positive control로 사용된 arbutin의 활성과 비교하여 ethylacetate 분획물과 n-butanol 분획물의 저해 활성이 각각 14.33%와 4.90%에 해당하는 수준인 것으로 나타났다.
- DPPH Radical 소거능 −기존 연구에서 확인된 바 없었던 용매별 분획물을 포함한 우엉 뿌리 추출물 시료의 항산화 활성을 확인하기 위해 DPPH radiacl 소거능을 측정하여 Table III에 나타내었다. 농도별로 실시된 DPPH radical 소거능 결과를 바탕으로 50%의 DPPH radical을 소거하는데 필요한 시료의 농도를 산출한 SC50 값을 비교한 결과, ethylacetate 분획물의 소거능이 0.182 mg/ml로 가장 뛰어난 것으로 나타났으며, 다음으로 n-butanol 분획물의 SC50이 0.826mg/ml로 나타났다. 이와 같은 소거능을 positive control로 사용된 ascorbic acid의 SC50 값을 기준으로 비교한 결과, ethylacetate 분획물의 활성이 39.
- 1에 제시하였다. 본 연구에서 분석을 실시한 4가지 성분 중 chlorogenic acid와 cynarin이 존재함을 확인할 수 있었는데, 추출물 분석 결과를 기준으로 산출한 chlorogenic acid와 cynarin의 상대적인 검출량을 Fig. 2에 나타내었다. Chlorogenic acid는 n-butanol 분획물에서 가장 높은 함량을 가지는 것으로 나타났고 cynarin은 ethylacetate 분획물에 주로 존재하는 것으로 확인되었다.
- 2 g을 획득하였으며, 이중 20 g을 증류수에 분산시킨 후 n-hexane, ethylacetate, n-butanol을 사용하여 순차적으로 용매 분획을 실시하였다. 분획된 시료는 여과와 농축 및 동결건조 후 추출물과 함께 4oC 이하로 냉장보관하면서 실험에 사용하였으며, 최종 분획수율은 n-hexane, ethylacetate, n-butanol 및 aqueous 분획이 각각 1.54%, 2.89%, 7.56%, 88.01%로 나타났다.
- 826mg/ml로 나타났다. 이와 같은 소거능을 positive control로 사용된 ascorbic acid의 SC50 값을 기준으로 비교한 결과, ethylacetate 분획물의 활성이 39.01% 수준으로 상당히 높게 나타났고 n-butanol 분획물은 8.60% 수준으로 확인되었다. 한편, aqueous 분획물과 n-hexane 분획물의 소거능이 현저히 낮은 것으로 나타났으며, 추출물의 소거능보다도 낮은 수준이었다.
- Chlorogenic acid는 n-butanol 분획물에서 가장 높은 함량을 가지는 것으로 나타났고 cynarin은 ethylacetate 분획물에 주로 존재하는 것으로 확인되었다. 이와 같은 함량은 Table III와 IV의 DPPH radical 소거능과 tyrosinase 저해활성에서 ethylacetate 분획물이 다른 시료에 비해 월등히 높은 수준의 활성을 나타낸 것과 관련성이 높은 것으로 판단되는데, chlorogenic acid의 함량보다는 cynarin 함량이 활성의 수준에 결정적인 영향을 미치는 것을 확인할 수 있었다.
- 19-21) 우엉 뿌리 추출물 및 분획물 시료의 polyphenol과 flavonoid 함량을 측정한 결과를 Table II에 나타내었다. 추출물 중 polyphenol 함량이 14.93 mg/g으로 나타났고, 용매 분획별 시료에서 ethylacetate 분획물의 함량이 818.29 mg/g으로 다른 시료에 비해 월등히 높게 나타났으며, n-butanol 분획물의 함량은 203.18 mg/g으로 나타나 추출물 중 대부분의 polyphenol 성분이 두 가지 용매 분획물에 분리되어 나온 것으로 확인되었다. 특히, ethylacetate 분획물의 이와 같은 polyphenol 함량은 다른 생약재를 대상으로 한 기존의 연구들에서 나타난 결과들보다 월등히 높은 수준임을 알 수 있었다.
- 9,22) 본 연구에서는 지금까지 보고된 바 없는 우엉 뿌리 추출물 및 분획물의 tyrosinase 저해 활성을 조사하였으며, 측정한 결과는 Table IV에 나타내었다. 추출물에서는 확인하기 어려웠던 저해 활성이 ethylacetate 분획물과 n-butanol 분획물에서 일정 수준 이상 확인되었다. Positive control로 사용된 arbutin의 활성과 비교하여 ethylacetate 분획물과 n-butanol 분획물의 저해 활성이 각각 14.
