선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 본 연구에서는 국내 7개도 14개 시·군의 다양한 지역에서 고추의 이병 부위로부터 다양한 R. solanacearum 균주를 분리하였으며, 생리·생화학적 특성과 유전적 다양성에 따른 분류학적 특성의 결과를 보고하고자 한다.
제안 방법
- REP, ERIC, BOX-PCR 분석. Rep-PCR(REP, ERIC, Box primer)은 Louws 등(1994)의 방법에 따라 PCR을 수행하였다.
- 서광) 유묘를 이용하였으며, 풋마름병균의 농도는 멸균수에 현탁하여 108 cfu/ ml로 조절하였다. 각각의 현탁액을 묻힌 가위로 1주당 2장의 잎 끝을 절단하고 동시에 멸균된 칼로 뿌리에 상처를 낸 후 50 ml씩 관주하였다. 병원성의 정도는 1주 간격으로 4주 동안 조사하였으며, 발병 정도는 Winstea d와 Kelman(1952)의 방법에 따라 시들음 정도를 조사하였는데 1 = 무병징, 2 = 1개의 잎이 시들음, 3 = 2−3개의 잎이 시들음, 4 = 4개 이상의 잎이 시들음, 5 = 식물체 고사로 전체를 5단계로 하였다.
- 유전적 다양성. 국내 고추에서 분리한 풋마름병균들과 대조 균주를 포함한 총 67개 균주의 유전적 다양성은 repPCR(REP, ERIC, BOX primer)을 이용하여 분석하였다. 풋마름병균들은 3가지 PCR중 BOX-PCR에서 가장 높은 다형성 밴드를 나타냈다[Fig.
- Extension은 모두 65℃에서 8분으로 34회 반복하였으며, 최종 extension은 모두 65℃에서 15분간 반응시켰다. 균주간 유전적 유연관계는 Pyltool프로그램을 이용하여 전기영동의 다형성 밴드의 유무에 의해 만들어진 데이터 값을 입력한 후 UPGMA 옵션을 주어 분석 하였다.
- 25 U Taq polymerase(Promega)를 넣고 전체 부피가 50 µl 되게 하였다. 반응 조건으로 초기 DNA 변성은 94℃에서 4분간 반응시켰고, 이어지는 DNA 변성은 94℃에서 1분, annealing 은 ERIC은 50℃, REP은 44℃, BOX는 53℃에서 각각 1분씩하였다. Extension은 모두 65℃에서 8분으로 34회 반복하였으며, 최종 extension은 모두 65℃에서 15분간 반응시켰다.
- 병원성의 정도는 1주 간격으로 4주 동안 조사하였으며, 발병 정도는 Winstea d와 Kelman(1952)의 방법에 따라 시들음 정도를 조사하였는데 1 = 무병징, 2 = 1개의 잎이 시들음, 3 = 2−3개의 잎이 시들음, 4 = 4개 이상의 잎이 시들음, 5 = 식물체 고사로 전체를 5단계로 하였다.
- 병원성 검정. 분리된 균의 병원성 정도는 파종 후 4주된 고추(cv. 대왕)와 3주된 토마토(cv. 서광) 유묘를 이용하였으며, 풋마름병균의 농도는 멸균수에 현탁하여 108 cfu/ ml로 조절하였다. 각각의 현탁액을 묻힌 가위로 1주당 2장의 잎 끝을 절단하고 동시에 멸균된 칼로 뿌리에 상처를 낸 후 50 ml씩 관주하였다.
- 전국 7개도 14개 시 · 군의 주요 고추 재배지에서 시들음 증상을 나타내는 고추 식물체를 각 포장별로 채집하여 세균액 분출 여부(ooze test)에 의해서 병원균의 감염이 확인된 줄기의 이병 부위를 0.5 cm 간격으로 절단하여 70% ethanol로 수 초간 소독한 다음 1% 차아염소산나트륨(NaOCl)으로 2분간 표면소독하고 멸균 수로 3회 세척하였다.
- Denaturation은 94℃에서 5분간 반응 후 cycle에서 94℃ 1분, annealing은 60℃ 에서 30초, 합성은 72℃에서 1분으로 총 30회 반복하였으며, 최종 DNA 합성은 7분으로 하였다. 증폭된 PCR 산물은 1.5% agarose gel에서 전기영동 후 ethidium bromide 용액에 염색하여 UV la mp하에서 밴드 검출유무를 확인하였다.