- 18 mg/g으로 나타나 추출물 중 대부분의 polyphenol 성분이 두 가지 용매 분획물에 분리되어 나온 것으로 확인되었다. 특히, ethylacetate 분획물의 이와 같은 polyphenol 함량은 다른 생약재를 대상으로 한 기존의 연구들에서 나타난 결과들보다 월등히 높은 수준임을 알 수 있었다.12,13)
- 60% 수준으로 확인되었다. 한편, aqueous 분획물과 n-hexane 분획물의 소거능이 현저히 낮은 것으로 나타났으며, 추출물의 소거능보다도 낮은 수준이었다. 이와 같은 결과는 Table II의 phenolic compound와 flavonoid 함량 측정의 결과와 유사한 양상임을 확인할 수 있는데, 이는 DPPH radical 소거능이 phenolic compound의 함량과 밀접한 연관관계가 있음을 나타낸 것이라 할 수 있다.
- 한편, 기존의 연구들에서 우엉의 종자인 우방자에 존재하는 것으로 보고한 활성 성분인 actiin과 arctigenin8)을 LCMS/ MS로 동시에 분석을 실시한 결과에서 검출한계 미만으로 나타나 우엉의 뿌리 부위에는 존재하더라도 극미량일 것으로 판단되었다.
- 특히 미백 기능성과 관련하여 우엉 뿌리 부위의 추출물 및 분획물을 대상으로 한 tyrosinase 저해활성에 대한 연구 보고는 지금까지 없었던 것으로 관련된 연구의 기초 자료로서 활용될 수 있을 것으로 판단된다. 한편, 활성을 나타내는 성분에 대한 정보를 얻기 위해 기존 연구들을 바탕으로 LC-MS/MS를 이용한 성분분석을 실시한 결과에서 cynarin과 chlorogenic acid가 우엉 뿌리 부위에 존재하는 주요한 활성 성분임을 확인할 수 있었다. 특히, ethylacetate 분획물에 가장 많이 존재하는 것으로 확인된 cynarin이 본 연구에서 실시된 항산화 및 미백 관련 활성에 효과를 나타낸 것으로 판단됨에 따라 추가적인 연구를 통하여 관련성을 밝힐 필요가 있을 것이다.
- 본 연구에서는 우엉 뿌리의 생리활성 탐색을 위해 methanol 추출물과 용매별 분획물을 대상으로 polyphenol과 flavonoid 함량, DPPH radical 소거능과 tyrosinase 저해활성을 측정하였다. 활성 성분의 함량이나 활성 실험의 결과에서 우엉 추출물의 ethylacetate 분획물이 가장 우수한 것으로 나타났으며, n-butanol 분획물이 다음으로 높은 수준을 보여주었다. 특히 미백 기능성과 관련하여 우엉 뿌리 부위의 추출물 및 분획물을 대상으로 한 tyrosinase 저해활성에 대한 연구 보고는 지금까지 없었던 것으로 관련된 연구의 기초 자료로서 활용될 수 있을 것으로 판단된다.
후속연구
- 활성 성분의 함량이나 활성 실험의 결과에서 우엉 추출물의 ethylacetate 분획물이 가장 우수한 것으로 나타났으며, n-butanol 분획물이 다음으로 높은 수준을 보여주었다. 특히 미백 기능성과 관련하여 우엉 뿌리 부위의 추출물 및 분획물을 대상으로 한 tyrosinase 저해활성에 대한 연구 보고는 지금까지 없었던 것으로 관련된 연구의 기초 자료로서 활용될 수 있을 것으로 판단된다. 한편, 활성을 나타내는 성분에 대한 정보를 얻기 위해 기존 연구들을 바탕으로 LC-MS/MS를 이용한 성분분석을 실시한 결과에서 cynarin과 chlorogenic acid가 우엉 뿌리 부위에 존재하는 주요한 활성 성분임을 확인할 수 있었다.
- 한편, 활성을 나타내는 성분에 대한 정보를 얻기 위해 기존 연구들을 바탕으로 LC-MS/MS를 이용한 성분분석을 실시한 결과에서 cynarin과 chlorogenic acid가 우엉 뿌리 부위에 존재하는 주요한 활성 성분임을 확인할 수 있었다. 특히, ethylacetate 분획물에 가장 많이 존재하는 것으로 확인된 cynarin이 본 연구에서 실시된 항산화 및 미백 관련 활성에 효과를 나타낸 것으로 판단됨에 따라 추가적인 연구를 통하여 관련성을 밝힐 필요가 있을 것이다.
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