- 고추에서 분리한 63개 균주와 4개의 대조 균주는 Schaad 등(2001)의 방법에 따라 배지상의 생장 특성, 그람 반응, 호기적 생장, 산화효소 생성, urease 생성유무, 운동성 유무, NaCl 내성, 과민성 반응 등의 세균학적 특성을 조사하였다. 편모의 관찰은 TTC와 운동성 조사 배지에서 16시간 배양시킨 세균을 멸균 증류수에 부드럽게 현탁시켜 grid에 옮긴 후 0.1% uranyl acetate로 염색하여 투과전자현미경 하에서 관찰하였다.
- 표면살균 된 조직을 1 ml의 멸균 증류수가 들어있는 effendorf tube에 넣고 소독된 칼로 작은 조각으로 절단하여 30분 정도 상온에 방치한 후 현탁액을 TTC(Kelman, 1954)와 SM-1 선택배지(Granada와 Sequeira, 1983)에 희석, 도말하여 30℃에서 48−72시간 배양하였으며, 전형적인 풋마름병균의 형태를 보이는 콜로니를 취하여 TTC 배지에서 2−3회 순수분리 하였다.
- 풋마름병원균은 108 cfu/ml(OD600nm=0.1)로 조절하여 10 µl씩 접종하였으며, 30oC로 조절된 배양기에 유지하면서 3, 7, 14, 21, 28일 간격으로 반응 정도를 조사하였다.
대상 데이터
- 표면살균 된 조직을 1 ml의 멸균 증류수가 들어있는 effendorf tube에 넣고 소독된 칼로 작은 조각으로 절단하여 30분 정도 상온에 방치한 후 현탁액을 TTC(Kelman, 1954)와 SM-1 선택배지(Granada와 Sequeira, 1983)에 희석, 도말하여 30℃에서 48−72시간 배양하였으며, 전형적인 풋마름병균의 형태를 보이는 콜로니를 취하여 TTC 배지에서 2−3회 순수분리 하였다. 대조 균주로는 R. solanacearum KACC10149, KACC10711, KACC10819, KACC10827을 한국농업미생물자원센터(Korean Agricultural Culture Collection, KACC)로부터 분양 받아 사용하였다[Table 1].
- 0% 이상의 Na Cl 농도에서 생장하는 균주는 없었다. 대조용으로 사용된 3균주(KACC149, KACC10819, KACC10827)를 제외한 모든 풋마름병균들은 질산염으로부터 공기를 생성하였다. 특이하게도 고추에서 분리한 63개 균주들 가운데 11개 균주(KPRS63, 64, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 79, 80, 84)는 운동성이 없었으나 대조 균주들과 나머지 고추 분리균은 모두 운동성이 있었다[Table 2].
- 고추에서 분리된 풋마름병균들은 질산염으로부터 공기 생성과 운동성 반응을 제외한 모든 세균학적 반응은 대조 균주들과 동일하였다. 모든 균주들은 TTC 배지에서 전형적인 R. solanacearum의 특성인 선분홍색이면서 우윳빛을 띤 유동성의 콜로니를 형성 하였다. 풋마름병균들은 호기적 생장, YDC 배지에서 점액성 콜로니 형성, urease 생성, oxidase 반응, 37℃ 생장, 질산염으로부터 아질산염으로의 환원반응 및 담배에 대한 과민성 반응은 양성이었으나 그람반응, KB 배지에서 형광 및 비형광색소 생성, D1M agar 배지상의 생장, 41℃ 생장 반응은 음성이었으며, 2.
- 전국 7개도 14개 시·군의 주요 고추 재배지에서 시들음 증상을 나타내는 식물체의 땅가 줄기에서 분리·선별된 63개 풋마름병균들의 특성을 조사하였다.
- 전국 7개도 14개 시·군의 주요 고추 재배지에서 풋마름 병징을 보였던 고추 식물체로부터 총 109개의 세균을 분리하였으며, 지역 및 포장의 특성을 고려하여 최종적으로 63개의 풋마름병균을 선별하였다.
이론/모형
- R. solanacearum의 genomic DNA는 TTC 배지에서 1−2일간 배양 후 멸균수에 현탁하여 농도를 5 × 108 cfu/ml로 조절 후 Chen과 Ronald(1999)의 방법으로 분리하였으며 동정은 Opina 등(1997)에 의해 보고된 R. solanacearum 특이 PCR primer set 759/760(5'-GTCGCCGTCAACTCACTTTCC-3', 5'-GTCGCCGTCAGCAATGCGGAATCG-3')을 사용하였다.
- REP, ERIC, BOX-PCR 분석. Rep-PCR(REP, ERIC, Box primer)은 Louws 등(1994)의 방법에 따라 PCR을 수행하였다. PCR 반응액은 10 mM Tris-HCl(pH 9.
- 생리형 검정. 고추 풋마름병원균의 생리형(biovar)은 Hayward(1964)의 방법에 따랐다. 기본배지(NH4H2PO4, 1.
- 세균학적 특성 조사. 고추에서 분리한 63개 균주와 4개의 대조 균주는 Schaad 등(2001)의 방법에 따라 배지상의 생장 특성, 그람 반응, 호기적 생장, 산화효소 생성, urease 생성유무, 운동성 유무, NaCl 내성, 과민성 반응 등의 세균학적 특성을 조사하였다. 편모의 관찰은 TTC와 운동성 조사 배지에서 16시간 배양시킨 세균을 멸균 증류수에 부드럽게 현탁시켜 grid에 옮긴 후 0.
성능/효과
- PCR 밴드의 다양성은 균주간의 유전적 다양성 정도가 높은 것을 암시한다. 3가지 primer를 종합하여 분석 후 70%의 유사도를 기준으로 보았을 때 국내 고추에서 분리된 풋마름병균들은 크게 12 group으로 구분되었다[Fig. 4]. Rep-PCR 분석을 통하여 각 그룹간의 biovar type과 분리 지역의 상관관계를 분석한 결과, biovar type별로는 특별히 구분할 수 있는 관계를 확인할 수 없었으며, 그룹간 분리 지역별로 일부 구분 되었지만 상관관계가 있다고 하기에는 미미한 정도였다.
- 생리형 분포. 4개 대조균들과 고추에서 분리된 63개 풋마름병균등의 생리형(biovar)을 조사한 결과, 대조 균주들은 biovar 1(KACC10149, KACC10827), 2(KACC10819), 3(KACC10711)으로 조사되었으며, 고추에서 분리한 풋마름병균들은 biovar 3과 4의 2가지 형태로 구분이 되었다. Biovar 3은 17개 균주(27%)였으나 biovar 4는 46개 균주 (73%)로 biovar 4가 우점계통이었다[Table 3].
- Biovar 3은 17개 균주(27%)였으나 biovar 4는 46개 균주 (73%)로 biovar 4가 우점계통이었다[Table 3]. Biovar 3으로 확인된 17개 균주(KPRS1, 2, 17, 41, 42, 43, 44, 56, 73, 75, 76, 78, 79, 80, 81, 82, 98)들은 경기(화성), 충남(공주, 서산, 청양, 태안), 충북(괴산, 음성, 청원), 전북(임실)의 다양한 지역에서 채집된 풋마름병균으로 지역간 특이적인 분포는 관찰되지 않았으나 대체로 중부지역에서 발생되는 것으로 조사되었다. 나머지 46개의 모든 풋마름 병균들은 질산염으로부터 공기를 생성하는 전형적인 biovar 4의 I형으로 확인되었다.
- 4]. Rep-PCR 분석을 통하여 각 그룹간의 biovar type과 분리 지역의 상관관계를 분석한 결과, biovar type별로는 특별히 구분할 수 있는 관계를 확인할 수 없었으며, 그룹간 분리 지역별로 일부 구분 되었지만 상관관계가 있다고 하기에는 미미한 정도였다. 특히 대조 균주인 KACC10149는 미국의 토마토에서 분리된 biovar 1로서 biovar 4인 국내 고추 분리균 KPRS4와 같은 유전적 유연관계를 가진 것으로 나타났으며, KPRS71은 다른 고추 분리균들과 원연적 유연관계를 보였다.
- 고추에서 분리된 63개 풋마름병균들은 race 1 계통으로 2가지 biovar로 구분되었는데, biovar 3은 17개 균주로 27%였고 biovar 4는 46개 의 균주로 73%였으며, biovar 4의 생리형이 우점계통이 었다. Rep-PCR에 의한 국내 고추 풋마름병균들의 유전적 다양성을 확인한 결과, 70%의 유사성을 기준으로 12개의 group으로 구분되었다. 이러한 결과들은 국내 고추 풋마름병에 대한 방제와 저항성 품종 육성에 중요한 기초 자료를 제공할 것이다.
- 결론적으로 본 연구에서는 다양한 지역의 고추 포장으로부터 분리된 63개 풋마름병균의 특성을 조사하였는데 세균학적 특성에 일부의 차이가 있었으며, 생리형은 biovar 3과 4에 속하였으며, rep-PCR에 의한 유전적 다양성은 분리 지역, biovar type에 따라 구분되지 않았지만 균주간의 고유한 DNA 다형성을 보여 국내 고추 풋마름병균은 다 양한 유전형이 분포하고 있는 것으로 사료되었다.
- 모든 병원균들은 배양적, 생리· 생화학적 특성 및 특이 PCR 검출에 의하여 Ralstonia solanacearum으로 동정되었다. 고추에서 분리된 63개 풋마름병균들은 race 1 계통으로 2가지 biovar로 구분되었는데, biovar 3은 17개 균주로 27%였고 biovar 4는 46개 의 균주로 73%였으며, biovar 4의 생리형이 우점계통이 었다. Rep-PCR에 의한 국내 고추 풋마름병균들의 유전적 다양성을 확인한 결과, 70%의 유사성을 기준으로 12개의 group으로 구분되었다.
- 병원성 조사. 고추에서 분리한 63개와 대조로 사용한 4개 풋마름병균을 대상으로 고추와 토마토에서 병원성을 검정한 결과, 고추에서는 3개의 대조 균주(KACC10149, 10819, 10827), 토마토에서는 2개의 대조 균주(KACC10149, 10819)를 제외한 모든 균주가 발병 정도 4와 5로 강한 병원성을 나타냈으며, 고추보다는 토마토에서 강한 병원성을 나타내는 균주가 많은 경향이었다[Table 4, Fig. 2]. 이러한 결과로 보아 국내 고추에서 발생되는 풋마름병균들은 세균학적 특성이나 생리형에 관계없이 강한 병원성을 가진 계통들로 기온이 높은 계절에는 노지와 비닐하우스의 고추 및 토마토 재배에 있어서 생산제한 요인으로 크게 작용할 것으로 생각된다.
- 모든 병원균들은 배양적, 생리· 생화학적 특성 및 특이 PCR 검출에 의하여 Ralstonia solanacearum으로 동정되었다.
- 그러나 Jeong 등(2007)에 의하면 국내 고추 풋마름병균은 모두 race 1이고 biovar 3과 4의 2계통이 분포하는데 biovar 4가 우점계통으로 다양한 지역에 분포하는 것으로 보고하였다. 본 연구에서도 기존의 보고와 유사한 결과가 확인되었지만 특이하게도 biovar 3 계통의 지역별 분포 비율이 높아지고 있어 발생지역이 확산되고 있는 것으로 추정되었다. 미국 남동부의 다양한 기주에서 분리된 풋마름병 중 고추 풋마름병균주는 모두 race 1의 biovar 3에 속한다고 하였다(Hong 등, 2012).
- 전국 7개도 14개 시·군의 주요 고추 재배지에서 풋마름 병징을 보였던 고추 식물체로부터 총 109개의 세균을 분리하였으며, 지역 및 포장의 특성을 고려하여 최종적으로 63개의 풋마름병균을 선별하였다. 선별된 균주들의 동정을 위하여 R. solanacearum을 특이적으로 검출할 수 있는 primer set(759/760)를 이용하여 PCR을 수행한 결과, 대조 균주를 포함한 모든 세균들은 281 bp의 특이 밴드를 형성하여 풋마름병균으로 동정되었다[Table 1].
- 2]. 이러한 결과로 보아 국내 고추에서 발생되는 풋마름병균들은 세균학적 특성이나 생리형에 관계없이 강한 병원성을 가진 계통들로 기온이 높은 계절에는 노지와 비닐하우스의 고추 및 토마토 재배에 있어서 생산제한 요인으로 크게 작용할 것으로 생각된다. 편모를 소유한 고추 풋마름 병균주와 무편모 균주와의 병원성은 인공 접종에 있어서는 뚜렷한 차이를 보이지 않았으나, 향후 자연상태의 조건을 부여하여 정밀실험에 의한 운동성 추적과 병원성과의 관계를 구명할 필요가 있다.
- 특이하게도 고추에서 분리한 63개 균주들 가운데 11개 균주(KPRS63, 64, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 79, 80, 84)는 운동성이 없었으나 대조 균주들과 나머지 고추 분리균은 모두 운동성이 있었다[Table 2]. 전자현미경을 이용하여 R. solanacearum 균주들의 편모를 관찰한 결과, 운동성을 보였던 모든 균주는 편모가 관찰되었으나 운동성을 보이지 않았던 11개 균주들은 모두 편모가 없는 것으로 조사되었다[Fig. 1]. 이러한 세균학적 특성으로 보아 국내 고추에서 발생되고 있는 풋마름병균들은 제한된 지역에서 일부의 균주가 생리·생화학적, 생태적 또는 유전적 다양성을 가진 계통으로 분화되고 있음을 추정할 수 있다.
- 대조용으로 사용된 3균주(KACC149, KACC10819, KACC10827)를 제외한 모든 풋마름병균들은 질산염으로부터 공기를 생성하였다. 특이하게도 고추에서 분리한 63개 균주들 가운데 11개 균주(KPRS63, 64, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 79, 80, 84)는 운동성이 없었으나 대조 균주들과 나머지 고추 분리균은 모두 운동성이 있었다[Table 2]. 전자현미경을 이용하여 R.
- Rep-PCR 분석을 통하여 각 그룹간의 biovar type과 분리 지역의 상관관계를 분석한 결과, biovar type별로는 특별히 구분할 수 있는 관계를 확인할 수 없었으며, 그룹간 분리 지역별로 일부 구분 되었지만 상관관계가 있다고 하기에는 미미한 정도였다. 특히 대조 균주인 KACC10149는 미국의 토마토에서 분리된 biovar 1로서 biovar 4인 국내 고추 분리균 KPRS4와 같은 유전적 유연관계를 가진 것으로 나타났으며, KPRS71은 다른 고추 분리균들과 원연적 유연관계를 보였다. RepPCR에서 국내에 분포하는 풋마름병균의 유전적 다양성의 결과는 풋마름병균의 분포지역이 넓고 유전적으로 분화속도가 빠르기 때문일 것으로 추정되었다.
- 풋마름병균들은 호기적 생장, YDC 배지에서 점액성 콜로니 형성, urease 생성, oxidase 반응, 37℃ 생장, 질산염으로부터 아질산염으로의 환원반응 및 담배에 대한 과민성 반응은 양성이었으나 그람반응, KB 배지에서 형광 및 비형광색소 생성, D1M agar 배지상의 생장, 41℃ 생장 반응은 음성이었으며, 2.0% 이상의 Na Cl 농도에서 생장하는 균주는 없었다.
후속연구
- Lim 등(2008)은 가지로부터 분리된 풋마름병균을 biovar 3과 4로 분류하였다. 위의 연구에서 고추 풋마름병균에 대한 세균학적 연구가 일부 수행되었으나 다양한 고추 재배단지로부터 많은 균주를 확보하여 국내 고추 풋마름병균의 생리, 생화학, 병원성 및 유전적 특성을 종합적으로 조사할 필요가 있다.
- Rep-PCR에 의한 국내 고추 풋마름병균들의 유전적 다양성을 확인한 결과, 70%의 유사성을 기준으로 12개의 group으로 구분되었다. 이러한 결과들은 국내 고추 풋마름병에 대한 방제와 저항성 품종 육성에 중요한 기초 자료를 제공할 것이다.
- 이러한 결과로 보아 국내 고추에서 발생되는 풋마름병균들은 세균학적 특성이나 생리형에 관계없이 강한 병원성을 가진 계통들로 기온이 높은 계절에는 노지와 비닐하우스의 고추 및 토마토 재배에 있어서 생산제한 요인으로 크게 작용할 것으로 생각된다. 편모를 소유한 고추 풋마름 병균주와 무편모 균주와의 병원성은 인공 접종에 있어서는 뚜렷한 차이를 보이지 않았으나, 향후 자연상태의 조건을 부여하여 정밀실험에 의한 운동성 추적과 병원성과의 관계를 구명할 필요가 있다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.